Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía

Resumen

Modelos de progresión de la enfermedad espontánea carcinoma metastásico de células renales (CCR) pueden ser utilizados para la evaluación de los tratamientos en un entorno clínicamente relevante. Este protocolo demuestra diferentes procedimientos para la implantación de células tumorales de riñón ortotópico, nefrectomía adecuado, y finalmente describe una guía para la necropsia de puntuación visual y bioluminiscente de carga metastásica y la localización.

Resumen

Uno de los retos clave para la mejora de las pruebas de nuevas terapias experimentales en el carcinoma de células renales (CCR) es el desarrollo de modelos que fielmente recapitula progresión de la enfermedad metastásica temprana y tardía etapa. Modelos típicos implantación del tumor utilizan la implantación del tumor primario ectópico o ortotópico, pero pocos incluyen la enfermedad metastásica espontánea sistémica que imita el entorno clínico. Este protocolo describe los pasos clave para el desarrollo de la progresión de la enfermedad RCC en escena similar a los pacientes. En primer lugar, se utiliza un ratón línea celular de tumor altamente metastásica en un modelo singénico para mostrar la implantación de células del tumor ortotópico. Los métodos incluyen la implantación superficial e interna en el espacio subcapsular con células combinadas con Matrigel para evitar fugas y la propagación temprana. Siguiente que describe los procedimientos para la escisión de portador de un tumor de riñón (nefrectomía), con cuidado de ratón pre-y post-quirúrgico crítico. Por último, se describen los pasos necesarios para controlar y evaluarmicro y macro-evolución de la enfermedad metastásica, incluyendo imágenes bioluminiscentes, así proporciona una guía visual necropsia detallada para anotar distribución de la enfermedad sistémica. El objetivo de esta descripción del protocolo es facilitar el uso generalizado de los modelos CCR metastásico clínicamente relevantes para mejorar el valor predictivo de la futura prueba terapéutica.

Introducción

La causa principal de mortalidad en pacientes con carcinoma de células renales (RCC) es la enfermedad metastásica sistémica que se produce normalmente después de la extracción quirúrgica de un tumor primario de crecimiento en el riñón. Sin embargo, muy pocos modelos tumorales preclínicos que evaluaron terapéutica experimental en ratones incluyen la enfermedad metastásica, y menos aún recapitulan fielmente las etapas clínicas de crecimiento localizado, la cirugía, y el inicio de micro-metástasis espontánea y progresión ^1-3. Esta brecha en la prueba se ha convertido cada vez más importante en la evaluación de nuevas terapias como a veces sorprendentes efecto....

Protocolo

1. Ortotópico tumor de riñón Implantación

1. Cultivo Celular
   1. Antes de la implantación ortotópica, crecer células de ratón RENCA ^LUC como una monocapa a 75% de confluencia.
   2. Después de tripsinización y resuspensión en 5% de FBS que contiene los medios de comunicación, centrifugar las células a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min, repetir 3 veces para lavar en PBS. A continuación, volver a suspender las células en medio libre de suero a una concentración de 5 x 10 ⁴ RENCA ^LUC / 5 medios libres de suero l.
      Nota: En función de la variante o línea celular utilizada, las células pueden ser resuspendidas en una....

Resultados

Figura 1A muestra un esquema delineando los procedimientos detallados en este resumen de protocolo. Varios factores importantes deben ser considerados para cada paso. Por ejemplo, en el paso 1 se muestran dos métodos para la sub-capsular implantación de células tumorales en el riñón. Las células tumorales se pueden implantar en el espacio subcapsular con un pequeño blanco-burbuja de confirmar la colocación localizada de células con fugas impedido por la eliminación cuidadosa de la aguja y limpiando el e.......

Discusión

El propósito de este protocolo es para evaluar la enfermedad metastásica espontánea clínicamente relevante utilizando un modelo de ratón del tumor singénico para describir las técnicas de implantación / resección. Actualmente, la mayoría de los estudios preclínicos evaluación de nuevas terapias experimentales no incluyen el estudio de la enfermedad metastásica y sólo unos pocos recapitular las etapas de crecimiento del tumor primario, la resección quirúrgica, y la eventual diseminación metastásica espontánea. Hasta la f.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM-glucosa alta con Pyr. Y L-Glutamina	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Tripsina EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS sin Calcio & Magnesio	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	deben mantenerse en hielo
Ungüento oftálmico lubricante artifical para lágrimas	Akorn Animal Health	17478-162-35
Recortadora de mascotas Pocket pro	Braintree scientific	CLP9931B
Hisopo con alcohol	VWR	326895
Betadine	VWR	67618-152-01
MICRO DISECTING sissoras rectas, romas - cuchillas de 25 mm - 4,5"	Pinzas de iris quirúrgicas Southpointe	RS-5982
dentadas, curvas, de 10 cm de largo	Kent scientific	INS15915	necesitan dos de estas
10 µ l Jeringa Hamilton	Hamilton	7635-01
30 G, 45 grados, aguja RN	Hamilton	7803-07
Aplicador estéril con punta de algodón	VWR	10805-144
Kit de cauterización a alta temperatura	Kent scientific	INS500392
5-0 Vicryl recubierto, aguja de corte convencional	Ethicon	J834
Aplicador de pinzas Reflex para pinzas de 7 mm	Kent scientific	INS500343
Pinzas Reflex, 7 mm, no estériles	Kent scientific	INS500344
Pinzas de extracción, 12 cm de largo	Kent scientific	INS500347
0,9% Cloruro de sodio	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorfina 0,01 mg/ml
Aguja de 25 G 5/8"	VWR	BD305122
jeringa de 1 ml sin aguja	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G

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