Summary
Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.
Abstract
Cilt son derece heterojen bir dokudur. Intra-dermal yapılar saç folikülleri, arrector pili kasları, (örneğin Merkel hücre kümeleri gibi) epidermal uzmanlık, yağ bezleri, sinirler ve sinir uçları ve kılcal damarları içerir. Bu yapıların mekansal düzenlemesi sıkı bir mikroskopik ölçekte kontrol edilir - görüldüğü gibi, örneğin, tek bir saç folikülü içinde hücre türlerine düzenli düzenlemede - ve bir makroskopik ölçekte - saç binlerce hemen hemen aynı yönelimleri tarafından görülen cildin yerel bir bölge içinde folikül. Fiziksel olarak cilt kesit olmadan bu yapıların görselleştirme için bu organın 2 boyutlu geometri mümkündür. Bu protokol, biz fare deri, disseke sabit, geçirgenleştirildi, lekeli ve bozulmamış bir iki boyutlu nesnenin, düz bir montaj olarak açıklığa kavuşturulması olduğunu göstermektedir. Protokol opt derinin geniş alanlarda tam kalınlığı boyunca kendi bütünlüğü içinde cilt yapıların kolay görselleştirme sağlarnik bölümleme ve yeniden yapılanma. Bu yapıların görüntüler de vücut eksene konumu ve oryantasyonu ile ilgili bilgi ile entegre edilebilir.
Introduction
Cilt somato-duyu, izolasyon / termoregülasyonu ve bağışıklık savunma 1. önemli fonksiyonları ile vücudun en büyük organ biridir. Cilt gelişimi ve işlevi moleküler ve hücresel temelini anlama nedeniyle biyolojik sistem ve dermatoloji alaka olarak derinin temel öneme uzun süredir devam eden bir ilgi olmuştur. Memeli Cilt keratinositleri tabakalı katmanları, deri, bağ dokusu, saç köklerinin çeşitli, yağ bezleri, arrector pili kaslar, kan damarları ve afferent en azından bir düzine farklı sınıflarına (duyusal) sinir ve efferent de dahil olmak üzere çok-yapılar, çeşitli içerir elyaf (Şekil 1). Vücudun farklı bölgelerinde cilt karakteristik farklı tipleri ile ilişkilidir. En Memelilerde, neredeyse tüm vücut yüzeyi yoğun saç köklerinin ile doludur deri ile kaplıdır. [İnsanlar ve çıplak körfareler inci istisnalarıkalıptır.] Saç da özel epidermal desenleri (dermatoglyphs), ekzokrin bezleri ve duyu sinir uçları ile ilişkili ellerde ve ayaklarda, palmar yüzeylerinin eksik. Büyümesi, farklılaşması ve saç folikülü içindeki hücrelerin uzaysal düzenleme kontrolü hücresel ve moleküler olaylar organogenez 2'nin merkezi özelliklerinin çoğu, minyatür, her bir folikül sergiler gibi özel ilgi çekmektedir. Bu özellikler, kök hücrelerin varlığını ve bir kök hücre niş, tam hücre koreografisini geçişler ve embriyolojik ayrı bileşenlerden çok hücreli yapıların montaj dahil.
Bu makalede, kesme için yöntemleri açıklar, sabitleme, etiketleme, ve sağlam bir iki boyutlu levha gibi görüntüleme fare deri, bir "bütün montaj" ya da "düzlem monte" hazırlık olarak anılacaktır. Fare derisi nispeten ince olduğu için, düzleştirilmiş kayak tam kalınlığı boyunca görüntü mümkündürn geleneksel konfokal mikroskopi kullanılarak. Bu yapılar bu şekilde optik olarak kısımlara ayırma suretiyle tamamen yeniden inşa edilmesi için izin fiziksel kesit için ihtiyaç atlar için, memeli bir cilt görüntüleme için düz montaj yaklaşım teknik avantajlıdır. Neredeyse tüm cilt tek bir nesne olarak işlendiği için, yassı gövde eksene konumu ve oryantasyonu ile ilgili bilgileri korurken yaklaşım aynı zamanda vücut yüzeyinin birden çok bölgelerin görüntüleme kolaylaştırır monte edin. Son olarak, deri içinde yapılar tipik haliyle, böylece, belirli bir yapıda birden fazla temsilcileri görüntülerin toplanmasını kolaylaştıran, düzenli aralıklarla tekrar edilir desen bulunmaktadır. Bu özellikler, retina, nöronal morfoloji 3 çalışmaları için benzer avantajlara sahiptir, merkezi sinir sistemi, iki boyutlu bir parçası üzerinde çalışmak neurobiologists aşinadır.
Burada anlatılan düz monte yaklaşım özel utilit olduğunucilt iki boyutlu bir düzlem içinde nispeten büyük ölçekli mekansal organizasyon sergileyen yapıları incelemek için y. Merkel hücresi kümeleri, arrector pili kaslarının, yağ bezleri ve sinir uçları 4 - Büyük ölçekli mekansal organizasyon bir örnek saç köklerinin ve saç folikülü ilişkili yapıların koordineli kutupluluktur. Saç foliküllerinin cilt düzlemi ile ilgili olarak, ve cilt 2 boyutlu bir düzlem içinde yer folikül vektörünün bileşeni ile bir açı ile yönlendirilir, genel olarak her biri için tam olarak belirlenmiş olan vücut eksene göre bir oryantasyon sergilemektedir vücut üzerindeki konumu. Örneğin, rostral gelen geri noktasında saç folikülleri kaudal ve ayak dorsal yüzeyi saç distal proksimal gelen işaret. Saç folikülü yönlendirme düzlemsel hücre kutup sinyallemesi tarafından kontrol edilir (PCP, ayrıca adı doku polarite 5). Bu sinyalizasyon sistemi Drosophila keşfedilmiştir burada küçük birÇekirdek PCP gen grubu cuticular saç ve kılların yönünü kontrol etmek için bulunmuştur. EGF yedi-pass G-reseptörü tip 1 (Celsr1) ve vang benzeri 2 (Vangl2) LAG cadherin frizzled homolog 6 (ayrıca FZ6 olarak anılacaktır Fzd6,) -, - PCP çekirdek genlerinin üç memeli orthologues memeli de benzer bir rol oynar cilt, vücut eksenleri ile saç köklerinin yönelimleri koordine. PCP sinyal yokluğunda birincil kusur köklerinin iç yapısı üzerinde herhangi bir etki ile, saç folikülü yönelimin bir başlangıç rasgele ya da düzensizlik olduğunu göstermektedir FZ6 knockout farelerde (- / - bundan sonra FZ6 olarak adlandırılan Fzd6 tm1Nat) Çalışmaları 6-8. Ikinci bir non-PCP sistemi, kıvrımları ve püskül gibi büyük ölçekli saç kalıplarının üretimine yol açan at köklerinin, yerel hizalama temin etmek için, daha sonra hareket eder.
Büyük ölçekli bir ikinci örneğicilt içinde mekansal organizasyon duyusal akson milleri morfolojilerinde görülür. Cildi canlandıran duyusal nöronlar dorsal kök ve trigeminal ganglionlarda hücre organları var. Bu nöronlar, sıcaklık, ağrı, kaşıntı ve deri ve saç üzerine çarpan 9 mekanik deformasyonlar çeşitli algılar. Bunlar, akson çap ve iletim hızı, sinir ucu uç yapısı ve reseptörleri, kanalları ve diğer moleküllerin ifade duruma göre, alt tiplere ayrılabilir. Çünkü cilt içinde innervasyon yüksek yoğunluklu, yani (tek hücre tipi bir flüoresan raportör ekspresyonu ile işaretlenir zaman olduğu gibi) her aksonlar (örneğin, anti-sinir lifi immün) ya da bir tek sınıfın hatta tüm aksonlar görselleştirme içeren analiz genellikle imkansız bir bireyin çardak morfolojisini tanımlamak için yapar akson yoğun bir süperpozisyon ortaya koymaktadır. Bu sorunu aşmak için, biz son derece seyrek genetik-yönettiği l kullanmışabeling tek tek iyi izole edilmiş akson milleri bir histokimyasal muhabir, insan plasental alkali fosfataz 10 ekspresyonu ile görüntülenmiştir edildiği dorsal deri örneklerini üretmek için. Bu yaklaşım, bireysel akson çardak morfolojilerin kesin görselleştirme ve morfolojik kriterlere dayalı somatosensori nöron türlerinin bir tanımını verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerilerine sıkı göre gerçekleştirilmiştir. Bütün hayvanlar onaylanmış kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi Johns Hopkins Tıp Kurumları (IACUC) protokolü MO11M29 göre ele alınmıştır. Ötenazi onaylı yöntemleri için yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına danışın. Aldehit fiksatif veya organik çözücüler tutarken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın.
Malzemeler 1. Hazırlanması
- Sylgard Plates Dökme
- , Üreticinin talimatlarına uyun tabanı ile sertleştirme ajanı karıştırın ve bir plastik çubuk ile karıştırın.
- Pipet ~ 35 ml sıvı Slygard 10 cm çaplı doku kültürü çanak başına. Doku kültürü yemekleri standart bakteriyel yemekleri daha derin; Bu böcek iğneleri için dikey açıklık sağlar.
- Di yerleştiringece boyunca oda sıcaklığında yatay bir yüzey üzerine o kız. Karıştırma sırasında oluşan kabarcıklar kaybolacaktır.
- Polimerizasyon sonra, oda sıcaklığında Sylgard plakaları saklayın.
Not: Sylgard plakadan ayrılana kadar Sylgard plakalar çok kez yıl boyunca oda sıcaklığında depolanır ve yeniden kullanılabilir.
- Çözümler
- Benzil benzoat ve benzil alkol (BBBA). 2 hacim benzil benzoat ve 1 hacim benzil alkol karıştırın. , Bir cam stoper veya Teflon üst bir cam şişe karanlıkta saklayın.
DİKKAT: BBBA Kullanılmış uygun organik çözücü atık olarak ele alınmalıdır. BBBA plastik temas etmesine izin vermeyin. - Fosfat tuzlu su (PBS). 80 ml su ile 4 g PFA ekleyin, 70 ° C ~ 5 dakika boyunca PFA tamamen eriyene kadar ~ sıcak bir plaka üzerinde karıştırılmıştır, 0.1 ml 1 N NaOH ekleyin ve daha sonra 10 ml 10x PBS ekleyin ve 100 için ses getirmek ml su ile.
DİKKAT: formaldehit / PFA ve BBBA buharlarının solunması olmalıdırkapalı kaplarda bu çözümleri tutarak minimize. Formaldehit / PFA bir kanserojendir. - Oil Red O. izopropanol içinde% 0.5 'lik stok hazırlayın. Kullanımdan hemen önce% 0.3, Yağlı Kırmızı O nihai bir konsantrasyona kadar su ile seyreltilir, ve daha sonra bir 0.2 mikron filtre içinden geçirilerek filtre edilmektedir.
- Benzil benzoat ve benzil alkol (BBBA). 2 hacim benzil benzoat ve 1 hacim benzil alkol karıştırın. , Bir cam stoper veya Teflon üst bir cam şişe karanlıkta saklayın.
2.. Cilt Diseksiyon, Fiksasyon ve Takas
- Immünolekeleme Melanin Görüntüleme için Cilt Dorsal
- Çok genç farelerde (örn., fetus ve doğum günü (P) 0-P3 yavrular) için, izofluran inhalasyon yoluyla fareler euthanize. Izofluran inhalasyonu veya servikal dislokasyon ketamin / ksilizin enjeksiyonu ile yaşlı fareler Euthanize.
- Elektrikli tıraş ve epilasyon jel ile saç kaldırmak. P8 daha genç fareler için, bu adım atlanabilir.
- Kulak ve sonuna kadar yanal olarak devam edilmesi, her bir kol tabanının geçen sırt tarafında, her bir kanat boyunca kuyruk tabanından yatay kesim yapmak için bir tıraş bıçağı kullanmaburunda ing.
- Hafifçe forseps takılmamasına böylece eldivenli parmakları arasındaki deri tutarak anterior posterior altta yatan doku ilerlemesini cilt soyma. Kulak seviyesinde cilt soyulması, önce bir makas ile kulakları kesilir ve deri bu konumda yırtılabilir özellikle yavaş yavaş devam edin.
- Bu noktadan itibaren, yukarı bakacak içiyle cildi yönlendirin. ~ 20 böcek pimleri eşit çevresi etrafında çevresel olarak aralıklı olan Sylgard için cildi Pin; cilt (Şekil 2B) üzerinden streç yoktur. PBS 10-20 ml ile cildinizi örtün.
- Forseps cilde nüfuz edecek riskini en aza indirmek için yatay şekilde forseps sivri ucu açılı veya kavisli bir forseps kullanarak cilt ilişkili yağ ve bağ dokusu uzak teşrih. Nazikçe cilt yüzey üzerinde bir pamuk uçlu bir aplikatör haddeleme ile cilt altında sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıklarını a'ya.
NOT: Cilt gidiyorsaDüz montaj Immün veya histokimyası için kullanılmak üzere, mümkün olduğunca bağ dokusu kadar kaldırın; ciltteki melanin pigmentasyonu göre saç folikülleri görselleştirmek için kullanılan olacak eğer, bağ dokusu daha az tam olarak çıkarılması tatmin edicidir. Prenatal cilt yapışık bağ dokusu minimal "temizlik" gerektirir. - Sylgard 10 cm plaka başına 20 taze hazırlanmış% 4 PFA / PBS ml veya% 10 tamponlu formalin ekleyerek tutturulmuş deri saptamak veya taze hazırlanmış 20 ml (deri melanin görüntüleme veya alkalin fosfataz (AP) histokimya için kullanılacak ise) % 2 PFA / PBS (cilt immünoboyamayla veya görselleştirme transgenik Keratin (Krt) 17-GFP 11 için kullanılacak ise), ve yavaşça bir gece soğuk bir odada döndürmek. Ertesi gün,> 10 dakika boyunca PBS içinde yıkayın.
NOT: Standart formalin% 37 formaldehit olup; bu nedenle, "% 10 formalin"% 3.7 formaldehit olduğu. - AP boyama ve immün için, Bölüm 3'te devam ediyor. Melanin imag içining, oda sıcaklığında nazik bir yatay rotasyon ile sınıflandırılmış etanol serileri ile cilt (% 70,% 95,% 100), her bir aşama için bir gün, kurutmak. Kalan bağ dokuları çıkarın.
- % 100 etanol içinde deri ile, böcek iğneleri kaldırmak ve, arzu edildiği takdirde, pim delikli cildin en çevresel 1-2 mm kaldırmak için bir makas ile cilt kesin.
- , 10 cm çapında bir cam tabak içine deri transfer kıvrılmasını engellemek için cilt üzerinde iki cam mikroskop slayt yerleştirin ve BBBA 20 ml ekleyin. Cilt BBBA eklemeden önce cam slaytların ağırlığı altında basık olması için önemlidir bu yüzden BBBA hızla doku sertleşir.
- Bir sonraki birkaç saat içinde, BBBA cilt üzerinde yıkama sağlamak için bir kaç saniye için kaplama kapalı slaytlar kaldırın.
NOT: BBBA ile çalışırken eldiven giyin. Cilt yaşı ve bulunduğu yere bağlı olarak BBBA olarak yaklaşık 30% büzülme olabilir.
- Saç Folikül Patte ve Analiz için ayak Ciltrning
NOT: Genellikle incelenen yaş aralığı P1-P8.- Ötenazi sonra, ayak bileği eklemi üzerinde kesti ve ayak tabanları ile ventral yüzeyi boyunca bir tek düz kesim yapmak.
- Yavaşça distal yöne bir proksimal işlem, temel dokudan deri soyma.
- Cildi serbest ve iç yüzey (Şekil 2C) yukarı bakacak şekilde sylgard iğnelemekle basamak kesin. Ayak deride minimal bağ dokusu vardır.
- Transgenik Krt17-GFP cilt şimdi görüntüleme için hazırdır. Bölüm 2.1 'de açıklandığı gibi melanin görüntüleme için fiksasyon, dehidratasyon ve BBBA temizleme ile devam edin.
- Görselleştirme Yağ bezleri için ayak Cilt
- Ötenazi sonra, eldivenli parmak ve başparmak ile cilt yüzeyi üzerinde saç çıkarıcı jel sürtünme tarafından saç kaldırmak; 10 dakika boyunca bekleyin.
NOT: narin ayak cilde zarar edecek, bir elektrikli tıraş makinesi kullanmayın. - W, musluk suyu ile cilt yüzeyini kül incelemek ve bölüm 2.2 'de açıklandığı gibi Sylgard cildi pin.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca,% 1 PFA / PBS ile düzeltmek ve daha sonra PBS içinde yıkayın.
NOT: Bu ilk saç döngüsü 12 sırasında saç pigmentasyon dip noktası ve bu nedenle yağ bezleri, çünkü doğum sonrası ilk hafta sonra gelişir ayakları üzerinde yağ bezleri görüntülenmesi için, Oil Red O ile analiz için uygun yaş, P21 olduğunu daha kolay görülebilir. Albino fareler ile bu analiz her yaşta yapılabilir. Bu tür c-2J C57BL/6J-Tyr olarak tirozinaz mutant hattına albino döl çapraz pigmentli mutant fareler elde etmek.
- Ötenazi sonra, eldivenli parmak ve başparmak ile cilt yüzeyi üzerinde saç çıkarıcı jel sürtünme tarafından saç kaldırmak; 10 dakika boyunca bekleyin.
- Melanin Dağıtım Analizi, Saç Folikül Oryantasyon ve Yağ Bezi Görselleştirme için kuyruk Cilt Hazırlığı
- Ötenaziden sonra, kuyruk tabanından etrafında dairesel bir kesme ve sonra da ventral yüzü boyunca kuyruk uzunluğu boyunca uzanan, uzunlamasına bir yarık olun. <li> sıkıca kuyruk-, kemik ve / veya bir forseps çift ve forseps bir ikinci çift ile deri ile bağ dokusu ucu kavrayarak ucundaki başlayarak kuyruk deri soyun. Sylgard kuyruk cildi pin.
- Melanin dağılımı ve saç folikülü yönelim analizi için, düzeltmek ve bölüm 2.1 'de açıklandığı gibi cildi işlemek. Yağ bezlerinin analizi için, segment bir dizi içine kuyruk deri kesme ~ 0,5-1 önce tespit için cm uzunluğunda ve dermis-epidermis yapışma 13 zayıflatma 37 ° C'de gece boyunca PBS / 5 mM EDTA içinde deri parçaları inkübe edin.
- Yavaşça, dermis epidermis soyma Sylgard (iç yüzü yukarı) epidermis pin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 4 PFA / PBS bunu düzeltmek. PBS ile yıkayın ve aşağıda tarif edildiği gibi, Oil Red O ile leke.
NOT: Bir elektrikli tıraş makinesi ve / veya saç temizleme jel önce büyük kuyruk deri (örn., P21) kesme için kullanılabilir, ancak kuyruk saç olmadığı için bu işlem isteğe bağlıdırvücudun başka bir yerde gibi yoğun.
3.. Boyama Tepkiler
- İnsan Plasental Alkalen Fosfataz (AP) Histokimyas Visualize'a Akson milleri 10,14,15 Genetiği-etiketli (Şekil 3A, B)
- Sylgard üzerinde PFA tespit sonra, 10 cm cam tabak içinde sabit derileri koyun ve PBS / 1 mM MgCl2 altında daldırın. Yavaşça endojen fosfataz etkinliğini yok etmek için 90 dakika boyunca 70 ° C 'de bir su banyosunda çanağı.
- Tipik olarak 10-15 kullanılarak 0.1 M Tris, pH 9.5, 0.1 M NaCI, 50 mM MgCI2, 0.34 ug / ml NBT ve 0.175 ug / ml BCIP içinde oda sıcaklığında 4-48 saat bir kuluçkalama ile histokimyasal AP raportör etkinliği görselleştirme P21 dorsal deri başına boyama çözeltisi ilave edildi. Nonspesifik NBT birikimi akson boyama bağıl yoğunluk görsel inceleme ile karar gibi, en uygun zamanın ötesine devam bırakmamaya özen, mikroskop altında reaksiyonu izleyin. Üç 1 saat boyunca PBS/0.1% Tween-20 arasında değişiklik, Sylgard yeniden pin derileri, bir etanol dizi derileri kurutmak ve daha sonra bir 10 cm tabak için derileri transferi ile yıkanarak reaksiyonu durdurun BBBA.
Not: BBBA yavaşça NBT çökelti çözülür. BBBA yılında ilk birkaç saat boyunca, çöktürülmüş nbt ince bir arka plan eriyecektir; Sonuç olarak, BBBA çözüm karartmak ve cilt hafifletmek olacaktır. Bir kaç saat sonra taze BBBA değiştirin. - AP-lekeli cilt görüntüleme sonra, oda sıcaklığında> 1 saat boyunca etanol transfer etme ve daha sonra -20 ° C de taze etanol saklayın AP-lekeli derileri sinyal kaybı ile aylarca bu şekilde saklanabilir.
- Oil Red O boyama Sebasöz Bezler 4 (Şekil 3C-F) Visualize'a
- Böcek pimlerini ile, bir 6-yuvalı doku kültürü plakasının oyuklarına Sylgard plakadan hafifçe sabit ayak ya da kuyruk derileri aktarmakKuyunun başına iki cilt örneklerinde kadar. 60:40, izopropanol ile yıkanır: su içinde, oda sıcaklığında 5 dakika karıştırıldı.
- Su (bkz. Bölüm 1.2) 2 saat boyunca oda sıcaklığında: 60:40 izopropanol içinde 2 ml% 0.3, Yağlı Kırmızı O Leke.
- 60:40, izopropanol ile yıkanır: su bir su yıkaması ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca. Cilt yüzeyi mümkün olduğu kadar düz yapılabilir, böylece dikkatle ince makas ile iğne delikleri gibi cilt kenarları, kırpılmış.
- , Bir su birkaç damla veya sulu montaj orta eklediğiniz bir lamel ile cilt kapağı, ve sonra yavaşça ileri cildi düzleştirmek için slayt lamel bant, dış yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir slayt üzerinde cilt yerleştirin.
- Düz Dağı İmmünoboyama 4,16,17 (Şekil 3G, H)
- Asimetrik bir kesim (örneğin, ön sağ köşesine klip) ile yönlendirme işareti, PFA sabit deri (ör. 1 cm x 0.5 cm) boyutlarında bir dikdörtgen kesin. Inkübasyon ve gerçekleştirBir dönen yatay bir platform üzerine nazik rotasyonlu adımları yıkayın. Bir 6 kuyu olarak - ya da 12 oyuklu doku kültürü plakası, kalıntı PFA çıkarmak için PBS ile birkaç kez yıkayın, önceki 5-8 saat boyunca% 0.3 Triton X-100 (% 0.3 PBST) ile PBS ~ 10 değişiklik ile yıkayın cilt permeabilize oda sıcaklığı.
- Oda sıcaklığında beş gün süre ile% 5 keçi serumu ve% 20 DMSO ile% 0.3 PBST içinde primer antikor ile inkübe edin. Açık bir bant ya da buharlaşma yoluyla kaybını ortadan kaldırmak için yapışkan plastik plakanın kuyularının örtün.
- 5-8 saat boyunca% 0.3 PBST 10-15 değişiklikler ile yıkanır ve oda sıcaklığında 3 gün boyunca% 5 keçi serumu ve% 20 DMSO ile% 0.3 PBST içinde sekonder antikor ile inkübe edin.
- 5-8 saat boyunca% 0.3 PBST 10-15 değişiklikler ile yıkayın.
- 5 dakika, 20 dakika her biri için her bir ve daha sonra 3x 100% metanol% 25,% 50 ve% 75 metanol içinde kurutmak.
- Gece boyunca oda sıcaklığında BBBA Temizle.
NOT: Düz daha genç bir cilt bağışıklık boyamasım montaj~ P1 yukarıda tarif edildiği gibi, ancak daha kısa bir inkübasyon ile gerçekleştirildi ve kez yıkayın edilebilir. Örneğin, P1 deri birincil antikor olarak bir gece boyunca inkübasyon ve ikincil antikor olarak bir kaç saatlik bir kuluçka ile boyanmış ve% 0.3 PBST içinde sadece 2-3 saat arasında ara yıkamalar ile yapılan edilebilir. Yukarıda da belirtildiği gibi, küçük deri aynı zamanda BBBA temizleme olmadan görüntülenebilir yeterince incedir.
- Floresan Sinir Terminal Boya Alımı ile Merkel Hücresi Kümeleri görselleştirme (3H-L Rakamlar)
AMI-43 (yeşil) ve AM4-65 (kırmızı), seçici olmayan bir katyon kanalı 18 üzerinden hücrelere girmek tamir edilebilir floresan boyalardır. Canlı deride bu boyalar, seçici bir şekilde alınır ve Merkel hücreleri içinde konsantre edildi.- -80 ° C 'de parçalar halinde 1 mg AM1-43 ya da AM4-65 2 ml PBS içinde çözülür ve mağaza
- Bir 29 G iğne kullanılarak gram vücut ağırlığı için 2-10 ug boya ile deri altından doğan yavrular enjekte edilir.
- Bir gün sonra, fareler ve Disse euthanizedorsal derileri ct.
- , Bir gece boyunca 4 ° C 'de% 4 PFA / PBS içinde derileri saptamak PBS ile yıkayın ve Bölüm 3.2' de tarif edildiği gibi deri monte edin.
4.. Görüntüleme ve Görüntü Analizi
- Görüntüleme Saç Folikül Oryantasyon (Şekil 4)
- , BBBA batık bir cam slayt altında basık, ve hala cam tabak içinde olan resim sırt, ayak, kuyruk veya derileri için bir diseksiyon mikroskobu kullanın - bu yaklaşım mikroskop BBBA kirlenmesini en aza indirir.
- Aşağıdan çanak aydınlatın. , Görüş alanında genelinde ışık yoğunluğunun uzaysal değişimini en aza indirmek 10 cm mikroskobun standart çalışma yüzeyinin üzerinde ~ yüksekliğe cam tabak yükseltmek ve ışık kaynağı üzerinde bir difüzyon plastik veya cam plaka yerleştirin.
- -20 ° C'de uzun süreli depolama için% 100 etanol cildi dön
NOT: daha bir gün için BBBA de cildi bırakmak melanin granülleri kırmak için neden birbölüm. Cilt BBBA tedavi edildikten sonra sertleşmesine ve ileriye o noktadan itibaren düz kalacak. Onlar dondurucu yer kazanmak için, birlikte saklayabilirsiniz böylece farklı derileri, onların ön ve / veya arka ucunda çentikler bir dizi ile kodlanmış olabilir.
- Görüntüleme ve Takip Akson milleri (Şekil 3A, B)
- Küçük protein jeller için kullanılan tipte iki cam levha arasında AP boyanmış deri (bölüm 3.1.3) yerleştirin. Plakalar ve deri arasındaki hava baloncuklarının oluşumunu önlemek ve daha sonra dikkatli bir şekilde bir kağıt havlu ile herhangi bir aşırı BBBA fitil. Bir mikroskop aşamasında (Şekil 2B) üzerindeki plaka cilt plakanın sandviç yerleştirin.
- 10X objektif ve 2 mikron veya 5 mikron Z-adımlarla aydınlık-alan ya da DIC aydınlatma kullanın. Tek bir üç boyutlu gri ölçekli veri kümesi oluşturmak için birleştirilir XY görüntüleri montaj yakalamak için bir mekanize XY sahne kullanın.
NOT: Tek bir büyük akson çardak için, bu veri seti olabilir5 Gb gibi büyük s. - Manuel, otomatik, veya Yazılım paket çeşitli herhangi biri ile akson milleri yarı otomatik izleme yapın.
NOT: Bu tür Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) olarak Yazılım PC ortamında çalışan ve 10 ana nispeten kolay ücretsiz bir nöronal yeniden bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cilt flatmounts ve aydınlık görüntüleme melanin pigmentasyonu (Şekil 4) dayalı görüntü deri duyu aferentlerine (Şekil 3A 10) ve saç folikülü desenleri kullanılabilir. Cilt flatmounts Konfokal görüntüleme anti-sitokeratin-6 ile ya da anti-görüntülenmiştir AM boya alımı (3H-L Şekil), (2) arrector pili, kas, ile görselleştirilmiştir (1) Merkel hücre kümeleri, geometrisini tanımlamak için kullanılabilir düz kas aktini (Şekil 3G, H), (3) Yağlı Kırmızı O (Şekiller 3C-F) ve a-GFP Krt17 transgen ile ya da anti-Krt17 antikorları ile lekeleme ile görselleştirilmiştir (4) saç folikülleri, ile görselleştirilmiştir yağ bezleri, 4 (Şekil 3E-G, K, L). Bu el Adobe Photoshop veya Illustrator kullanarak yapıları üzerinde bilinen yönelim vektörleri yerleştirerek, ve sonra quantifyin böyle görüntülerde yapıların yönelimleri ve mekansal düzenlemeleri puan basittirg edilen vektör popülasyonu. Bu yaklaşım, birkaç yüz vektörlerinin bir ölçek için yeterli olsa da, bu 10, engelleyici zor olan - ya da daha büyük ölçekli 100-kat.
Şekil 1. Önemli yapıları gösteren memeli kıllı deri şematik. (Telif hakkı, Terese Winslow.)
Şekil 2. Sylgard plaka. D) tutturulmuş bir Sylgard plakaya tutturulmuş cilt diseksiyon ve numune alma. A) Diseksiyon araçları. B) A P5 dorsal cilt. C) A P5 dorsal arka ayak deri görüntüleme için 2 cam jel plakaları arasına monte edilen bir sırt derisi w10X objektif ve DIC veya aydınlık aydınlatma ith.
Düz Şekil 3.. Cilt yapıları görüşlerini montaj. A, B) Tek bir deri duyu çardak (sol) ve bir Brn3a CKOAP / + bir P21 dorsal deri onun izlenebilir görüntü (sağ);. NFL-CreER / + fare gebelik günde 17 tamoksifen düşük dozda maruz Bu protokol sonuçları Dorsal kök ganglion nöronlarının, bir çok küçük bir bölümü içinde raportör ve bu nedenle deri duyusal milleri küçük bir kısmı, insan plasenta alkalin fosfataz (AP) raportör ile etiketlenir ve Cre aracılı rekombinasyon yer alır. Etiketli aksonlar NBT / BCIP histokimya ile görselleştirilebilir. Brn3a eşdeğer ikinci yağ bezleri görselleştirmek için Oil Red O ile boyanmış Tail deri Pou4f1. C, D) olarak adlandırılırWT (solda) ve FZ6 - / - P21 (sağ) fareler. FZ6 - / - yapıları dağınıktır. P, proksimal; . WT (solda) ve FZ6 D, distal E, F) dorsal ayak deri - / - Krt17-GFP taşıma (sağda) fareler. Cilt P21 toplandı ve Oil Red O ile boyanmış FZ6 - / - cildin merkezinde bir saç ağırşak sahiptir. P, proksimal; [Anti-düz kas aktin (SMA ile görüntülendi paneli G) ve arrector pili kaslarının;. P21 gösteren bir Krt17-GFP transgen ve anti-GFP immün ile görüntülendi saç köklerinin (bir WT fare D, uzak G, H) Dorsal deri ) İmmünbüyanmanın; paneli H]. Konfokal Z-yığın görüntü içinde derinliği renk kodlu. A, anterior; P, posterior. IL cytokeratin8 immünoboyamayla veya AM11-43 boya alımı ile görüntülendi) Bir Merkel hücresi küme () ve Krt17-G ile paneller K ve L görüntülendi merkezi saç folikülü (FP). Görüntüler belirtilen genotiplerinden P1 dorsal deri elde edilmiştir. FZ6 - / - WT Merkel hücresi küme anterior doğru açık ise Merkel hücresi küme, kapalı bir daire oluşturur. A, anterior; P, posterior. Ölçek çubukları: A ve B, 300 mikron; C ve D, 500 um; E ve F, 500 um; G ve H, 200 um; IL, 50 um. (A ve B Panelleri Elife ve Proc çoğaltılamaz. Natl. Acad. Sci. USA, izni 4,10) ile bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Saç ve P1 ve P7 dorsal deri saç köklerinin melanin pigmentasyonu ile görüntülendi. WT ve FZ6 A, B) P1 cilt - / - fareler m> - / -. FZ6 ikinci farenin C, D) P7 cilt. Ölçek çubukları: A ve B, 500 um; C ve D, 1 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan diseksiyon yöntemlerinin ustalık sadece sabır, sürekli bir el, ve birkaç iyi diseksiyon araçlar gerektirir. Sırt derisi diseksiyon nispeten kolaydır, ama kuyruk ve ayak cilt diseksiyonlar - Özellikle doğum sonrası erken yaşta - daha zor. (E15 önce örneğin) erken prenatal yaşlarda, cilt yırtmadan kaldırmak zordur. Uygun bir şekilde, büyüme ve farelerde deri yapıları modelleme birçok çalışmalar için, ilgi konusu olaylar arrector pili kas 19 büyümesinin çalışmalarda örneğin görüldüğü gibi, doğum sonrası ortaya çıkar.
Cilt nispeten refraktil doku çünkü derin düz bir konfigürasyonda monte deri içine görüntüleme zordur. Cilt nedeniyle ayrıştırılması ve onu oluşturan katmanlar artan kalınlığına olgunlaştıkça bu sorun daha büyük bir hale gelir. Bu probleme kısmi bir çözüm, bir dermis ve epidermis ayırmak ve Epiderm analiz etmektirayrı bir yapı ("epidermal bütün bağlar") olduğu gibi. Bu yaklaşım, özellikle fare kuyruğu cilt, saç folikülleri ve ilgili yapıların görüntülenmesi için yararlıdır. Bununla birlikte, fare sırt derisinden yüksek kaliteli epidermal bütün çıkıntıları elde etmek ki tahminen bu, derin dermiş içine uzanan saç köklerinin (1) yüksek yoğunluğu ve interfolliküler epidermisin 13 (2) inceliği için, zordur.
Deneyimlerimize göre, BBBA tedavi epidermal ve dermal katmanları ayıran gerek kalmadan immünofloresan sinyalleri korurken optik olarak transparan deri işleme için oldukça etkili bir yöntemdir. Benzil-benzoat yıllardır 20 için dokuları temizlemek için kullanılır olmuştur ve yaygın kurbağa ve balık embriyolarını temizlemek için kullanılır. Ancak, BBBA bu GFP ve diğer floresan proteinleri denatüre dezavantajı vardır, o Oil Red O erir ve ekipmanları (örneğin, mikroskoplar) kirletebilir. Bu INTERES olurdusistematik olarak SeeDB 21, ClearT 22, Ölçek 23, 3DISCO 24, ve floresan protein ile uyumlu olan bir kısmı açıklık 25 gibi diğer arıtma yöntemleri ile deri BBBA tedavi karşılaştırma t. BBBA örnekleri, bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir, geleneksel bir ışık / fluoresan mikroskobu ya da bir konfokal mikroskop davranılacağı, numuneler BBBA kirlenmeyi en aza indirmek için bir cam tabak içinde ya da iki büyük cam levha arasında yerleştirilmelidir.
Bu soruşturma kapsamında biyolojik soruya daha kendine özgü olduğu gibi biz, herhangi bir ayrıntı veri analizi ele değil. Giriş belirtildiği gibi Ancak, bu yapıların düz bağlar görüntülü edilebildiği gibi saç folikülleri, Merkel hücresi kümeleri, ve sinir uçları ve bütünlüğü gibi birçok neredeyse özdeş yapıların varlığı yapısal ya da morfolojik parametreleri ölçmek için bir fırsat sağlar istatistiksel olarak titiz manner, deri duyu akson morfolojileri 10 ve saç folikülleri ve yabani tip ve FZ6 mutant farelerde 4,8 folikül ilişkili yapıların son çalışmalarda, örneğin görüldüğü gibi. Daha sofistike görüntü analiz araçlarının gelişmesiyle birlikte, o, şu anda, böylece cildin daha geniş kullanımının kolaylaştırılması, elle yapılır analizlerin bazı otomatik veya yarı-otomatik hale getirmek mümkün olabilir düz temel ilkeleri araştırmak için bir yöntem olarak görüntüleme montaj çok hücreli organizasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
