Summary
Ca2 + Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca 2 +-Signale in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 +-Indikatoren Aequorin oder Case12.
Abstract
Entwicklungs-und Umweltreize auslösen Ca 2 + Schwankungen in Pflanzenzellen. Reiz-spezifischen räumlichen-zeitlichen Ca 2 + Muster werden durch zelluläre Ca2 +-bindende Proteine, die Ca 2 +-Signalkaskaden initiieren abgetastet. Allerdings wissen wir noch wenig darüber, wie bestimmte Reiz Ca 2 +-Signale erzeugt. Die Spezifität eines Ca 2 +-Signal kann der ausgereiften Regulierung der Aktivitäten von Ca 2 +-Kanäle und / oder Transporteure als Antwort auf einen gegebenen Reiz zurückzuführen. Diese Zellkomponenten zu identifizieren und ihre Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Systeme, die eine empfindliche und stabile Aufnahme der Ca2 +-Signale sowohl auf dem Gewebe und zellulärer Ebene zu ermöglichen verwenden. Genetisch kodierte Ca 2 +-Indikatoren, die zu verschiedenen zellulären Kompartimenten richtet sind haben eine Plattform für Live Cell konfokale Bildgebung von zellulären Ca 2 +-Signale zur Verfügung gestellt. Hier beschreiben wir Unterrichts für die Verwendung von zwei Erfassungssystemen Ca 2 +: Aequorin basierend FAS (Klebefilm Sämlinge) Ca 2 +-Lumineszenz-Bildgebung und case12 basierend Lebendzell konfokalen Fluoreszenz Ca 2 +-Bildgebung. Lumineszenz-Bildgebung mit der FAS-System bietet eine einfache, robuste und sensitive Detektion der räumlichen und zeitlichen Ca 2 +-Signale in der Gewebeebene, während Live Cell Imaging mit konfokalen Case12 bietet simultane Detektion von zytosolischen und Kern Ca 2 +-Signale mit einer hohen Auflösung.
Introduction
Die Pflanzenzelle reagiert auf die Umgebung über die Signalisierungszelle Aktionen koordiniert. Ein frühes Zellsignalisierungsereignis als Reaktion auf Umweltreize ist eine vorübergehende Ca 2 + zu erhöhen. Das Muster oder der Signatur einer transienten Zunahme der freien Ca 2 +-Konzentration wird durch seine Amplitude, Frequenz und Dauer ist. Unterschiedliche Raum-Zeit-Ca 2 +-Signaturen regulieren verschiedene Zellaktivitäten 1. Spezifische Reize, wie Hitze, Kälte, Salz, Trockenheit, Licht oder Pflanzenhormone, kann eine Feinabstimmung des räumlichen und zeitlichen Aktivität des Membran-lokalisierten Ca 2 +-Kanäle und / oder Transporteure, was in bestimmten Ca2 +-Signaturen. Obwohl Ca 2 +-Transporter sind gut gekennzeichnet, ist nur wenig über die molekularen Identitäten und Funktionen der Ca2 +-Kanäle in Pflanzen 1 bekannt. Genetische-Mutanten mit veränderten Ca 2 + Reaktion auf Reize betonen, kann eine wirksame ca. seinoach für die Identifizierung der Komponenten, die Ca 2 +-Signaturen zu komponieren. Kürzlich mehrere Aequorin basierend Ca 2 + Detektionssysteme entwickelt, die genetischen Screens erleichtern für Ca2 + Signalkomponenten in Reaktion auf Krankheitserreger angreifen und abiotischen Stress 2-4.
Äquorin wurde zuerst verwendet, um in den frühen 1990er Jahren 5 Ca 2 +-Signale zu erkennen in Pflanzen. Seitdem hat Aequorin zu verschiedenen Zellkompartimenten wie dem Zytoplasma 5, Kern 6, 7, Chloroplasten, tonoplast 8, 9 Mitochondrien und Stroma 10 sowie an verschiedenen Zelltypen in der Stammzell spezifische Ca 2 überwachen gezielt worden + Signale 11. Äquorin basierend Ca 2 +-Messungen zeigen, die räumliche und zeitliche Ca2 + Antwort einer Population von Zellen auf Reize zu betonen. In den meisten Fällen sind jedoch die Ca 2 +-Antworten einzelner Zellen unsynchroniim antwort Gewebe 4 zed. Daher Aequorin Ca2 + Aufnahme nicht unbedingt die Ca 2 +-Signal in einzelnen Zellen zu melden. In den letzten Jahren genetisch kodierte Fluoreszenzprotein (FP) basierenden Ca 2 +-Indikatoren, wie gelb Cameleon (YCS) 12 und 13 CASEs12 verwendet worden, um Ca 2 + studieren Signalisierung mit hoher Auflösung subzellulärer. Ycs sind Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) basierenden Ca 2 +-Indikatoren, CFP und YFP-Varianten enthalten, durch die Ca 2 + gebunden bindende Protein Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Calmodulin eine Konformationsänderung wie sie Ca 2 + bindet, wodurch bewirkt CFP und YFP näher zusammen, was zu einem erhöhten Energie-Transfer (FRET verstärkt). Die FRET-Level über die Zeit, in etwa dem Verhältnis der an GFP YFP Signalintensitäten berechnet, spiegelt die intrazelluläre Ca 2 + Dynamik. YC mehrere Versionen in Pflanzen verwendet worden. YC3.6 war tin das Cytosol 14,15, 16 Kern, Mitochondrien 17 und 18 Plasmamembran und YC4.6 und D4ER argeted wurden in die Notaufnahme 15,19 gezielte und D3cpv wurde den Peroxisomen 20 ausgerichtet. Transgene Pflanzen, die YCS ermöglichen die Live-Cell-Imaging von Ca2 + Dynamik in verschiedenen zellulären Kompartimenten verschiedener Zelltypen. Fällen (vermutlich Ca lcium se nsor) sind Einzel zirkular permutierten fluoreszierende Proteine (cpFPs) beherbergen eine Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Nach der Bindung an Ca 2 +, Koffer unterziehen Konformationsänderungen, die zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Die Korrelation zwischen Fluoreszenzantwort der Fall und Ca 2 +-Konzentration ermöglicht die intrazelluläre Ca2 + Dynamik quantitativ gemessen werden. Die Case12 Variante hat 12-fach erhöht Fluoreszenz in den Ca 2 + -gesättigtem Formen. N. benthiminana Pflanzen vorübergehend ausdrEssing Case12 oder Arabidopsis-Pflanzen stabil exprimieren Fall 12 wurden verwendet, um Ca2 +-Signalisierung in der Verteidigung und abiotische Stress 4,21 studieren. Asynchrone räumliche und zeitliche Ca2 + Oszillationen in Zellen, die auf Pathogenbefall oder Austrocknung Stress haben mit Case12 basierend Ca 2 +-Bildgebung offenbart worden.
Hier präsentieren wir detaillierte Anweisungen für Aequorin Lumineszenz-Bildgebung von Gewebe-und Reize spezifischen Ca2 + Dynamik in Arabidopsis-Keimlinge, und für die konfokale Bildgebung von zytosolischen und Kern Ca 2 + Dynamik in Arabidopsis Wurzelzellen, die Fall 12. Lumineszenz-Bildgebung von FAS äußern könnten, die den Stress-induzierten Ca2 + Dynamik in ganzen Pflanzen oder Gewebe hier nicht beschrieben zu analysieren oder mutagenisierten Arabidopsis Pflanzenpopulationen nach Mutanten mit veränderten Stress induziert Ca2 +-Signale zu screenen. Die Lebendzell Ca2 + Imaging-Setup könnte angepasst Ca analysieren2 + Dynamik innerhalb verschiedener subcelluar Kammern oder in verschiedenen Zelltypen mit anderen Ca 2 +-Indikatoren.
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Protocol
1. Aequorin Based Ca2 +-Imaging-System Mit der FAS
- Bereiten Pflanzgut für Lumineszenz-Bildgebung. Sterilisieren Samen von Arabidopsis-Pflanzen, Aequorin mit 10% Bleichlösung, die 0,01% Triton-100. Säen die Samen steril auf einer quadratischen Platte (10 x 10 cm im Quadrat Petrischale mit Gitter,) mit voller Kraft MS (Murashige und Skoog Basalsalzmischung), 1% Saccharose und 1,2% Agar. Ort Platten vertikal in einer Wachstumskammer nach einer Schichtung bei 4 ° C für 2 Tage (1A).
- Übertragen Sie die Sämlinge auf einen Film. Ein Klebefilm (1B) auf der Oberseite der 7-10 Tage alten Sämlinge wachsen auf der Platte. Schieben Sie die Folie mit der Hand, um sicherzustellen, dass Keimlinge auf den Film (1C) einzuhalten. Schälen die Folie vorsichtig, so dass die Sämlinge bleiben an der Folie haften (1D und 1E)
- Bebrüten die Sämlinge mit Cofaktor. Legen Sie die einedhered Sämlinge auf den Platz Platte (10 x 10 cm) mit 15 ml 2 pg / ml h-CTZ (Coelenterazins) in Wasser. Die Sämlinge bei Raumtemperatur inkubiert für 4 h bis über Nacht (1F).
- Bereiten Sie sich für Lumineszenz-Bildgebung. Nehmen Sie den Film aus der h-CTZ Lösung und schneiden Sie es in der Mitte und bilden zwei Stücke. Legen Sie jedes Stück Film mit Jungpflanzen stehen in zwei verschiedenen Platten. Lassen Sie die Platten im Dunkeln für 5 min.
- Erwerben Lumineszenz Bilder. Im Dunkeln, legen die beiden Platten nebeneinander auf der Bühne der Lumineszenz-Abbildungssystem (Figur 1G). Erwerben Bilder sofort nach Zugabe von 20 ml Lösung von Stimuli an die Platten gleichzeitig.
- Analysieren Lumineszenz Bilder. Wählen Sie die gleichen Anzeigebereich für alle Lumineszenz Bilder. Beschneiden die Region of Interest (ROI) und erzeugen die Bilder als JPEG-Dateien (Abbildung 2a). Alternativ exportieren Sie die Bilder als SPE-Format-Dateien und importieren Sie sie in dieImageJ Bildanalyse-Software. Set-Messungen für die Berechnung der mittleren Grauwert der ROI. Wählen Sie die gleiche Größe der ROI-Bereich und messen die mittlere Grau und Darstellung von Daten als Balkendiagramme (Abbildung 2B).
2. Live Cell Imaging konfokale Ca 2 +
- Bereiten Setzlinge für die konfokale Bildgebung. Sterilisieren Samen von Arabidopsis-Pflanzen case12 ausdrücken mit 10% Bleichlösung, die 0,01% Triton. Aussaat der Samen auf einem sterilen Platte mit Vollkraft MS-Salze, 1% Saccharose und 1,2% Agar. Ort Platten vertikal in einer Wachstumskammer nach einer Schichtung bei 4 ° C für 2 Tage.
- Setup Imaging Chambers
- Montieren Sie eine Imaging-Kammer mit einer Rutsche und Deckglas (Raum A). Legen Sie ein Stück Watte Wasser eingeweicht, auf der Mitte der Folie. Dann Transfer ein oder zwei 5 Tage alten Keimlingen von der Platte auf die Oberseite des Wasser eingeweicht Watte. Halten Sie kleine Stücke von Ton zu jeder Ecke eines Deckglases, eind Platz Deckglas auf der Oberseite der Setzlinge, um eine Lücke (Kammer) zwischen dem Deckglas und Objektträger (3A, links) zu erstellen. Das eine Ende des Polyethylenschlauch (0,58 mm Durchmesser) auf eine 1 ml-Spritze und das andere Ende des Rohrs unmittelbar angrenzend an die Kammer. Halten Sie den Schlauch mit Klebeband (3A, rechts).
- Montieren Sie eine Imaging-Kammer mit einer Plexiglaskammer (Chamber B).
- Verteilen Sie eine dünne Schicht Silikonfett rund zwei Polyethylen-Rohre (0,58 mm Durchmesser), und drücken Sie die beschichteten Rohre in die Kanäle auf jeder Seite der Plexiglaskammer (3B links). Verteilen Sie eine dünne Schicht Silikonfett auf die Oberfläche der Kammer, dass das Rohr Nuten enthält und drücken Sie eine Deckglas in das Fett auf der einen Seite der Kammeröffnung (ausgeschnitten) zu versiegeln.
- Übertragen einer 5 Tage alten Keimling von der Platte in die Kammer und setzen Sie ein Stück Watte mit Wasser getränkt auf der Oberseite of des Keimlings. Verbreiten Silikonfett auf die andere Oberfläche der Kammer, und drücken Sie eine andere Deckglas zu versiegeln. Verbinden des Endes eines der Rohre an eine 1 ml Spritze. Lassen Sie das Ende der anderen Röhre offen (3B rechts).
- Bereiten Sie eine Imaging-Kammer mit einem Kammerdeckglas (Kammer C). Sterilisieren Kammerdeckglas mit 70% Ethanol und lassen Sie es auf der Motorhaube bis trocken. 0,6 ml oder 0,2 ml Vollkraft MS-Medium mit 1% Saccharose und 0,5% Phytagel in jede Vertiefung einer 2-Kammer oder auch ein 8-Well-Kammer (3C rechts) auf. Sterilisieren Samen und säen die Samen direkt in einem Kammerdeckglas, das eine dünne Schicht klares Gel und lassen Sie sie vertikal für 5 Tage (Abbildung 3C) wachsen.
- Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop. Um Stress Reize, wie Salz, Kälte oder Peroxid gelten, langsam injizieren etwa 200 ul von 150 mM NaCl, Eis-cold Wasser oder 1 mM H 2 O 2-Lösung in die Kammer (Kammer A oder B) kurz vor der Aufnahme von Bildern oder sanft hinzufügen 500 ul oder 100 ul der Reiz Lösung für die Vertiefung einer 2-oder 8-Well-Kammer-bzw. . Erfassen von Bildern unmittelbar nach der Anwendung des Stimulus-Lösung unter Verwendung eines invertierten Nikon A1R konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 20x Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur 0.75). Sammeln einer Zeitserie von Bildern bei 4 sec Intervallen mit Anregungs-und Emissionswellenlängen von 488 nm und 500 bis 550 nm und bei einer Pixelauflösung von 512 x 512.
- Bildanalyse
Mit Nikon-Elemente wurden ROIs um jede Zelle (oder Fläche) von Interesse gezogen. Gesamtintensität innerhalb jedes ROI wurde im Laufe der Zeit über das Dialogfeld Zeitmessung (ImageJ stattdessen verwendet werden könnten) gemessen. Gesamtintensität Messungen wurden exportiert und in Datagraph verarbeitet. Ca 2 + Spike Amplitude wurde als Spitzenintensität minus Ruhe Intensität, Dauer, wie th definierte Zeit zwischen Initiierung und Abschluss einer Spitze, und Zeit als das Zeitintervall zwischen benachbarten Dorn Spitzen von zwei Spikes. t-test wurde verwendet, um die Mittel zu vergleichen.
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Representative Results
Mannit, NaCl und H 2 O 2 wurden als Stellvertreter für die Dehydratisierung, Salz und oxidativer Stress Stimuli verwendet wurden. Um zu überprüfen, ob die Schwermetallionen Cu 2 + Synergie mit jeder dieser drei Spannungsreize, verglichen wir die Ca2 + Antwort auf jeden Stimuli in Gegenwart oder Abwesenheit von Cu 2 +. Wie in 2 gezeigt, zeigte FAS Lumineszenzbildgebung dass Arabidoposis Sämlinge zu Dehydrierung, Salz und oxidativen Stress reagiert anders. Für die Konzentration von Stimuli wir in dieser Studie untersucht, 75 mM NaCl induzierte die stärkste Ca2 +-Antwort in Blättern und Wurzeln während der ersten 40 Sekunden der Belichtung (2A Mitteltafel und 2B), und 1 mM H 2 O 2 induzierten eine starke Ca2 + Antwort sowohl in Blättern und Wurzeln in der ersten und zweiten 40 sec (2A rechts). Die Lösung von 400 mM Mannit nur induziertenCa 2 +-Antwort in Wurzeln in den ersten 40er und sehr schwache Signale in Blättern während der zweiten 40 sec. Cu 2 + stark erhöht die Amplituden und Dauer der Ca2 +-Signale von NaCl und Mannit (2A links) ausgelöst. Es scheint, dass Cu 2 + hatte eine hemmende Wirkung auf H 2 O 2-induzierten Ca2 +-Signale, wodurch sowohl die Amplitude und die Dauer (2A und 2B rechten Bereich).
Verwendung Case12 ausdrücken Arabidopsis-Pflanzen, gemessen wir Ca 2 + Dynamik im Cytosol und Zellkerne gleichzeitig. Molekulargewicht von 46 kDa Case12 ist daher transgene Pflanzen, Case12 haben GFP-Signale sowohl in den Cytosol und Kerne von Blatt-und Wurzelzellen (4A). Kundenspezifische (3A und 3B) oder Handelskammern (3C) wurden für Live Cell Imaging mit einem konfokalen verwendetMikroskop. Anwenden 150 mM NaCl zu der Sämling in der Kammer, beobachteten wir Veränderungen der Fluoreszenzintensität sowohl im Cytosol und Kern der einzelnen Zellen (4B und C; Ergänzungs Film 1). Mit NIS-Elements (Imaging-Software, Nikon Instruments Inc.), messen wir die Fluoreszenzintensität in den Regionen von Interesse (ROI) über die Zeit. Die Amplitude, Dauer und Häufigkeit der cytosolischen Ca 2 + und Kernschwingung sind graphisch in Figur 4B dargestellt. Die Amplitude und Dauer von Ca 2 + Spitzen in das Zytoplasma und die Kerne sehr unterschiedlich zwischen den Zellen der gleichen Wurzel, als auch in Zellen, die in verschiedenen Wurzeln. Die Amplitude und Dauer der zytosolischen Ca2 + Spikes waren 60,36 ± 45,22 AU (willkürliche Einheit) und 58,24 ± 15,70 sec auf. Die Amplitude und Dauer der Kern Ca2 + Spikes waren 316,26 ± 75,24 (AU) und 61,71 ± 16,31 sec auf. Im Gegensatz dazu ist dieDauer der zytosolischen und Kern Ca2 + Spikes waren zwischen Zellen, die 17,43 ± 3,67 s und 17,33 ± 2 sec, bzw. waren. Die Amplitude des Ca 2 + im Laufe der Zeit verringert Spitzen, die zu einer Veränderung der Brennebene und / oder einem Verlust der Reaktion zurückzuführen sein kann auf Stimuli aufgrund einer ungünstigen Bedingung in vitro zu betonen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Salzstress löst Ca 2 + Schwingung sowohl im Zytoplasma und Zellkern.
Abbildung 1 Aequorin basierend FAS System zur Messung räumlich-zeitliche Dynamik Ca2 + als Reaktion auf Reize zu betonen. A) wachsen Arabidopsis Keimlingen vertikal auf einer Platte, die MS-Medium. B, C) Ein Klebefilm (B) auf der Oberseite der Sämlinge (C). D, E) F) Sämlinge auf die Folie geklebt Inkubieren mit 2 ug / ml h-CTZ in Wasser für 4 Stunden. G) Schneiden der Folie in der Mitte durch und stellen jedes Stück in einer anderen leeren Teller. Lassen Sie die Platten im Dunkeln für 5 min. Bewerben Sie sich gleichzeitig zu steuern und Impulse Lösungen (unbedingt die Sämlinge werden vollständig übernommen), und sofort Bilder zu erwerben. Der Maßstab beträgt 5 cm.
Abbildung 2. Vergleich der räumlich-zeitlichen Ca2 + Antwort der 10 Tage Sämlinge auf verschiedene Stressreize. A) eine Zeitreihe Lumineszenzbilder von Sämlingen bis 400 mM Mannitol und 400 mM Mannitol und 1 mM CuCl 2 (A, links), 75 mM NaCl und 75 mM NaCl und 1 mM CuCl unterworfen2 (A, Mitte) und 1 mM H 2 O 2 oder 1 mM H 2 O 2 plus 1 mM CuCl 2 (A, rechts). Oberen und unteren Platten von A sind Lumineszenzbilder während ersten 40 sec und 40 sec zweiten bzw. erworben. Eine Intensität Maßstab zeigt eine Zunahme der Lumineszenz-Signale von niedrig (schwarz) bis hoch (weiß). B) Balkendiagramm des Durchschnitts Lumineszenz-Intensität von Sämlingen in Reaktion auf den angegebenen Belastungsreize.
Abbildung 3. Aufbau einer lebenden Zelle konfokale Bildgebung Experiment. A) Eine angepasste Kammer ist mit einem Schieber, Deckglas mit vier Stücken von Ton und Watte gebaut. Zwei 5-Tage alte Keimlinge auf der Folie platziert. Ein Ende eines Polyethylenschlauch wird neben der zusammengebauten Kammer und mit festenein Klebestreifen, während das andere Ende ist an eine 1 ml Spritze. B) Eine angepasste Objektträger mit Plexiglas verbunden ist, eine offene Kammer, in der Mitte und zwei Kanälen, die an den beiden Seiten des Kanals verbunden sind. Einem Deckglas auf dem oberen Rand der Folie angeordnet und zwei Polyethylenrohre sind in dem Kanal angeordnet ist. Deckgläschen und Rohre in die Position mit Silikonfett fixiert. Das Ende eines der Rohre wird an einer 1 ml Spritze verbunden ist und das Ende des anderen Rohrs offen bleibt. A 5 Tage alter Sämling in der Kammer angeordnet, und ein coveslip ist auf der Oberseite der Keimlings gebracht und mit Silikonfett abgedichtet. Die plexigalss Schlitten mit dem montierten Kammer auf der Objekttisch des Mikroskops gelegt. C) Arabidopsis Keimlingen in zwei Vertiefungen (links) oder 8 Vertiefungen (rechts) der Kammerabdeckung Glas mit einer dünnen Schicht von 0,6% Phytagel MS gezüchtet Medien.
Abbildung 4. Zytosolische und Kern Ca 2 + Schwingung in Reaktion auf Salzstress. A) Konfokale Aufnahmen zeigen, dass Case12 im Zytoplasma und Zellkerne von Wurzelzellen (links) und Blattzellen (rechts) von transgenen Pflanzen, die Case12 ausgedrückt. Das Bild auf der rechten Seite ist eine fusionierte Bild der roten Autofluoreszenz der Chloroplasten und grünen Fluoreszenz der Case12. B) Salzstress (150 mM NaCl) induziert Ca2 + Schwingung im Cytosol (oben) und Zellkerne (unten) von Wurzelzellen. Standorte der Messzellen sind durch Pfeile mit Zahlen auf Platte angezeigt.
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Discussion
Wir haben ein FAS-System zur Aufzeichnung der räumlichen-zeitlichen Ca2 + Antwort von Arabidopsis Keimlingen nachgewiesen. Diese FAS Ca 2 +-Aufzeichnungssystem ist eine einfache, empfindliche und stabile Ansatz zur Messung Ca2 + Dynamik durch verschiedene Stimuli neben den abiotischen Stressreize, die hier vorgestellt werden ausgelöst, angepasst werden kann. Mit diesem System können wir einfach vergleichen gewebespezifische Reize oder räumlich-zeitliche Dynamik Ca 2 + in der ganzen Pflanze Ebene. Die hohe Empfindlichkeit des FAS ermöglicht die Verwendung von geringer Intensität Stimuli für die Prüfung Ca 2 +-Antworten, die für die Vermeidung von Artefakten durch körperliche Schäden an Zellen verursacht wird, wenn Hochspannungsintensität verwendet wird. Sieben bis 10 Tage alte Arabidopsis Keimlinge zeigten Gewebe oder Stimuli spezifische Ca2 + Antwort, wenn Sämlinge in verschiedenen physiologischen Stadien unterschiedliche Sensitivität und Spezifität in Reaktion auf einen bestimmten Reiz zu haben. Daher ist esbevorzugt 7-10 Tage alten Sämlingen zu verwenden, um den Durchsatz des FAS-Messungen, in denen etwa 100 Sämlinge konnten auf einem Stück Film geklebt werden erhöht. Zusammen mit leicht und einfach Leistung, hohe Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit, konnte die FAS-System auch für das Screening von EMS mutagenisierten Mutanten verändert Ca 2 +-Antworten angepasst werden. Für Screeningzwecke ist es wichtig, eine einheitliche Sämlinge, die auch auf der Platte gewachsen sind und auf die Folie geklebt sind. Vier bis fünf Stunden Inkubation der Folie geklebt Sämlinge mit H-CTZ ist üblicherweise für die Zubereitung von Aequorin ausreichend. Verwendung der Folie mit Löchern ist bevorzugt, da die Reaktion von Apoaequorin und Cofaktor benötigt Sauerstoff. Für den Vergleich von Gewebe oder Stimuli spezifischen Ca 2 +-Antworten, mit Gruppen von Sämlingen ursprünglich aus dem gleichen Film ist kritisch, weil der Zustand der Setzlinge und / oder die Rekonstitution Zustand kann die Gesamtmenge der funktionellen Aequorin beeinflussen. Wenn diese requiremeNTS erfüllt sind, wird die Differenz der Lumineszenz Reaktion ist proportional zu der Gewebe-oder Stimulus-spezifische Ca2 + Antwort.
Aequorin basierend Messung der Ca 2 +-Signale spiegeln die Reaktion von einer Population von Zellen. Betrachtet man jedoch die Heterogenität der Zelltypen und / oder die Zugänglichkeit der verschiedenen Zellen in dem Gewebe auf die Stimuli, die Ergebnisse der Aequorin basierend Ca 2 +-Messungen nicht auf das Verhalten einer Zelle gleichzusetzen. Verständnis Ca 2 + Dynamik auf der zellulären Ebene erfordert eine Ca 2 +-Anzeige, die mit subzellulärer Auflösung erfasst werden kann. Live-Cell-Imaging-konfokale Fluoreszenzprotein (FP) basierenden Indikatoren Ca 2 + bietet eine erweiterte Ca 2 +-Erfassungssystem für die Aufzeichnung von zellulären Ca 2 + Dynamik mit zellulärer Auflösung in einem gewünschten Gewebe. Hier, der Live-Zelle konfokale Bildgebung und FP-basierten Ca2 +-Indikatoren verzeichneten wir subzellulärer Ca2 + +-Indikatoren haben in Anlagen mit unterschiedlichen Eigenschaften implementiert. Im Vergleich zu YCS, verfügt über Einzel-GFP-basierten Ca2 + Indikator einige Vorteile: 1. Case12 nicht YFP und CFP Filtersätze oder die vielen Annahmen und komplexe Berechnungen erforderlich, um FRET 22 messen müssen. Case12 hat einzigen Anregungs / Emissionsmaxima und können mit Standard-GFP-Filtersatz leicht festgestellt werden. 2. Case12 unter physiologischen pH-Wert stabil sind und eine relativ kleine Protein (46 kDa). Wenn in Pflanzen exprimiert, wird nicht gezielter Case12 im Zytoplasma als auch Kerne, so Case12 transgenen Pflanzen verwendet werden, um zytosolischen und nuklearen Ca2 + Dynamik gleichzeitig zu verfolgen. Ein Nachteil dieser Reporter ist, dass es ein nicht-ratiometrischen Indikator, so Fluoreszenzniveaus werden durch Faktoren, die nicht verwandt sind, um Ca 2 +-Konzentration, wie beispielsweise das Expressionsniveau des betroffenenCase12 und lokale pH-Wert. Dennoch ist Case12 ausreichende zelluläre Ca 2 +-Konzentration für den Vergleich der räumlichen-zeitlichen Dynamik Ca 2 + in das Zytoplasma und Organellen zwischen Materialien mit verschiedenen genetischen Hintergründen unter den gleichen Versuchsbedingungen zu bestimmen. In der Zukunft, neue GFP basiert Ca 2 +-Indikatoren mit höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis, schnelle Kinetik und größere Resonanz, wie GCaMP3 24 und 25 GCaMP5 bei Tieren nachgewiesen, könnten bessere Indikatoren für die Aufzeichnung von zellulären oder subcelluar Ca 2 + Dynamik in Pflanzen.
Die hier beschriebenen und Aequorin Case12 Detektionssysteme zerstörungs in vivo-Ansätzen zur Messung der räumlichen-zeitlichen Dynamik Ca 2 + auf die gesamte Sämling und subzellulären Pegel. In beiden Systemen konnten die physiologischen Zustand oder Wachstumsbedingungen Die Ca 2 +-Antworten beeinflussen der Sämlinge oder Zellen. Wenn physically beschädigt oder nicht in einem guten Zustand hergestellt werden, könnten Zellen haben schwache oder gar keine Ca2 +-Antworten. Darüber hinaus sind die Dauer der räumlichen und zeitlichen Ca2 +-Signale auch von den Bedingungen der Sämling während der Messungen beeinflusst. Die Lumineszenz oder Fluoreszenz-Signale können über die Zeit aufgrund von Beschädigung Stimuli induzierte verringern, und / oder der laserinduzierte photo Schäden bei konfokaler Bildgebung. Obwohl Stimulus-induzierte Schäden können nicht vermieden werden kann, kann der Phototoxizität durch Begrenzen der Intensität und / oder Frequenz der Laserbelichtung verringert werden. Darüber hinaus erfordert Aequorin basierend Ca 2 +-Aufzeichnungssystem eine Rekonstitution. Faktoren, die die Diffusion von CTZ an die Zelle und / oder Umsetzung von Apoaequorin mit CTZ brechen würde Lumineszenz-Signale, die direkt an Ca 2 +-Konzentration verbunden sind beeinflussen. Deshalb ist die Konzentration von CTZ, sowie die Dauer und die Bedingungen der CTZ Inkubation müssen für beste Empfindlichkeit und reproducibil optimiert werdenkeit. Genetisch kodierte Ca 2 +-Indikatoren können ungenau berichten zelluläre Ca 2 +-Konzentrationen für andere Gründe, einschließlich unbeabsichtigten Zielen auf spezifische subzelluläre Kompartimente, Temperaturempfindlichkeit oder Störungen des Reporters mit der zelluläre Ca2 + Signal-Maschine 23. Wir fanden, dass Aequorin oder Case12 exprimierenden Pflanzen haben keine offensichtlichen morphologischen oder bedingte Phänotypen wie veränderte Stresstoleranz. Daher ist es unwahrscheinlich, dass diese genetisch kodierten Ca 2 +-Indikatoren haben erhebliche Beeinträchtigungen des Ca 2 +-Signalgebung in Pflanzen.
Zusammenfassend stellen wir hier detaillierte Anweisungen für die Verwendung von zwei Ca2 + Detektionssysteme zur Messung räumlich und zeitlich Ca2 +-Signale sowohl auf der ganzen Pflanze Keimling und subzellulärer Ebene. Diese beiden Systeme können verwendet werden, um Gewebe (oder Zelltyp) oder Stimuli spezifische Ca2 + dynamische Muster mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmen, undReproduzierbarkeit. Deshalb sind sie leistungsstarke Werkzeuge für die Aufklärung der Gen-Netzwerke, die Ca 2 +-Signalisierung zugrunde liegen, als Reaktion auf verschiedene Umweltreize.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
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