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Bioengineering

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Summary

Die Zellmigration ist ein biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen beteiligt ist, wie der Wundheilung und Immunreaktionen und pathophysiologischen Prozessen, wie Krebs. Die 3D-Kollagen-Matrix Migrationstest ist ein vielseitiges Werkzeug, um die Migrationseigenschaften der verschiedenen Zelltypen innerhalb in einer 3D-physiologischen Umgebung wie zu analysieren.

Abstract

Die Fähigkeit zur Migration ist ein Markenzeichen von verschiedenen Zelltypen spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Wundheilung, und Immunantworten. Allerdings ist die Zellmigration auch ein wichtiger Mechanismus in der Krebs Aktivierung dieser Krebszellen aus dem Primärtumor lösen metastasiertem beginnen die Verbreitung. In den letzten Jahren wurden verschiedene Zellmigrationsassays wurden entwickelt, um das Migrationsverhalten der verschiedenen Zelltypen zu analysieren. Weil das Bewegungsverhalten von Zellen unterscheidet sich deutlich zwischen einem zweidimensionalen (2D) und dreidimensionale (3D) Umgebung angenommen werden kann, dass die Analyse der Migration von Zellen, die in einer 3D-Umgebung eingebettet wäre eine signifikante Zellmigration ergeben werden in Daten. Der Vorteil der beschriebenen 3D Kollagenmatrix-Migrationstest ist, dass Zellen in einer physiologischen 3D-Netzwerk von Kollagenfasern, die die Hauptkomponente der extrazellulären Matrix. DurchZeitraffer-Videomikroskopie echten Zellmigration wird gemessen, die die Bestimmung von mehreren Parametern Migration sowie deren Veränderungen in Reaktion auf pro-Migrationsfaktoren oder Inhibitoren. Verschiedene Zelltypen können unter Verwendung dieser Technik, einschließlich Lymphozyten / Leukozyten, Stammzellen und Tumorzellen untersucht werden. Ebenso könnte auch Zellhaufen oder Sphäroiden innerhalb der Kollagenmatrix gleichzeitig mit Analyse der Abwanderung von Einzelzellen aus dem Zellverband / Sphäroid in die Kollagengitter eingebettet werden. Wir schließen daraus, dass die 3D-Kollagen-Matrix-Migrationstest ist ein vielseitiges Verfahren, um die Migration von Zellen in einem physiologischen artigen 3D-Umgebung zu analysieren.

Introduction

Wie Zellfusion (für eine Übersicht siehe 1,2) Zellmigration ist ein weiteres biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen einschließlich der Embryonalentwicklung, Wundheilung und Immunreaktionen (für eine Übersicht siehe 3) beteiligt ist. Jedoch ist die Fähigkeit zur Migration auch eine Voraussetzung für die Tumorzellen zu metastasieren (für einen Überblick siehe 3,4).

Die Zellmigration ist ein komplexer, noch nicht vollständig verstanden Prozess, der durch das Zusammenspiel mehrerer Signaltransduktionswege durch verschiedene Liganden (zB Cytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren, Hormone, extrazelluläre Matrixkomponenten)-Rezeptor (zB Rezeptor-Tyrosin-Kinasen initiiert gerichtet ist, Chemokin-Rezeptoren, Integrine) Wechselwirkungen 5 wodurch letztlich die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts gleichzeitig mit De- und Remontage von focal adhesion Komplexe und Integrin-vermittelten Signal 6.

in-vitro-und in vivo-Zellmigrationsassays analysiert haben in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt worden, einschließlich der Boyden-Kammer / Transwell-Assay 7, Kratztest / Wundheilungs Test 8-10, dreidimensionale ( 3D) Kollagen-Matrix Migrationsassay 11 sowie Intravital Imaging / Mikroskopie (für eine Übersicht siehe 12). Jeder dieser Zellmigrationsassays hat Vor-und Nachteile, zB über Kosten und Notwendigkeit der Ausrüstung, Handhabung oder Zuverlässigkeit der gewonnenen Daten.

Sowohl der Boyden-Kammer / Transwell-Assay und die Kratztest / Wundheilungstest sind einfach, preiswert und gut entwickelten Assays zur Zellmigration in vitro 7-10 messen. Der so genannten oberen Fach 7 - in der Boyden-Kammer / Transwell-Assay Zellen sind auf der Oberseite eines Einsatzes enthalten Poren (etwa 8 um Durchmesser) ausgesät. Optional könnte der Einsatz mit extrazellulären m beschichtet werdenatrix Komponenten, zB Fibronektin, Kollagen etc. nachahmen eine physiologische Umgebung. Ebenso könnte Endothelzellen auf der Oberseite des Einsatzes gehalten werden, wodurch eine endotheliale Zellbarriere 13 nachahmt. Jene Zellen, die durch die Poren in einem definierten Zeitintervall in das untere Kompartiment beherbergen, Medien und Ergänzungen, wie Wachstumsfaktoren und Chemokine durchlaufen haben, werden als Auslese verwendet, um die Zellmigration (oder Extravasation) quantifizieren.

Der Kratztest / Wundheilungs Assay Zellen werden in Platten ausgesät und bis zur Konfluenz 10 gewachsen. In Abhängigkeit von den experimentellen Aufbau konnte Platten mit extrazellulären Matrixkomponenten, wie Fibronectin vorbeschichtet werden. Nach dem Erstellen eines Kratzer / durch Abkratzen der Zellmonoschicht einzelne Zellen von jeder Seite der Kratzwund / Wunde kann in die Lücke wandern, wodurch Füllen / Heil es 10. Der Abstand zwischen den beiden Seiten der Ritz / Wunden bestimmtin Abhängigkeit von der Zeit und als Auslesung der Migrationsaktivität der Zellen 10 verwendet. Jedoch zwischen Zellproliferation und Zellmigration zu unterscheiden (die auch bei der Abfüllung / Heilung der Kratzer / Wunde führen kann), wird empfohlen, den Test mit Zeitraffer-Videomikroskopie und Einzelzellverfolgung 10 zu kombinieren.

Jedoch sowohl die Boyden-Kammer / Transwell-Assay und Kratztest / Wundheilungs Assay, sind eher unvollkommen über physiologische artigen zellulären Umgebung. In der Boyden-Kammer / Transwell-Testzellen haben, um durch eine Kunststoffporen wandern, während der Kratztest / Wundheilungs Assay Zellen werden auf einer zweidimensionalen vorbeschichtete Kunststoff-Platte ausgesät. Ebenso ist es allgemein bekannt, dass das Migrationsverhalten unterscheidet sich deutlich zwischen einer zweidimensionalen und 3D Umgebung 3. Zum Beispiel dreidimensionale Matrix Verwachsungen von Fibroblasten unterscheiden Brenn und fibrilläre Adhäsionen gekennzeichnet, daß auf beidendimensionalen Substraten in ihrem Inhalt und α5β1 avb3 Integrine, Paxillin, anderen Zytoskelett-Komponenten und Tyrosin-Phosphorylierung von Focal Adhesion Kinase 14. Ebenso angezeigt Zellen innerhalb einer 3D-Umgebung eingebettet auch ein verändertes Zugverhalten 15. Somit Zellmigration genauer analysieren Migrationsassay wird empfohlen ermöglicht die Migration der einzelnen Zellen in einem 3D-physiologische oder physiologisch-ähnliche Umgebung zu messen.

Intravital Imaging / Mikroskopie ist die Gold-Standard für die Messung der Zellmigration in einer 3D-physiologischen Kontext. Dies gilt nicht nur gehören extrazelluläre Matrix-Zell-Wechselwirkungen, sondern auch die Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen, wie beispielsweise Tumorzellen und Endothelzellen während Extravasation 16 oder Lymphozyten-innerhalb des Lymphknotens 17, welche bis zum heutigen Tag ist möglich durch verbesserte Fluoreszenzmikroskopietechniken, wie beispielsweise 2-PhotonenKonfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wird die Verwendung von lebensFluoreszenzFarbstoffe und transgenen Mausstämme, die fluoreszierende Proteine ​​Derivate 12,16,17. Zusätzlich könnten Intravital Imaging / Mikroskopie mit manuellen und automatisierten Zellverfolgung 18 kombiniert werden. Wegen der Notwendigkeit einer 2-Photonen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie sowie Tiere (und entsprechende transgene Tiermodelle) intravitalen Imaging / Mikroskopie ist jedoch ein recht kostenintensiven Technik.

Um die Einschränkungen der Boyden-Kammer / Transwell-Assay und der Kratztest / Wundheilungs Assay zu überwinden und die Migration von verschiedenen Zelltypen innerhalb einer 3D-Umgebung die 3D-Kollagen-Matrix-Migration-Assay wurde entwickelt 11,19 analysieren. Dadurch wandern Zellen in einer 3D Kollagenfasernetzwerk, das mehrere ähnelt der Situation in vivo eingebettet. Gemeinsam, durch Zeitraffer-Videomikroskopie echten Zellmigration gemessen werden, wodurch die BestimNation von mehreren Migrationsparameter sowie deren Veränderungen in Reaktion auf pro-Migrationsfaktoren oder Inhibitoren. Verschiedene Zelltypen können unter Verwendung dieser Technik, einschließlich Lymphozyten und Leukozyten 11,20, hämatopoetische Stammzellen / Vorläuferzellen 21-24, und Tumorzellen 5,25-29 analysiert werden. Neben den einzelnen Zellen auch Cluster Zelle oder Sphäroiden konnte innerhalb der Kollagenmatrix gleichzeitig mit Analyse der Auswanderung von Einzelzellen aus dem Zellverband / Sphäroid in die Kollagen eingebettet Gitter 30,31 werden.

Dieses Protokoll bietet einen Überblick über eine einfache, aber leistungsfähige Technik, um das Migrationsverhalten von verschiedenen Zelltypen innerhalb einer 3D-Umgebung zu analysieren - ein in vitro-Verfahren ergibt in den Ergebnissen, die in der Nähe der in vivo Situation.

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Protocol

1. Vorbereitung der Migration Chambers

  1. Bereiten Sie eine Paraffinwachs / Vaseline (1: 1)-Mix und Hitze, bis die Mischung geschmolzen ist. Mit Hilfe eines Pinsel und ziehen 2-3 Schichten der Paraffinwachs / Vaseline (1: 1) mischen in der Mitte der Glasträger in Übereinstimmung mit den 1B-1D.
    HINWEIS: Wir sind mit gemeinsamen Glasobjektträger (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / T / H))
  2. Gelten die geschmolzene Paraffin / Vaseline Mischung schnell auf dem Objektträger zu vermeiden, um eine Verfestigung während des Zeichnens. Sicherstellen, dass das Paraffinwachs / Vaseline-Schicht ist etwa 2-2,5 cm lang und 0,3-0,5 cm in der Breite. Die Dicke der Paraffinwachs / Vaseline-Schicht sollte etwa 0,1-0,15 cm.
  3. Fügen Sie ein Deckglas auf dem erstarrten Paraffin / Vaseline-Mix und verschließen Sie diese mit zwei zu drei Lagen Paraffinwachs / Vaseline-Mix (1E, 1F). Verwenden Sie 4-8 Migrationskammern für eine gemeinsame Zellmigration Experiment. Ort Migrationskammern in eine aufrechte Position in einem Rack.

2. Herstellung der Kollagensuspension Zell Mix

  1. Ernte (zB mit 0,25% Trypsin / EDTA) und zählen Zellen von Interesse. Resuspendieren der Zellen in Komplettmedium, das fötales Kälberserum (FCS), Antibiotika und empfohlenen Ergänzungsmittel. Vorbereitung 4-8 1,5 ml Reaktionsgefäße und 20 ul Zellsuspension, die 4-6 × 10 4 Zellen (die Gesamtzahl der Zellen von den Zelltyp zu analysieren) und füllen bis zu 50 ul mit komplettem Medium.
    HINWEIS: Zusätzliche Verbindungen (zB Wachstumsfaktoren, Chemokine, Inhibitoren, etc.) zu der Zellsuspension gegeben. Verwenden Sie geeignete Lager-Lösungen, so dass das endgültige Volumen der Zellsuspension 50 ul nicht überschreiten.
  2. Bereiten Sie eine Gesamtmenge von 452 ul endgültige Kollagensuspension für vier Zellmigration Experimenten. Dann werden 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) und 27 ul 7,5% iger Natriumhydrogencarbonatlösung (pH 9,0-9,5) In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß und gründlich mischen. Beachten Sie die Farbe der Lösung wiederum von gelb-orange bis intensiv violett (pH-Wert 9,0-9,5). Fügen Sie 375 ul Flüssigkeit Kollagensuspension auf die 10x MEM / Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gründlich mischen. Der pH-Wert des fertigen Kollagen Suspension sollte über 7,5 liegen (von einer Licht lila Farbe angegeben).
    Hinweis: Prüfen Sie den pH-Wert der 7,5% Natriumhydrogencarbonat-Lösung. Wenn der pH-Wert etwa 7,5 Ort die Natriumbicarbonatlösung mit offenem Deckel in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2), mit CO 2 gesättigt und der pH-Wert (etwa 9,0 bis 9,5) zu erhöhen. Der pH-Wert der Kollagensuspension Zellmischung ist von entscheidender Bedeutung für die Stabilität des Kollagen-Netzwerk. Wenn sie zu niedrig ist Kollagengitter während der Zellmigration Experiment kollabieren.
    HINWEIS: Für dieses Protokoll verwenden flüssigen Kollagen (pH-Wert 1,9-2,2) aus Rinderhinter (2,9-3,3 mg / ml Kollagen, 95% Kollagen Typ I, 5% Kollagen Typ IV). Beispiele für weitere Kollagengitter Vorbereitung Protokolle mitKollagen Typ I aus anderen Quellen, wie beispielsweise Schweine-oder Ratten, sind in 32,33 gegeben. Die Volumina der eingesetzten Lösungen nicht verändern, da dies die ultimative Kollagen-Konzentration von 1,67 mg / ml des Gitters verändern. Eine höhere oder niedrigere Kollagenkonzentration einen Einfluss auf die Dichte der Collagenfasern und dem durchschnittlichen Abstand zwischen ihnen gleichzeitig mit den Zellen Zugverhalten 34.
  3. 100 l des fertigen Kollagen Suspension auf 50 ul Zellsuspension und mischen thoroughly.The endgültige Kollagensuspension (1,67 mg / ml Kollagen) ist etwas zähflüssig. Um die richtige Menge (100 ul) zu übertragen, Pipette die endgültige Kollagenlösung einmal nach oben und unten vor der Übertragung auf der Zellsuspension.
    Hinweis: Wenn der Kollagensuspension Zellmischung ist mit der 10x MEM / Natriumhydrogencarbonat-Lösung und der pH-Wert auf 7,5 geändert kombiniert die Kollagenfasern sofort zu polymerisieren.
  4. Die Abschlusskollagensuspension Zelle Mix aus the Reaktionsrohre zu den Migrationskammern. Klopfen Sie leicht die Migration Kammer gleichmäßig verteilen die Kollagensuspension Zellmischung auf dem Boden der Migrationskammer (1H). Zeigen die Migrationskammern in einer aufrechten Position in einem Gestell und Inkubation für 30 min (37 ° C, 5% CO 2), um die Polymerisation der Kollagenfasern erlauben.
  5. Beachten Sie, dass die polymerisierte Kollagengitter ist leicht trüb, aber immer noch hell lila Farbe. Füllen die Kammern mit Migrationsvollmedium oder Komplettmedium mit Ergänzungen von Interesse und versiegeln die Migration Kammer mit Paraffinwachs / Vaseline-Mix (Figuren 1I, 1J).

3. Aufnahme und Analyse der Zellmigration

Dieser Abschnitt beschreibt die Aufnahme der Zellmigration durch Zeitraffer-Videomikroskopie und Analyse der Zellmigration durch manuelle Zellverfolgung.

  1. Schalten Sie das Mikroskop und den Mikroskoptisch heater. Einstellen der Temperatur auf 37 ° C. Verwenden Sie einen 10X-Objektiv. Zeigen Migrationskammer unter dem Mikroskop und konzentrieren sich etwa 50 Zellen oder mehr in das Blickfeld.
  2. Rekordzellmigration im Zeitraffer-Modus mit einer Multi-Kamera-Videoüberwachungs-Software-Anwendung. Sparen Zellmigration Filme in einem geeigneten Format, zB "AVI" oder "MOV". Verbinden die Zellmigration Film-Dateien auf einer Datenbank, die unterstützende Informationen, wie Zelltyp und Versuchsbedingungen.
    HINWEIS: Wir verzeichnen Lymphozyten und HSPCs für bis zu 2 Stunden mit einem Zeitraffer-Faktor von 1:80, was bedeutet, dass 0,75 sec im Zeitraffer gleich 1 min in Echtzeit ist. Tumorzellen sind langsam bewegenden Zellen und somit für mindestens 16 h unter Verwendung einer Zeitrafferfaktor 1 aufgezeichnet: 1,800 (0,5 sec in Zeitraffer gleich 15 min in Echtzeit).
  3. Analyse der Zellmigration Filme mit einer geeigneten Zell Tracking-Software-Anwendung, wie ImageJ Software Plugins(Eine Übersicht findet sich in 18 angegeben). Für eine unvoreingenommene Analyse ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Zellen nach dem Zufallsprinzip, ohne das Wissen ausgewählt werden, ob die Zellen sind wandernde aktiv ist oder nicht.
    HINWEIS: Wir sind mit einem selbst entwickelten Software-Anwendung, um die Wege von mindestens 30 Zellen pro Experiment, indem Sie die beweglichen Zellen genau mit dem Maus-Cursor (die in den Zellkern positioniert ist) manuell zu verfolgen. Während Tracking werden die xy-Koordinaten der Zellen verfolgt automatisch in Übereinstimmung mit der verwendeten Zeitraffermodus bestimmt. Für Lymphozyten / HSPCs xy-Koordinaten bestimmt jede 0,75 sec (gleich 1 Echtzeit-min), während für die Tumorzellen xy-Koordinaten werden jeweils 0,5 sec (entspricht in Echtzeit 15 min) bestimmt.
  4. Bestimmen Sie insgesamt 60 xy-Koordinaten pro Zelle für eine typische Zellmigration Experiment. Dies ist gleich 1 h in Echtzeit für Lymphozyten / HSPCs und 15 h in Echtzeit für die Tumorzellen. A "," zeigt an, dass eine Zelle nicht zwischen tw verschobeno Zeitpunkten, wohingegen eine "Zahlenwert" gibt den Abstand in "Pixel" eine Zelle zwischen den Zeitpunkten 2 (2A) bewegt.
    Hinweis: Die manuelle Zellverfolgung erfordert Erfahrung. Besonders schnell wandernden Zellen sind schwer zu verfolgen und zu jeder Zelltyp weisen eine ausgeprägte Wanderverhalten, die ergänzt durch Faktoren ausgelöst werden könnten. Bei der Zellteilung bei der Spurhaltung, zufällig wählen Sie eine Tochterzelle für die Fortsetzung Verfolgung. Zellen, die aus dem Gesichtsfeld wandern oder sterben, während Tracking nicht vernachlässigt werden, sind aber für die Analyse berücksichtigt.

4. Datenanalyse

  1. Analysieren Zelle Tracking-Daten unter Verwendung eines geeigneten Software-Anwendung, beispielsweise ein Tabellenkalkulationsprogramm.
    1. Analysieren Zelle Tracking-Daten, indem Sie die Zelle Tracking Rohdaten (2A), in einen selbst entworfenen Tabellenvorlage. Multiplizieren Summe der "Zahlenwerte", wasdie Gesamtstrecke eine Zelle mit einem Korrekturfaktor, um in die "um" konvertieren "Pixel" migriert.
    2. Bestimmen Sie zwei Zellmigration Parameter: Bewegungsaktivität und Zeit der aktiven Bewegung (2C, 2D) (das entspricht Migrationsrate ist).
    3. Identifizieren Sie die Zellen, die weniger als 25 um (Schwellenwert, um die Zahl der falsch-positiven Zellen zu reduzieren) migriert haben als Nicht-Bewegen-Zellen. Ersetzen Sie "Zahlenwerte" dieser Zellen mit ",".
      HINWEIS: Der Parameter "Bewegungsaktivität" (oder Migrationsrate) stellt den Prozentsatz der Zellen der Zellpopulation verfolgt, die zwischen zwei Zeitpunkten (2D) bewegt haben. A "Zahlenwert" als ein Bewegungs Zelle definiert, während "" ist als nicht bewegenden Zelle definiert. Der Parameter "Zeit der aktiven Bewegung" (aktiv) stellt den Prozentsatz der Gesamtzeit eine Zelle in re migriertnung auf den Zeitrahmen des Beobachtungszeitraums (Abbildung 2C). A "numerischen Wert" zeigt an, dass eine Zelle bewegt, während "" zeigt an, dass eine Zelle nicht bewegt hat. Dieser Parameter wird ferner verwendet, um die Anzahl der Zellen, die sich nicht bewegt hat bestimmen.
  2. Berechnen statistischer Signifikanz und Anzeigezelle Migrationsdaten.
    1. Berechnen Sie die statistische Signifikanz der mittleren Bewegungsaktivität der Zellen (Migrationsrate) unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Test. Betrachten p-Wert <0,05 als signifikant.
    2. Zeigen Sie die mittlere Bewegungsaktivität der Zellen als xy-Diagramm, Boxplot-Diagramm oder als Balkendiagramm. Anzeige Einzelzellbasis Daten wie Zeit der aktiven Bewegung oder Geschwindigkeit, als Balkendiagramm-Diagramm oder als Histogramm.
      HINWEIS: Wenn die gewählte Tabellenkalkulationssoftware Anwendung keine Boxplot Diagramm oder Histogramm-Diagramm-Tool enthält eine Online-Suche sollte für die Suche nach geeigneten tu durchgeführt werdentorials.

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Representative Results

Das verwendete 3D-Kollagen-Matrix kombiniert mit Migrationsassay Zeitraffer-Video-Mikroskopie und computergestützte Zellverfolgung erlaubt die Bestimmung verschiedener Parameter einschließlich Zellmigration sowohl populationsbasierte Parameter (zB bedeuten, Bewegungsaktivität) und Einzelzellbasis Parameter (zB Zeit der aktiven Bewegung, Geschwindigkeit, Entfernung migriert). Ein Beispiel der erhaltenen Zellverfolgungsdatensätze, Datenverarbeitung und Datendarstellung in Figur 2 wiedergegeben. Zellverfolgungsdatei ähnelt einer Tabelle (Figur 2A). Jede Spalte steht für einen Raupenzelle, wobei pro Zellmigration Experiment 30 Zellen verfolgt. Die Zeilen enthält die Information, ob eine Zelle sich bewegt hat oder nicht zwischen zwei Zeitpunkten. Die Summe der "Zahlenwerte", der die Entfernung in "Pixel" eine Zelle zwischen zwei Zeitpunkten bewegt wird, ist der Gesamtabstand dieser Zelle migriert. Es wird durch Wechselstrom multipliziertorrection Faktor, der "um" konvertieren "Pixel". Zellen, die weniger als 25 um gewandert sind, als nicht bewegenden Zellen definiert, die Anzahl von falsch-positiven Zellen zu reduzieren. Die Geschwindigkeit (um / min) von jeder Zelle wird durch Dividieren "Gesamtabstand migriert" von "Gesamtzeit (min) der Beobachtungszeit" berechnet.

Um die Bewegungsverhalten von Zellen häufig zwei Parameter verwendet werden zu charakterisieren. Bewegungsaktivität (2D) stellt den Mittelwert Bewegungsaktivität (oder Migrationsrate) des analysierten Zellpopulation, während der Zeit der aktiven Bewegung (2C) stellt die Gesamtzeit eine Zelle innerhalb des Beobachtungszeitraums migriert. Der letztgenannte Parameter wird ferner verwendet, um die Anzahl der Zellen, die sich nicht bewegt hat bestimmen. Der Grund für die Verwendung von zwei Zellmigration Parameter für die Analyse ist die Tatsache, daß die Bewegungsaktivität der Zellen kann durch differe ausgelöst werden zugent-Mechanismen. Es gibt drei Möglichkeiten, wie beispielsweise einen Wachstumsfaktor, kann "induzieren" Zellmigration: a) im Vergleich zur Kontrolle mehr Zellen wandern, b) die Anzahl von sich bewegenden Zellen im Vergleich zur Kontrolle nicht geändert hat, sondern Wachstumsfaktor behandelt Zellen eine erhöhte Zeit der aktiven Bewegung, was bedeutet, dass diese Zellen für eine längere Zeit zu migrieren, und c) eine Kombination von a) und b).

Das Diagramm in Abbildung 2B schematisch dargestellt, wie der Bewegungsaktivität und Zeit der aktiven Bewegung berechnet. In diesem Beispiel die Wanderaktivitäten von 120 Zellen (die gleich vier unabhängigen Experimenten ist) werden angezeigt. Jeder Diamant anzeigt, dass eine Zelle zwischen mindestens zwei Zeitpunkten bewegt wird (unabhängig von der Entfernung der Zellen gewandert!). Die grauen Linien wurden in diesem Diagramm eingetragen, um zu zeigen, dass die analysierten Zellpopulation besteht aus beweglichen und unbeweglichen Zellen. Der Parameter "LOCOMotory Aktivität "für die lokomotorische Aktivität der untersuchten Zellpopulation in Abhängigkeit von jedem Zeitpunkt (Figur 2D). Zum Beispiel kann ein Bewegungsaktivität von 10% bei t = 5 h zeigt an, daß zwischen t = 4,45 h und t = 5 h 10% der analysierten Zellen bewegt. Wenn sie als xy-Diagramm dargestellt die Parameter Bewegungsaktivität zeigt die dynamicity des analysierten Zellpopulation. Eine andere Möglichkeit, um die Bewegungsaktivität einer Zellpopulation Display ist das Boxplot-Diagramm (Abbildung 2f).

Der Parameter "Zeit der aktiven Bewegung" (aktiv) ist, um die Gesamtzeit einer Zelle während der Beobachtungsperiode bewegt hat, korreliert, wobei ein aktiv "0" zeigt an, dass eine Zelle nicht bewegt (Figur 2C). Die Zeit der aktiven Zellen können als ein Histogramm dargestellt werden.

Das Zusammenspiel von EGFR / HER2 / PLC-γ1 und HER2 / HER3- / PI3K Signal trägt zu einerMigrations Phänotyp der EGFR / HER2 / HER3- positiven Brustkrebszellen 25. PI3K-Signalisierung wird für die Erzeugung von Phosphatidyl-3,4,5-triphosphat (PIP3), die als Ankermolekül für PLC-1 wirkt erforderlich, wodurch dieses Enzym an der Plasmamembran zu rekrutieren, die von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, 35 aktiviert werden. Stimulation des EGFR ausschließlich positive MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) Brustkrebs-Zellen führte zu langfristigen PLC-γ1 Tyrosinphosphorylierung gleichzeitig mit anhalt IP3 und DAG Ebenen Herstellung sinusförmige Schwingungen Calcium 27. Dagegen EGFR / HER2-positivem MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2)-Brustkrebszellen angezeigt Basis transienten Calcium Schwingungen nach EGF-Behandlung durch kurzfristige PLC-γ1 Tyrosin Aktivierung und kurzfristige IP3 und DAG Umsatz 27 angibt, dass HER2-Expression wurde auf eine Differenz PLC-γ1 Kinetik und Signalisierung korreliert.

Analyse der Migrationsverhalten von MDA-HER2-und MDA-NEO Brustkrebs-Zelllinien zeigte, dass beide Zelllinien zeigten eine ähnliche spontane Bewegungsaktivität (MDA-HER2: 23,0-28,9%, Median: 26,7% vs MDA-NEO: 19,3-24,4%, Median: 21,5%; 3A-3D ). Die Parameter Zeit aktiv, was die Zeit der aktiven Bewegung der einzelnen Zellen in Bezug auf den Beobachtungszeitraum ergab eine etwas höhere Anzahl von spontan bewegen MDA-HER2-Zellen (64%, 3E) verglichen mit MDA-NEO-Brustkrebszellen ( 53%; 3F). Stimulation mit 100 ng / ml EGF führte zu einer signifikant erhöhten motorischen Aktivität beider Zelllinien. Die migratorische Aktivität von EGF behandelten MDA-HER2 auf 30,4 angehoben - 35,2% (Mittelwert 33,7%; 3A, 3C), die sowohl zu einer erhöhten Anzahl von sich bewegenden Zellen (100 ng / ml EGF zurückgeführt wurde: 81% gegenüber Kontrolle: 64%) und eine erhöhte Zeit der aktiven Bewegung. Zum Beispiel kann die Menge an MDA-HER2 Zellen, die gleichzeitig aktiv von 40%bis 28% (100 ng / ml EGF) erhöhte sich von 20% (Kontrolle). (, 3B, 3D Median 30,4%) nach EGF Stimulation Ähnliche Daten wurden für die MDA-NEO-Brustkrebszellen, die migratorische Aktivität wurde auf 25,2 bis 35,2 erhöht erhalten. Gemeinsam weiter MDA-NEO-Zellen in Reaktion auf EGF Stimulation migriert (100 ng / ml EGF: 66% gegenüber Kontrolle: 53%) und zeigte eine verschobene Zeit aktiv Muster (3F). Zum Beispiel kann die Menge der Zellen mit einer Zeit aktiv von 60% deutlich auf 30% in der Gegenwart von EGF im Vergleich zu unbehandelten MDA-NEO-Zellen (13%) erhöht.

Behandlung von MDA-HER2-und MDA-NEO-Brustkrebszellen mit dem PLC-γ1-Inhibitor U73122 ergab eine Hemmung sowohl der spontanen und EGF induzierte Migration der Zellen (3A-D). Gegenüber MDA-NEO-Brustkrebszellen die hemmende Wirkung von U73122 auf die spontane Migration von MDA-HER2 Zellen war jedoch eher moderat, aber dennochsignifikant (Kontrolle: 23,0 bis 28,9%, Median: 26,7% vs 2 uM U73122: 17,8-21,5%, Median: 20,0%; 3C). Analyse der Parameter aktiv zeigte eine leicht erhöhte Menge an nicht-beweglichen Zellen in Gegenwart von U73122 (Kontrolle: 36% gegenüber 2 uM U73122: 48%; 3E). Ebenso U73122 Behandlung blockiert den EGF induzierte Migration von MDA-HER2-Brustkrebs-Zellen (100 ng / ml EGF: 30,4-35,2%, Median 33,7% vs 100 ng / ml EGF + 2 uM U73122: 19,3-24,1%, Median 22,6 %, 3C). Gemäß U73122 allein behandelten MDA-HER2 Zellen dieser inhibitorische Effekt war nicht zu einer erhöhten Menge an nicht bewegenden Zellen zurückzuführen, nicht aber eine geänderte Zeit aktiv Muster (3C). In der Tat, eine leichte Verschiebung hin zu einem erhöhten Zeit der aktiven Bewegung war bei der Migration MDA-HER2-Zellen mit EGF und U73122 (3C) behandelt nachweisbar.

Im GegensatzBehandlung von MDA-NEO-Zellen mit 2 uM U73122 ergab eine deutlich verringerte lokomotorische Aktivität von 5,6 bis 10,7% (Mittelwert: 9,3%, 3F), die vor allem auf eine erhöhte Menge an nicht-bewegenden Zellen (Kontrolle zurückgeführt wurde: 47% gegen 2 uM U73122: 79%; 3F). Ebenso kann die EGF induzierte Migration von MDA-NEO-Brustkrebszellen wurde deutlich durch U73122 1,1 blockiert 7,4% (Median: 4,8%), was zu einer erhöhten Menge an nicht bewegenden Zellen (100 zurückgeführt wurde ng / ml EGF: 34 % gegenüber 100 ng / ml EGF + 2 uM U73122: 70%) als auch zu einer verringerten Zeit aktiv Muster (3F).

Figur 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von Zellmigrationskammern. (AE) Ein Zellmigration Kammer wird durch Zeichnung zwei zu drei Lagen eines geschmolzenen paraffi vorbereitetn Wachs / Vaseline auf einen Glasträger mischen. (F, G) Ein Deckglas wird hinzugefügt und mit geschmolzenem Paraffin / Vaseline Mischung abgedichtet. (H) Der Migrationskammer in einer aufrechten Position, gefolgt von Zugabe des Kollagen-Zelle gebracht Aufhängung. Anschließend wird die Migration Kammer in einem Inkubator ermöglicht das Kollagen-Zellsuspension zur Polymerisation gebracht. (I, J) ist die Migration Kammer mit Medien gefüllt und mit geschmolzenem Paraffin / Vaseline Mischung verschlossen auf der vierten Seite. Danach werden Migrationskammern unter einem Mikroskop gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Zellmigration Datenanalyse. (A) Zell Tracking-Daten-Datei. ThE Migrationsaktivitäten von 30 Zellen pro Experiment bestimmt, wobei 60 Zeitpunkten analysiert. A "," zeigt an, dass eine Zelle nicht zwischen zwei Punkt bewegt, wohingegen eine "Zahlenwert" zeigt die Zellbewegung. (B) In diesem Diagramm ist eine schematische Ansicht des in (A) gezeigten Daten. Jeder Diamant zeigt, dass ein zwischen zwei Zeitpunkten bewegt wird; eine Linie gibt mehr Bewegung. Die grauen Linien wurden aufgenommen, um zu visualisieren, dass die Zellpopulation besteht aus unbeweglichen und beweglichen Zellen Zellen (die jedoch machen Pausen). (C) Zeit der aktiven Bewegung (aktiv) stellt den Prozentsatz der Gesamtzeit eine Zelle bezogen auf die Gesamtzeit des Beobachtungszeitraums migriert. Ein aktiv von 20% und einer Gesamtzeit von 15 h zeigt, daß diese Zelle in insgesamt 3 h bewegt wurde. Dieser Parameter wird ferner verwendet, um die Anzahl der sich nicht bewegenden Zellen, die äquivalent zu einer Zeit aktiv von 0% zu bestimmen. (D) (E) Alternativ kann die Bewegungsaktivität der untersuchten Zellen als Boxplot-Diagramm angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Repräsentative Zellmigrationsdaten MDA-HER2-und MDA-NEO-Brustkrebszellen. Die Zellen wurden mit 100 ng / ml EGF behandelt, 2 uM U73122 oder mit einem Co mbination von beiden. (A, B) Mittlere lokomotorische Aktivität von MDA-HER2 (A) und MDA-NEO (B-Zellen) in Abhängigkeit der Zeit. (C, D) Boxplot Diagramm der mittleren Bewegungsaktivität, die die 2 h auf 13 h Zeitintervall (siehe bar in (A, B)) von MDA-HER2-(C) und MDA-NEO (D)-Zellen. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Mann-Whitney-U-test berechnet. *** = P <0,001. (E, F) in der Histogramm Plot der aktiv von MDA-HER2 (E) und MDA-NEO (F) Zellen. Eine Zeit aktiv von 0% zeigt an, dass die Zellen nicht während des Beobachtungszeitraums bewegt. Gemeinsam, eine Zeit, aktiv von 20% gibt an, dass, wenn man bedenkt einer Beobachtungszeit von 15 Stunden wurden diese Zellen für bis zu 3 Stunden bewegt. Dargestellt sind der Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten.blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Fähigkeit zur Migration ist ein Markenzeichen von Tumorzellen 4. Ohne die Fähigkeit, aus dem Primärtumor zu lösen und durch die umgebende Bindegewebe Tumorzellen wandern können keine Sekundärläsionen, die die Hauptursache für Tod fast aller Krebspatienten zu beimpfen. Wegen dieser Beziehung viele Studien konzentrieren sich auf die Krebszellmigration. Das Ziel dieser Studien ist die Identifizierung neuer Zielmoleküle und die Zielwege, die effektiv blockieren Tumorzellmigration, wodurch Beeinträchtigung oder Verlangsamung der Metastasenbildung. Ein Beispiel für eine solche Anstrengung könnte β-Blocker, die gezeigt haben, um die Metastasen hemmen Ausbreitung von Brustkrebszellen in vitro und in vivo 36 und die haben mit einem verbesserten rezidivfreien Überlebens bei Patienten mit Triple-negativem Brustkrebs in Verbindung gebracht werden Krebszellen 37. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Hybridzellen, die aus spontane abgeleitetOrganisationseinheiten Fusionsereignisse zwischen einer menschlichen Brust epithelialen Zelllinie und einer menschlichen Brustkrebszelllinie, nicht aber die Elternzellen, hat der Chemokin CCL21 mit einer erhöhten Aktivität Migrations 26. CCL21 ist mit Lymphknotenmetastasen Bildung von verschiedenen Krebsarten, darunter Brust-38 in Verbindung gebracht worden, was darauf hindeutet, dass die Zellfusion könnte ein Verfahren, wie Tumor (Hybrid)-Zellen könnte metastasierten Eigenschaften 39,40 zu erwerben.

Die 3D-Kollagen-Matrix-Migrationstest hat mehrere Vorteile im Vergleich zu der Boyden-Kammer / Transwell-Assay und der Kratztest / Wundheilungstest. Zunächst werden die Zellen in einer 3D Umgebung physiologischer eingebettet. Wie oben angegeben aus, das Migrationsverhalten von Zellen unterscheidet sich deutlich zwischen einer zweidimensionalen und 3D-Umgebung 3,14,15. So kann der Schluss gezogen werden, dass die Migrationsverhalten von Zellen in einer 3D-Kollagen-Gitter eingebettet ähnelt mehr auf die in vivo Situation als die LOCOMotory Aktivität von Zellen kriechen auf einer zweidimensionalen Oberfläche. Zum anderen wird durch Zeitraffer-Videoaufnahme ist es möglich, die Migration von mehreren Zellen über einen bestimmten Zeitrahmen, der die Bestimmung verschiedener Parameter ermöglicht die Zellmigration zu analysieren. Dagegen in der Boyden-Kammer / Transwell-Assay nur diejenigen Zellen, für die Analyse, die zu der unteren Kammer bewegt berücksichtigt. Jene Zellen, die eine Migration zB auf der Oberseite der Membran werden nicht in der Datenanalyse, auch wenn sie aktiv sind Wanderungs enthalten.

Die 3D-Kollagen-Matrix mit mikrofluidischen Vorrichtungen kombiniert werden, die neben der Nachahmung der extrazellulären Matrix müssen auch die interstitielle Flüssigkeit, die gezeigt worden ist, um die Morphologie und die Migration von verschiedenen Zelltypen, wie Fibroblasten, Krebszellen, Endothelzellen beeinflussen nachahmen und mesenchymalen Stammzellen 41. Daten von Haessler et al. Ergab, dass interstitielle Strom erhöht den Prozentsatzvon Zellen, die Migrations werden sowie erhöht die Migrationsgeschwindigkeit in etwa 20% der Zellen 42. Neben der chemotaktische Verhalten von Zellen, zB Leukozyten / Lymphozyten oder Tumorzellen zu untersuchen, ist ein 3D-Mikrofluid-Einstellung auch ein geeignetes Werkzeug, um Tumorzellen und Endothelzellen Intravasation Barrierefunktion 43 studieren.

Obwohl die 3D-Kollagen-Matrix-Migrationstest ist ein geeignetes Werkzeug, um die Wanderung von Zellen in Reaktion auf einen Reiz oder einem Inhibitor oder einer Kombination von beiden es analysieren zu beachten, dass dieser Assay tun hat auch einige Einschränkungen. Beispielsweise wird nur Kollagen Typ I zur Nachahmung der extrazellulären Matrix, die jedoch eine komplexe Mischung aus verschiedenen Komponenten, einschließlich Proteoglycanen, nicht-Proteoglycane (beispielsweise Hyaluronsäure), Kollagenfasern, wie Fibronectin und Laminin, die verwendet Zusammensetzung weiter variiert deutlich zwischen den verschiedenen Bindegewebe in verschiedenen Organen 45 gleichzeitig mit einem Differenz Ergebnis führen kann. Zum Beispiel, β1-Integrin-Stimulation verursacht die Aktivierung von ERK in Monozyten, während β2-Stimulation nicht 46. Ebenso PI3K wurde für β1-Integrin benötigt, aber nicht β2-Integrin-vermittelte NF-kB-Aktivierung 46. Auf der anderen Seite, ist Kollagen Typ I das häufigste Kollagen im menschlichen Körper 47 darauf hindeutet, dass die Migration der Zellen wird hauptsächlich durch dieses Kollagen Typ ausgelöst.

Ein weiterer kritischer Punkt bei der Entschlüsselung die Zellen Migrationstätigkeit ist die Zelle Trackingverfahren. Um gültige und objektive Daten zu erhalten, ist es zwingend erforderlich, dass der Weg der einzelnen Zellen genau analysiert. Zellverfolgung wird manuell per Hand, die Zellverfolgung Erfahrung verlangt geführtobjektive Daten zu erhalten. Um die Daten weiter zu verbessern und eine kritische Anzahl von falsch-positiven Zellen zu vermeiden wir mit einem Cut-off-Wert von 25 um, was bedeutet, dass Zellen, die gewandert sind weniger als 25 um wurden aus der Datenanalyse ausgeschlossen. Ebenso werden die Zellen nach dem Zufallsprinzip für die Verfolgung, ohne das zu wissen, ob sie Migrations aktiv ist oder nicht zu verzerrten Daten zu vermeiden sind gewählt.

In den letzten Jahren mehrere automatisierten Zell Tracking-Software-Anwendungen entwickelt worden, wobei einige von ihnen sind geeignet, zu analysieren Zelle und Partikelverfolgung in einer 3D-Einstellung 18. Der Vorteil einer solchen Anwendungen ist, dass die Migration Zellen wirklich in einer objektiven Art und Weise analysiert. Aufgrund der, dass es interessant wäre, um automatisierte Zell Tracking-Daten mit manuell hergestellt Zelle Tracking-Daten zu vergleichen.

Wie oben erwähnt, um das Gold-Standard-Zellmigration in einer 3D-physiologischen Kontext zu analysieren ist die Verwendung von Intravital Bildgebung kombiniert wiTh 2-Photonen-Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie. Der Vorteil dieses Tests ist, dass migrierende Zellen werden in ihrer physiologischen Umgebung, bestehend aus bestimmten löslichen Faktoren, Hormone usw., extrazellulären Matrixkomponenten sowie Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen eingebunden. Es ist bemerkenswert, um Filme zu zeigen, wie Lymphozyten werden in einem Lymphknoten 17, wie Immunzellen miteinander kommunizieren 48 oder Menschenhandel zu sehen, wie Medikamente in vivo bei einer Einzelzellebene 12,49 verteilt.

Jedoch intravitalen Bildgebung mit 2-Photonen-Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie in Kombination ein ziemlich kosten teure Technik aufgrund der Notwendigkeit einer angemessenen Mikroskop und geeigneten Tiermodellen. Ebenso ist es nicht wirklich geeignet, um den Einfluss der einzelnen löslichen Faktoren / Inhibitoren auf die Migration von bestimmten Zellen oder der Analyse von Zellmigrations Signaltransduktionskaskaden zu studieren. Für diese Zwecke Zelle migration Assays empfohlen ermöglicht die Analyse von einzelnen Zelltypen, die weiter modifiziert werden können, beispielsweise Überexpression oder Knockdown von Zielmolekülen, in definierten experimentellen Bedingungen. Aufgrund der Schwenk Beziehung zwischen einer 3D-Umgebung und des Bewegungsverhaltens von Zellen schließen wir, dass die 3D-Kollagen-Matrix-Migrationstest ist daher ein vielseitiges Verfahren, um die Migration von Zellen in einem in vitro-Einstellung, die nahe an der in vivo Situation zu untersuchen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

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Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix
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Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,… More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

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