Summary
Cellodlingsmodeller ger detaljerad kontroll över miljöförhållanden och därmed ge en kraftfull plattform för att belysa många aspekter av neuronal cellbiologi. Vi beskriver en snabb, billig och tillförlitlig metod för att isolera, dissocierar, och kultur sensoriska neuroner från kycklingembryon. Uppgifter om substrat förberedelse och immunocytokemi finns också.
Abstract
Nervceller är mångfacetterade celler som bär information som är väsentlig för en mängd olika funktioner, inklusive sensation, motor rörelse, inlärning och minne. Att studera nervceller in vivo kan vara en utmaning på grund av sin komplexitet, sin varierade och dynamiska miljöer, och tekniska begränsningar. Av dessa skäl kan studera nervceller in vitro vara till nytta för att lösa de komplexa mysterier nervceller. Den väldefinierad karaktär cellodlingsmodeller ger detaljerad kontroll över miljöförhållanden och variabler. Här beskriver vi hur man isolera, separera och kultur primära neuroner från kycklingembryon. Denna teknik är snabbt, billigt och alstrar kraftigt växande sensoriska neuroner. Förfarandet genomgående producerar kulturer som är högt anrikade för neuroner och har mycket få icke-neuronala celler (mindre än 5%). Primära nervceller fäster inte bra på obehandlat glas eller vävnadsodlingsplast, därför detaljerade förfaranden för att skapa två Distinct, väldefinierade laminin-innehållande substrat för neuronal plätering beskrivs. Odlade nervceller är mycket mottagliga för flera cellulära och molekylära tekniker, inklusive co-immunoprecipitation, levande cell fantisera, RNAi, och immunocytokemi. Rutiner för dubbel immuncytokemi om dessa odlade nervceller har optimerats och beskrivs här.
Introduction
Nervceller är komplexa celler som bär information som är väsentlig för en mängd olika funktioner, inklusive känsla, syn, motor rörelse, inlärning och minne. Unikt från andra celltyper, neuroner sträcker armliknande processer, kallade axoner, för att bilda eter neurala motorvägar för kommunikation. Under utvecklings specialiserade fack placerade vid spetsarna på växande axoner, som kallas tillväxt kottar, navigera genom en konsert av extracellulära signaler att leda axonet till dess rätt destination. De intrikata molekylära mekanismer som ligger bakom tillväxten konen navigation är inte helt klarlagda. För att bättre förstå dessa mekanismer har forskare använt cellodlingsmodeller för att studera nervceller i en definierad och förenklad in vitro miljö. Studera nervceller i kultur 1 har lett till betydande framsteg i vår förståelse av neuronal cellbiologi inklusive: neuronal differentiering 2, cytoskelettala dynamik, endocytos och människohandel, dendritereglering 3,4, axonal regenerering 5 och kliniska tillstånd såsom neuropatier 6. Dessutom odlade nervceller är mycket mottagliga för en rad olika forskningsmetoder inklusive immuncytokemi, cellytan co-immunoprecipitation, Western blot, transfektion, RNAi, och levande avbildning som Timelapse analys av tillväxten konen motilitet. Således odling primära neuroner är en kraftfull metod för att belysa många aspekter av cellbiologi av nervceller.
Den cellodlingsmodell ger utredare med detaljerade kontroll över miljöförhållanden och variabler. Till exempel kan det substrat som nervceller pläterade (och växa på) lätt manipuleras. Här ger vi detaljerade instruktioner för att generera två olika substrat, en med en låg laminin-1 koncentrationen och den andra med mättande koncentrationer av laminin-1. Överraskande, kan olika koncentrationer av samma molekyl har dramatiska effekterpå det interna tillståndet av neuroner liksom deras cellyta kompositionen. Exempelvis intracellulära nivåer av cAMP och yta nivåer integriner är signifikant olika i nervceller pläterade på dessa två substrat 7,8. Ytterligare studier har visat att andra molekyler inklusive fibronektin och kondroitinsulfatproteoglykaner, inverkan uttrycket av cellytmolekyler och neuronal motilitet 7-11. Dessutom lösliga molekyler såsom neurotrofiner och neurotropins också påverka cellmembransammansättning och neuronal motilitet 12-16 och kan enkelt och noggrant manipuleras i en cellodlingsmodell.
Här beskriver vi metoder för att isolera och kultur dissocierade sensoriska neuroner från kycklingembryon. Detta förfarande har använts för att göra betydande genombrott i neurobiologi, inklusive axon utväxt 5,7,8,10,11,16-21 och modifierades från ett förfarande som syftar till att isolera ganglieceller 22. Det finnsflera fördelar med detta tillvägagångssätt. Först många funktioner i chick dorsalrotganglia (DRG) utveckling väl karakteriserade inklusive tidsramen för födelse, axon förlängning, och proteinuttryck profiler 2,23-28, vilket ger en lärorik grund att bygga informativa in vitro experiment. För det andra, dissocierade neuronala kulturer möjliggöra för forskaren att mer direkt studera neuroner jämfört med alternativa tillvägagångssätt som utnyttjar intakta DRG-explantat (som innehåller neuroner och icke-neuronala celler) och / eller blandade kulturer innehållande både dissocierade neuroner och icke-neuronala celler. För det tredje är det förfarande som beskrivs här okomplicerat, billigt och mottaglig för studenter. Därför kan denna teknik användas för forskning och för undervisningsändamål. Dessutom bör mindre ändringar av detta protokoll tillåter snabb, hög avkastning rening av nervceller från andra än DRG källor. Till exempel kan detta förfarande modifieras för att ge neuronalt Enriched kulturer från andra vävnader såsom embryonala framhjärnan eller ryggmärgen.
Immuncytokemi protokoll har optimerats för dessa dissocierade neuronala kulturer och beskrivs i detalj här. Förfarandet för dubbla immunocytokemi mot neural celladhesionsmolekyl (NCAM) och β1 integriner tillhandahålls. Data som genereras från dessa immunocytokemiska metoder har använts för att undersöka den rumsliga mönstring och intensiteten av flera molekyler i odlade nervceller 8,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Cover Förberedelser: Acid Wash och baka
- Minst 2 dagar före dissektion (steg 2), börjar följande steg för att förbereda täckglas. Utför syratvättsteg för att avlägsna oljor och rengör täck.
- Lasttäckglas i porslin hållare som vertikalt positionerar täck och hindrar dem från att röra varandra. Sänk hållaren och täckglas i glas histologi behållare fylld med 2 M saltsyra (HCl). Alternativt, om porslinshållare inte är tillgänglig, sprida ~ 20 täckhorisontellt för att täcka botten på 100 mm glas petriskål och dränka täckglas i 2 M HCl.
- Placera glaskärl (med täckglas nedsänkta i syra) på vippan tabell i dragskåp och tillåta försiktig skakning under åtminstone 5 h vid rumstemperatur. Alternativt täcksyratvätt natten under samma förhållanden.
- Tvätta täckglas med destillerat H2O (dH 2 O) genom att överföra porslinshållare laddadmed täckglas från 2 M HCl till ett rent glas histologi behållare fylld med dH 2 O. Alternativt, häll 2 M HCl från glas petriskål med täckglas och fyll på med dH 2 O.
- Tvätta genom dekantering dH 2 O igen och påfyllning glaskärl med färsk dH 2 O. Upprepa för totalt 3 snabba tvättar.
- Börja längre tvätt regim genom att returnera glaskärl (med täckglas och dH 2 O) på rocker. Tillåt för försiktig omröring under 10-30 minuter vid rumstemperatur. Sedan, häll dH 2 O och lägg färska dH 2 O. Upprepa för totalt minst tio tvättar. Alternativt, fortsätt tvätta natten.
- Placera tvättade täck i ugn förvärmd till 350 ° C. Om du använder porslinshållare, ta bort hållaren från dH 2 O fyllda glasbehållare och sedan placera hållare med täck direkt in i ugnen. Om du använder ett glas petriskål, häll dH 2 O och placera glasskål med täckglas i furnace.
- Grädda täck i minst fem timmar eller över natten vid 350 ° C.
- Efter gräddningen är klar tar täck från porslinshållare med fin pincett och placera i steril 100 mm glas petriskål. Lämna täck som inte ursprungligen placerats i porslinshållare i glaset petriskål.
2. Chick Dissection och isolering av DRG
- Ta bördiga, iscensatt Vit Leghorn hönsägg från inkubator (hölls vid 37-38,5 ° C med försiktig skakning).
OBS: Tidigare studier har använt embryonala dag 7-10 för isolering av DRG 2,8,11-13,16. - Placera markerade ägg i laminärt flöde huva. Genomför alla förfaranden som anges nedan under aseptiska förhållanden i laminärt flöde huva med sterila lösningar och instrument. Pre-varma alla lösningar i ett 37 ° C vattenbad.
- Spricka ägg och placera innehållet i en plast 100 mm petriskål. Använd standard pincett för att överföra embryot till en annan 100 mm petriskål.
- Tillsätt varmt F12HS10 (Hams F12, 10 mM HEPES, 100 enheter / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 10% fetalt bovint serum) till skålen med pasteurpipett för att hålla vävnad våt. Använd pincett för att placera embryot på ryggsidan (Figur 1A).
- Placera 100 mm plast petriskål med embryonal vävnad på en kikare Stereo dissekera mikroskop i laminärt flöde huva. Använd fin pincett för att göra en vertikal mittlinjen snitt från svansen till halsen genom att nypa av utvecklings dermis att exponera hjärta, lungor och andra organ. Alternativt, gör en serie små tårar att exponera inre organ.
- Försiktigt använda 2 uppsättningar sterila fin pincett för att a) ta tag i halsen och b) ta tag i kroppspulsådern eller annan vävnad närmast över hjärtat och dra mot svansen,urtagning djuret.
- Applicera varm F12HS10 med pasteurpipett till vävnad. Använd pincett för att avlägsna eventuella kvarvarande kardiovaskulära, respiratoriska eller matsmältningsorgan att exponera utvecklings revben, ryggrad och DRG (figur 1B-1D).
- Enligt dissekera mikroskop, använd fin pincett för att ytterligare ta bort organ och samla DRG längs båda sidor av ryggradens ryggraden, sämre än revbenen. Samla DRG genom plockning intakta DRG från embryot. Nyp och kapa rötterna som når från DRG mot ryggmärgen och gripa utvecklings nerv som sträcker sig från DRG mot periferin eller vice versa.
- Placera intakta DRG i en 35 mm odlingsskål fylld med varmt F12HS10. Ta bort överflödigt vävnad, till exempel rygg eller ventrala rötter som kan ha anslutit sig till DRG, från de intakta DRG i 35 mm skål genom att nypa med fin pincett.
- För att få DRG överlägsna i svanken, ta bort den ventrala halvan av bröstkorg och Cervical ryggrad. Detta görs genom att göra ett snitt i utvecklings ryggraden vinkelrätt mot ryggmärgen axeln i halsregionen och ett annat klipp i den övre ländryggen. Sedan gör nedskärningar parallellt med ryggmärgs axel längs höger och vänster sida av ryggraden. Lyft den ventrala delen av ryggraden från embryot, vilket exponerar exponerar ryggmärgen (figur 1E-1F).
- För att ge enkel tillgång till DRG, ta bort bröstkorg och livmoderhalscancer ryggmärgen genom att ta tag i ryggmärgen med fin pincett. Använd pincett för att lyfta ryggmärgen ur ryggraden. Som en approximation är bröst ryggmärgen vid nivån av ribbor och det cervikala området är överlägsen revbenen.
- Samla intakt bröstkorg och livmoderhalscancer DRG med fin pincett och placera dem i varmt F12HS10 med andra DRG. Ta bort överflödig vävnad som kan ansluta sig till DRG.
- Skölj insidan av ett nytt glas pasteurpipett med F12HS10 att hjälpahindra DRG fastnar på väggar av pipett. Använd sköljas pipett för att överföra alla DRG och F12HS10 från små petriskål till en steril 15 ml koniska rör och omedelbart vidare till steg 3.
OBS: Ytterligare embryon kan dissekeras för att öka antalet DRG. DRG bör hållas i F12HS10 vid 37 ° C tills redo för steg 3.
3 Dissociation, berikande och Odling DRG nervceller - Del 1
- Placera koniska rör med intakta DRG i centrifug och försiktigt snurra (200 xg) i 2-3 min. Kontrollera att DRG har sjunkit till botten av röret. Om inte, snurra igen.
- Med pipett försiktigt bort F12HS10, lämnar DRG pellets ostört. Tillsätt 2 ml 1x kalcium och magnesium fri (CMF) PBS, dislodging pelleten av DRG. Snurra igen och ta bort CMF PBS medan DRG pellets intakt. Upprepa detta tvättsteg för totalt tre tvättningar för att avlägsna fetalt bovinserum i F12HS10, som skulle interferera med trypsin digestion i nästa steg.
- Tillsätt 2 ml värmdes trypsin till 15 ml rör innehållande 2 ml CMF PBS och DRG. Placera röret i 37 ° C vattenbad i 10 till 15 min för att smälta DRG i dissocierade celler.
- Under inkubation, gör F12H + kosttillskott som innehåller media (Hams F12, 10 mM HEPES 100 enheter / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamin och N2) och varm i 37 ° C vattenbad. Typiskt 10 ml totala medie är tillräckligt för 4-5 35 mm skålar av primära sensoriska neuroner. Börjar även upptining laminin-1 för beläggning täck (steg 4).
- Försiktigt Mal sönder DRG i trypsinlösning med P1000 pipett och visuellt inspektera för frånvaro av intakta DRG. Fortsätt finfördelning tills intakta DRG inte längre ses av ögat och / eller tillåta längre trypsin inkubation i 37 ° C vattenbad tills intakta DRG dissocieras. För att skydda DRG nervceller från skador, undvika luftbubblor under rivning och begränsa trypsindigerering till <30 min.
- Centrifuge rör innehållande dissocierade DRG och trypsin vid 200 xg under 3-5 min för att bilda pellets. Spin längre om det behövs tills pellet bildas.
- Aspirera försiktigt trypsin utan att störa pelleten. Tillsätt 2 ml F12HS10 att pelle. Mal sönder försiktigt DRG med P1000 pipettspets.
- Överför allt innehåll från 15 ml koniska rör i 100 mm odlingsskål. Skölj röret med 8 ml F12HS10 och överföra den till odlingsskålen, 2 ml i taget för totalt 10 ml. Detta sköljningssteg bidrar till att samla celler som kan ha förblivit vidhäftat till väggarna i röret.
- Placera 100 mm odlingsskål (med 10 ml F12HS10 och dissocierade DRG-celler) i en befuktad 37 ° C inkubator under 3 tim.
OBS: CO 2 krävs inte i inkubatorn eftersom HEPES buffertar media pH i frånvaro av CO2. Under inkubationen gliaceller binda till ytan av vävnadsodlingsplast och nervceller tenderar att löst hålla fast glial säng.
4 Beläggning Acid Washedoch bakade Täck med laminin-1
- Tina sterila alikvoter av fryst laminin-1 på is.
- Under sterila betingelser, tillsätt 1 ml sterilt 1x PBS till 50 ^ il alikvot av laminin-1.
- Använd en spektrofotometer för att erhålla ett absorptionsvärde av laminin-1 vid 280 nm. Använd detta värde i följande ekvation för att bestämma koncentrationen av laminin-1.
ABS 280 = (koncentration mg / ml) * (extinktionskoefficient av protein)
Extinktionskoefficienten för laminin-1 är 0,86.
- Under sterila betingelser, späd laminin-1 med 1X PBS för att få koncentrationerna 1 mg / ml och 20 mg / ml. Använd dessa två tillämpade koncentrationer av laminin-1 för att uppnå en tiofaldig skillnad på laminin-1 bundet till täck (30 ng / cm 2 och 300 ng / cm 2, respektive) efter inkubation 7,8,10.
- I ett laminärt flöde huva, använd fin pincett för att placera en syratvättad och bakade coverslip i botten av en 35 mm odlingsskål. Upprepa vid behov för att erhålla det antal rätter som behövs.
- Ämne täck till UV-ljus i 20-30 min för att ytterligare säkerställa sterilisering. Håll skålen locket under detta steg.
- Tillsätt 400 l av beredd laminin-1 till varje täckglas. Använd pipettspetsen för att sprida laminin-1 för att säkerställa full täckning av täckglas. Ytspänning kommer att tillåta laminin-1 att stanna kvar på täckglas och inte sprids på bottnen av odlingsskålen, som krävs.
- Placera locket på skålen och tillåta laminin-1 inkubera under 2-3 h vid rumstemperatur (3 h är optimalt).
- Efter laminin-1 inkubation, skölj täck med aseptisk teknik med steril PBS i laminärt flöde huva. Ta bort lösningen på täckglas och tillsätt 400 l PBS. Vänta 5-10 min. Upprepa för totalt 3 sköljningar.
- Lämna PBS på täckglas efter sista sköljningen. Bryt inte ytspänningen under sköljning och inte tillåter täck torka ut. Leave locket på tills den ska plattan dissocierade nervceller på coverlip.
5. Dissociation, berikande och Odling DRG nervceller - Del 2
- Efter inkubation, använd en 10 ml steril pipett för att försiktigt skölja ner på 100 mm skål innehållande dissocierade DRG-celler. Håll skålen vid ~ 45 ° vinkel, drar ~ 7 ml F12HS10 med pipett bistånd, sedan försiktigt ut 7 ml på ca 1/3 av skålen. Upprepa 5x försiktigt lossnar nervceller.
- Rotera skålen och upprepa skölja förfarande, ytterligare sex sköljningar, på en annan tredjedel av skålen. Upprepa proceduren igen för resterande tredjedel av skålen. På detta sätt försiktigt spola hela botten av skålen med F12HS10 att avlägsna neuroner.
- Genom att använda samma pipett F12HS10 innehåller nervceller från 100 mm skål till 15 koniska rör. Centrifugera i 5-10 min på 200 g för att pelletera cellerna.
- Avlägsna F12HS10 lämnar pelleten ostört. Resuspendera pelleten med 2 ml värms F12H + kosttillskott.
- Späd celler som är nödvändiga med F12H + tillskott för att uppnå önskad plätering koncentration (120.000 celler / ml för täckglas belagda med 1 mikrogram / ml laminin-1 och 40.000 celler / ml för täckglas belagda med 20 mikrogram / ml laminin-1 8,16).
- Ta bort PBS från laminin-belagda täckglas och placera omedelbart 400 l av celler på täckglas. Försiktigt överföra skålen en fuktad, 37 ° C cellkultur inkubator. Tillåt att inkubera under åtminstone en timme och upp till 3 h för att tillåta neuroner att vidhäfta till laminin-1.
- Under sterila betingelser, försiktigt översvämning 35 mm rätter som innehåller nervceller med 1,6 ml F12H + kosttillskott.
OBS: Vid denna tid, ytspänning på täckglas kan brytas. Nervceller har adekvat följs laminin-1 på täckglas. - Återgå celler till inkubatorn och inkubera över natten. Utföra experiment som immuncytokemi följande dag.
6 Immunocytochemistry
- Före immunocytokemi varm fixeringslösning (4% paraformaldehyd, 30% sackaros 2X PBS) i 37 ° C vattenbad.
OBS: Innan du fäster celler, behandla med olika reagens, såsom netrin-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaforin och ephrin 16,29-31. - Sakta ut 1 ml av 2 ml F12H + tillskott från odlingsskål. Försiktigt tillsätt 1 ml värms fixeringslösning. Tillåt att inkubera vid rumstemperatur under 10-15 min.
- Ta försiktigt bort fixeringslösning och tillsätt 2 ml PBS. Applicera lösningen mot kanten av skålen, undvika eventuell rubbning av fasta celler på grund av tillämpningen av PBS. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Upprepa PBS tvätt för totalt 5 tvättar. Låt inte cellerna torka under något steg i immuncytokemi.
- Avlägsna PBS. Applicera 1 ml blockeringslösning (0,1% Triton-X, 1X PBS, 5% normalt getserum). Inkubera under en timme vid rumstemperatur. Alternativt, för att färga ytmolekylerAnvänd inte Triton-X i blockeringslösning 8.
- Späd primära antikroppar i blockerande lösningen per tillverkningen rekommendation. Använd 1: 500 för antikroppar mot NCAM och aktiverade β1 integriner 16. Avlägsna blockeringslösning, tillsätt 1 ml av en primär antikroppslösning och inkubera under 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Ta bort primär antikropp-lösning och tillsätt 2 ml 1X PBS. Inkubera i 5-10 minuter vid rumstemperatur. Upprepa för totalt fyra PBS-tvättar. Tvättar kan förlängas, om det behövs.
- Späd sekundär antikropp 1: 1000 i blockerande lösningen. Avlägsna PBS, tillsätt 1 ml sekundär antikroppslösning och inkubera under 1 h vid rumstemperatur.
OBS: Sekundära antikroppar är ljuskänsliga. Håll lösningar och celler i mörker så mycket som möjligt från denna punkt framåt. - Ta bort sekundär antikropp lösningen och skölj 5x med 1x PBS, som gjort tidigare.
- Applicera ~ 60-80 pl av FluoromountG på ett mikroskopglas. Med fin pincett, lyft försiktigt täck ur skålen och undre täckglas i Fluoromount G på objektglas. Undvik luftbubblor.
- Store glider horisontellt vid 4 ° C i mörker. Efter 12-24 timmar, kommer Fluormount G polymeriserar och täckglas kommer vara fast monterade på objektglas. Bild celler efter denna polymerisation steg är komplett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här möjliggör utredare till kultur en berikad population av dissocierade embryonala sensoriska neuroner med mycket få (t.ex. <5%) icke-neuronala celler 7,8,10,16. Många DRG kan erhållas från lumbosakrala, bröstkorg och livmoderhalscancer regionerna. Beroende på behoven hos utredaren, kan DRG från dessa olika anatomiska regioner lätt isoleras. Exempelvis Figur 1 visar bilder av kycklingembryo genom olika stadier av dissektion med ländryggen DRG markerade i figurerna 1C och 1D och bröstkorg DRG i siffror 1E och 1F.
Odlade celler kan lätt märkas genom immunocytokemi. Här är odlade celler immun med antikroppar mot β1 grin och NCAM (figur 2). Överraskande nog har vi kunnat visualisera fluorescerande färgning i upp till ett år efter dessaICC-procedurer, om glasen hölls horisontellt vid 4 ° C och i mörker. Behöver dock livslängden för ICC fläckar som skall fastställas av användaren och per antikropp.
Beroende på tätheten av nervceller, kan tillväxt kottar vid spetsarna av sträcker neuriter även visualiseras (figur 2D-2F). Neuroner ströks ut med 40.000 och 120.000 celler / ml på täckglas belagda med 20 | ig / ml och 1 | ig / ml av laminin-1 respektive, har många fria neuriter upp till 26 h efter plätering. Dessa kulturer kan användas för att specifikt analysera tillväxtkoner förutom att analysera hela neuron. Tidigare har detta förfarande använts för att utvärdera tillväxt konen hastighet och beteenden, såsom tillväxt kon kollaps 8,9,11,13,16. Lägre plätering densiteter på dessa Täckglas ger döda nervceller som inte uppfylls av substrat. Den exakta lämplig densitet som behövs för varje experiment måste optimeras per utredare.
Figur 1. Stadier av embryonala chick dissektion att få DRG. A) Chick embryo liggande på ryggsidan. Hjärtat (H), är vingar (W) och ben (L) märkta. Den övre delen av bilden är i riktning mot huvudet, eller överlägsen (S). Den nedre delen av bilden är mot svansen eller sämre (I). R = höger sida av djur, L = vänster sida av djuret. Alla efterföljande bilderna är i samma riktning. B) De inre organen har tagits bort från embryot i A. ryggraden är revben och DRG sett. För enkelhetens skull, en ribba är märkt, är tre representativa DRG identifieras av svarta cirklar och bröstkorg och ryggradens ryggraden är märkt. C) Samma kycklingembryo bild som B med en grå ruta som identifierar regionen visas vid highennes förstoring i D. D) Högre förstoring av ryggradens ryggraden (VC) region. Tre av de elva DRG i den här vyn anges med streckade cirklar. DRG är runda och inkapslade. Dessa funktioner gör det enkelt att få intakta DRG med pincett. E) En kycklingembryo efter avlägsnande av inre organ och ventrala delen av bröst ryggrad. Grey box indikerar region visas vid högre förstoring i F. F) Ryggmärgs (SC) ses i region där ryggraden har avlägsnats. Mot botten av bilden, är fortfarande intakt den lumbala kotpelaren (VC). 3 av 10 DRG identifieras med streckade cirklar. DRG finns mellan varje uppsättning revben.
Figur 2. Odlade primära sensoriska neuroner immunolabeled för NCAM och β1 integriner. Chick DRG nervceller odlade på höga koncentrationer av laminin-1 är immunpositiva för NCAM (A) och β1 grin (B). C) Sammanslagen bild av två fläckar avslöjar de flesta celler är positivt för både NCAM och β1 grin. Dessa avian sensoriska neuroner är immunpositiva för båda dessa markörer. Men det är en cell, markeras med en asterisk som är NCAM negativ och β1 grin positivt, i linje med en icke-neuronal cell. DF) Högre förstoring av en odlad sensoriska neuron visar neurites sträcker sig från cellkroppen. D) infälld i vitt rutan visar större förstoring av tillväxten konen på spetsen av en neurit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi detaljerade protokoll för isolering och odling dissocierade sensoriska neuroner från ett kycklingembryo. Detta förfarande ger en berikad population av kraftigt växande nervceller in vitro 7,8,10,16. Många cellulära och molekylära tekniker kan tillämpas på dessa odlade nervceller, inklusive immuncytokemi, som beskrivs här. Detta protokoll användes nyligen för att kvantitativt bedöma intensiteten i immunolabeled aktiverade integriner i sensoriska tillväxt kottar 8,16. I dessa tidigare studier, har ett program som används för att noggrant skapa en disposition av den distala 20 micron slutet av tillväxtkonen. Skissen gjordes utifrån NCAM färgning. Den allestädes närvarande uttryck av NCAM i nervceller aktiveras programmet för att identifiera hela tillväxten konen i stället för en begränsad del av tillväxten konen. Denna tillväxt konen skissera därefter identifieras som ett område av intresse och grin färgningsintensitet inom den regiom intresse bedömdes av programvaran. På detta sätt kan intensiteten i ett intressant protein lätt mätas i en viss region i odlade sensoriska neuroner.
För att få tillförlitliga resultat, ges följande rekommendationer ges. Se först till att täck är väl tvättas med vatten efter HCI inkubation i steg från 1,4 till 1,6. Annars kommer molekyler såsom laminin-1 inte sprida bra på täckglaset. För det andra, bekräftar att DRG är tillräckligt dissocierade (steg 3,5) efter trypsindigerering, annars klumpar av celler bildas och detta kommer att minska neuronal renhet. För det tredje är det optimalt att inkubera DRG celler i steg 3.9 för en fullständig 3 timmar för att få en renare population av neuroner. Om detta inkubationssteg förkortas, då minskar sköljningssteg 5,1 och 5,2 för att begränsa antalet icke-neuronala celler som ryckts loss efter en kortare inkubationstid. Fjärde, se till att ytspänningen bibehålls samtidigt som laminin-1 och dissoförbundna neuroner till täckglasen. Om ytspänningen är förlorad kommer lösningen sträcker sig utanför täckglas och torr. Detta kommer att döda nervceller. Femte behöver optimal celltäthet som skall fastställas av varje utredare. Tidigare studier har pläterade 120,00 neuroner / ml och 40.000 neuroner / ml på täckglas belagda med 1 | ig / ml laminin-1 och 20 | ig / ml laminin-1, respektive 8,16. Denna koncentration var så låg att utredarna att studera gratis axon ändelser (ändelser som ännu inte hade anknytning till ett annat neuron). Sjätte, under immuncytokemi, vara säker på att försiktigt skölja celler. Ta bort eller tillämpa lösningar för snabbt kan lösgöra nervceller från täckglas.
Begränsningar i detta förfarande omfattar tidsfönstret för chick DRG dissektion något begränsat. DRG kan enkelt erhållas från embryonala dag (E) 7-10 kycklingembryon. Medan det är möjligt att erhålla DRG tidigare än E7, är det något utmanande. Efter E11, mer brosk transitions till ben och detta gör dissektion svårare. Således skulle studier som syftar till att jämföra embryonala kontra vuxna nervceller inte vara perfekt för denna chick-modellen har dock tidigare studier använt råttmodell för jämförelse ålder i DRG 32. Det bör noteras att rått-DRG dissektion är dyrare, mindre robust och tekniskt mer utmanande än chick. En annan sak att tänka på är förmågan hos odlade embryonala DRG nervceller att förändras över tiden i kultur. Till exempel dessa sensoriska neuroner uttrycker olika receptorer inom 48 timmar beroende på förekomsten av utvalda neurotrofinerna 2,30.
Två underklasser av DRG nervceller kan berikas genom användning av selektiva neurotrofiner i media 2,12,30. Till exempel, nervtillväxtfaktor (NGF) och neurotrofin-3 (NT3) stöder primärt överlevnaden av kutana och proprioceptiva neuroner, respektive 33. De medier som används i detta experiment har både NGF och NT3Men detta kan lätt modifieras för att välja för antingen kutana eller proprioceptiva sensoriska neuroner.
Dissocierade nervceller är mottagliga för många levande avbildningstekniker inklusive Timelapse föreställa av tillväxten konen motilitet och kalcium avbildning. Medierna används här är fördelaktigt för levande cell imaging, eftersom den inte kräver CO2 för pH buffring av medierna. Således kan datainsamling från levande celler utföras på ett mikroskop med en uppvärmd scenen men kräver inte upprätthålla lämplig CO2-nivåer. Tillväxt kon hastighet, kollaps 8,16,30, och kalciumnivåer 17 har studerats i levande primär chick sensoriska neuroner som isolerats genom den teknik som beskrivs här. Dessutom kan RNAi framgångsrikt minska proteinnivåer i odlade kyckling DRG-neuroner 34.
Vunna insikter från väldefinierade in vitro-modeller kan användas som ett viktigt underlag för att utforma experimenti en mer komplex in vivo-modell. Exempelvis har olika tillvägagångssätt som används i Silver labbet 35 för att stimulera Axon utväxt i en modell av gliaceller ärr in vitro. Av de olika testade in vitro-reagens, kunde endast två (inflammation induktion och rötning av kondroitinsulfatproteoglykaner) främja Axon förnyelse. Intressant, en kombination av dessa två behandlingar in vivo stimulerade dramatisk och funktionella Axon förnyelse i ryggmärgen 35. I detta fall, de in vitro-försök med ett viktigt verktyg för att snabbt screena för reagenser som ökade Axon utväxt. De reagenser som framgångsrikt främjas axontillväxt in vitro visade sig också framgångsrikt in vivo, vilket ytterligare stödjer värdet av cellodlingsförsök.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Alison Philbrook, Belinda Barbagallo och Michael Francis för insiktsfulla kommentarer på detta papper. Forskningen rapporteras i denna publikation stöddes av en R15-OMRÅDET utmärkelse 1R15NS070172-01A1 delas MLL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
References
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
- Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
- Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
- Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
- Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
- Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
- Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
- Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
- Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
- Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
- Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
- Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
- Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
- Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
- Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
- Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
- Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
- Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
- Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
- Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
- Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
- Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
- Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
- Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
- Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
- Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
- Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
- Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
- Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).
