In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Resumen

Proteína arginina metilación, catalizada por una clase de enzimas viz., La proteína arginina metil transferasas (PRMTs), es el proceso de adición enzimática de grupo (s) metilo para argininas dentro de las proteínas. El ensayo de metilación in vitro es la herramienta más fiable para evaluar el estado de metilación de sustratos PRMT conocidos o nuevos.

Resumen

Proteína arginina metilación es una de las más abundantes modificaciones post-traduccionales en el núcleo. Proteína arginina metilación se puede identificar y / o determina a través de enfoques proteómicos, y / o inmunotransferencia con anticuerpos específicos metil-arginina. Sin embargo, estas técnicas a veces pueden ser engañosas ya menudo proporcionan resultados positivos falsos. Más importante, estas técnicas no pueden proporcionar evidencia directa en apoyo de la especificidad de sustrato PRMT. Los ensayos in vitro de metilación, por otro lado, son ensayos bioquímicos útiles, que son sensibles, y consistentemente revelan si las proteínas identificadas son de hecho los sustratos PRMT. Un ensayo típico de metilación in vitro incluye, PRMTs activos purificados, sustrato purificado y marcado con un radioisótopo metil donante ^{(S-adenosil-L-[metil-3H]} metionina). Aquí se describe un protocolo de paso a paso para aislar PRMT1 catalíticamente activo, un miembro de la familia PRMT doquier expresó. El metransferasa actividades Thyl del PRMT1 purificada más tarde fueron probados en Ras-proteína activadora de GTPasa proteína de unión 1 (G3BP1), un sustrato PRMT conocido, en presencia de ^{S-adenosil-L-[metil-3H]} metionina como donante de metilo. Este protocolo se puede emplear no sólo para establecer el estado de metilación de sustratos fisiológicos PRMT1 nuevos, sino también para la comprensión del mecanismo básico de la metilación de arginina de proteínas.

Introducción

Metilación de proteínas fue descrita por primera vez en 1968 ^1. No fue sino hasta la primera clonación de PRMT1 en 1996, que los investigadores comenzaron a apreciar la importancia de esta modificación después de la traducción ^2. Curiosamente, alrededor del 2% de los residuos de arginina en las proteínas de extractos nucleares se metilado ^3, lo que indica la abundancia de esta modificación. La arginina es un aminoácido cargado positivamente con una cadena lateral básica y el nitrógeno / s dentro de las cadenas laterales de arginina puede ser modificado después de la traducción a través de la adición de un grupo metilo, un proceso cono....

Protocolo

1 Preparación de construcciones de expresión

1. Antes de comenzar el protocolo, PRMTs clones en vectores de expresión de mamífero con una etiqueta de epítopo N-terminal (Myc o HA), y el sustrato en marco con la glutatión-S-transferasa (GST) para la expresión de proteínas de alto nivel y purificación a partir de células bacterianas lisados, usando técnicas de biología molecular estándar.

2. Purificación de PRMTs

1. Utilice 100 mm cultura platos para mantener las células epiteliales bronquiales humanas (Beas2B). Pasaje de las células cada 3 días y no dejarlos crecer hasta confluencia.
2. En el día antes de la tr....

Resultados

Las habilidades de HA-PRMT1 de metilato de GST-G3BP1 se determinaron por un ensayo in vitro de metilación en. PRMT1 marcada con HA purificada a partir de lisados ​​de células Beas2B se empleó en una reacción de metilación que contiene GST-G3BP1, y 1 Ci de ^{S-adenosil-L-[metil-3H]} metionina, como un donante de metilo. PRMT1 podría catalizar eficazmente la metilación de GST-G3BP1 (Figura 1, panel superior). Reacciones de metilación utilizando menús desplegables realizados.......

Discusión

El protocolo descrito en el presente documento se utiliza rutinariamente para establecer el estado de metilación de los sustratos PRMT identificados. Este ensayo robusto y consistente también proporcionará evidencia definitiva de la especificidad de PRMTs para sus sustratos. Los componentes clave para el éxito de este ensayo son: 1. Expresión de PRMTs en células de mamífero, 2. Actividad de PRMTs purificados, 3. Expresión y purificación de sustrato, y 4. transferencia Western completa de las proteínas a la membrana de n.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
S-adenosil-L-[metil-3H] metionina	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Dispensador de tapa de botella	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Viales de centelleo	Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutatión Reducido	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Reactivo de transfección
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
sodio	Sigma
matriz de afinidad anti-HA	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anticuerpo anti-HA	roche
Ponseau S	Fisher Scientific

National SDS Sigma Desoxicolato de PMSF Sigma