Protocol
Procedurer, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller N ° 071140-000821-12 og 08052010 godkendt af honorære Kommission for Dyreforsøg og direktivet bestyrelse School of Medicine, Universidad de la República - Uruguay.
1. sublingual administration af det terapeutiske middel
- Forbered opløsningen indeholdende det terapeutiske middel, der skal testes. Juster koncentrationen at administrere et maksimalt volumen på 10 pi per mus.
BEMÆRK: renset flagellin fra Salmonella enterica serovar typhimurium den optimale dosis til at yde beskyttelse i mus inficeret med den første dødelig dosis af S. pneumoniae serotype 1 E1586, der forårsager 100% mortalitet er 10 ug / mus. Flagellin opløsning skal opvarmes ved 65 ° C i 5 minutter for at sikre frigivelse af monomerer. For mere information om flagellin oprensning se reference 26.- Vary effektiv koncentration af forskellige immunmodulerende midler ifølge dens molekylære størrelse, renhed, modtagelighed for proteolyse og anvendelse af mucoadhæsive midler. Juster optimal koncentration for hver forbindelse, der skal testes for at maksimere dens virkninger. Hvis der er foretaget tidligere undersøgelser intranasal rute for en bestemt forbindelse, bruger en startdosis 5 til 10 gange højere for at teste effektiviteten af sublinguale.
- Bedøve musene ved at indsprøjte en cocktail indeholdende 110 mg / kg ketamin med 5,5 mg / kg Xylacine og lade dyrene hvile i 7 til 10 minutter.
- Bekræft ordentlig bedøvelse ved forsigtigt at trykke trædepuden af et af bagbenene; hvis de er korrekt bedøvet at dyret ikke vil bevæge sig som reaktion på stimulus.
- Spred et tyndt lag af dyrlægen salve i øjnene på hver mus for at forhindre tørhed under anæstesi.
BEMÆRK: inhalatorisk bedøvelsesmidler som isofluoran kan også anvendes i stedet Ketamin / Xylacine hvis et system udstyrePED med induktion kammer og næse kegler er til rådighed. Brug induktion kammer for at bedøve dyrene og administrere immunstimulerende af sublinguale rute. Forbinde Umiddelbart dyret til en næsekegle i mindst 15 minutter for at holde det under bedøvelse for at undgå at sluge og tillade absorption af den terapeutiske forbindelse. - Pipette opløsningen indeholdende immunstimulerende eller køretøj kontrol løsning; ved hjælp af tommel-og pegefinger på den ikke-dominerende hånd tage musen og holde den i lodret position.
- Brug af dominerende hånd sted et par lukkede pincet under tungen og holde det på plads ved hjælp af de midterste og ring fingre, åbne pincet lidt for at løfte tunge.
- Tag pipette og administrere opløsningen på gulvet i munden og dorsale side af tungen.
- Fjern pincet og lad musen hvile i 3 til 5 minutter, før du sætter det tilbage i buret. For at sikre at normotemperatur opretholdes i bedøvede mikrofone, forbinde bure til et bur varmesystem. Hvis et sådant system ikke er tilgængelig, skal du placere mus tilhører den samme behandling gruppe tilbage til den tilsvarende bur man ved siden af hinanden over strøelse og delvist dække dem med rene tissuepapirark at hjælpe dem med at opretholde kroppens temperatur.
- Saml vævsprøver på noget tidspunkt efter instillation af immunmodulerende middel til at analysere ændringer i cellepopulationer induceret af behandlingen.
BEMÆRK: I denne særlige protokol administration af flagellin blev udført 2 timer før udfordring. Bestem optimale tidspunkt mellem behandling og udfordring for hver enkelt terapeutisk middel og patogenet, der skal testes.
2. Udarbejdelse af bakteriesuspension og Intranasalt Challenge med Streptococcus pneumoniae
BEMÆRK: S. pneumoniae er et naturligt humant patogen, der kan forårsage livstruende sygdomme som invasiv lungebetændelse, sepsisog meningitis. Overførsel kan ske, når den indåndes eller i kontakt med slimhinden. Derfor skal alle prøver, der kan have været i kontakt med S. pneumoniae skal håndteres på en hensigtsmæssig Biosikring Niveau II-anlægget ved hjælp af en klasse II-biosikkerhed kabinet. Kontroller Standard Operating Procedures for dit institutionens håndtering af type II patogener beskyttelsesbeklædning, bortskaffelse af affald og yderligere sikkerhedsforanstaltninger, der kan gælde. Smittede dyr bør holdes i individuelt ventilerede bure i isolatorer udstyret med HEPA-filtre. Anti-pneumokok vacciner og antibiotikabehandling er til rådighed. For mere information se referencer 27 og 1.
- Optø en portion af et arbejdslager suspension af Streptococcus pneumoniae af kendt bakteriel CFU antal fremstillet som beskrevet i 15.
- Centrifugeres i 5 minutter ved 2.500 xg og RT.
- Supernatanten fjernes, og vaske bakteriepelleten ved at suspendere det i 1 ml sterile saltvandsopløsning. Brug filter tips, når forbereder bakteriesuspension, fortyndinger eller for dyrs udfordring.
- Der centrifugeres igen som beskrevet i trin 2.2.
- Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i en passende mængde sterilt saltvand for at opnå en suspension af 4x10 5 CFU / 50 pl. Denne dosis svarer til den minimale bakteriedosis S. pneumoniae serotype 1 E1586, der forårsager 100% dødelighed i BALB / c-mus ifølge tidligere undersøgelser 15.
BEMÆRK: Ved etablering af en model af lungebetændelse forårsaget af pneumokokker i mus, er det mindste bakteriedosis forårsager 100% dødelighed skal bestemmes for hver enkelt kombination af bakteriel stamme, serotype og mus stamme. - Homogeniseres bakteriesuspension ved hvirvelbehandling eller pipettering op og ned 5 gange.
- Load 50 pi af bakteriesuspensionen anvendelse af en steril filter spids og bibringe det samlede volumen i næseborene af en anæstetiseret mus. Hold museknappen Upright i 2 minutter og lad den hvile i rygleje til 2 flere min. Påfør dyrlæge salve på øjne og returnere dyrene til buret; Sørg for at vedligeholde normotermi mens under anæstesi.
BEMÆRK: I denne undersøgelse bakteriel udfordring blev udført i et volumen på 50 pi til at sikre levering af mindst 90% af det samlede CFU i lungerne som bestemt tidligere 15,28. For at minimere angst dyrets mindre volumener (fx 20 ul) kan anvendes. Dog skal effektiv levering af bakterier i lungerne kontrolleres; dette kan gøres ved at høste lungerne 5 minutter efter udfordring og tælle CFU i lungekarmodstanden homogenater ved udpladning seriefortyndinger på plader blod-agar. - Bekræft CFU numre i bakteriesuspensionen anvendt til infektion ved udpladning serielle 10-fold fortyndinger onto blodagarplader. Inkuber O / N ved 37 ° C med 5% CO 2 og tælle antallet af mucoide kolonier præsentere en grøn halo karakteristisk for alpha hæmolytiske bakterier.
3. Tissue Indsamling og Prøveforberedelse til flowcytometri (FACS)
3.1) Tissue samling
- Aflive dyret ved cervikal dislokation eller ved hjælp af en CO 2 kammer; åbne brysthulen hele vejen op til halsen og lave et snit langs de forreste ben for at eksponere den ventrale side af halsen og submandibulære område.
- Med fin spids buede pincet forsigtigt trække op spytkirtlerne og tilstødende blødt væv for at blotlægge den dorsale side af munden gulvet. Brug buede tynde spids pincet, tage mandibular og tilbehør mandibulære lymfeknuder ved at trække op blidt og placere dem i et rør indeholdende komplet RPMI (cRPMI for 500 ml- 10% føtalt bovint serum, 5 ml af en opløsning indeholdende 10.000 U / ml penicillin og 10 mg / ml streptomycin-opløsning og 5 ml L-glutamin 200 mM) eller nukleinsyre konserveringsmiddel opløsning ifølge den nedstrøms procedure, der vilskal udføres senere.
- For at åbne brysthulen lave et snit i mellemgulvet; ved hjælp af et par af rotte-tandede pincet klemme den Xyphoid brusk af brystbenet og forsigtigt skære ribbenene i begge dorsale sider startende fra falske ribben hele vejen op, indtil den når det punkt, hvor de sande ribben mødes manubrium af brystbenet.
- Ved at holde Xyphoid brusk af brystbenet med pincet, træk forsigtigt op for at blotlægge organer i brysthulen.
- Tag ribbenene fuldstændigt ved at skære de første ribben og kravebenet. Thymus vises som et hvidt struktur med to kamre beliggende i anteroventral del af thorax tæt på bunden af hjertet.
- Tag en af de lapper ved at klemme den med en pincet og bruge en saks til at fjerne de ledbånd mellem dens ringere ansigt og hjertesækken. Fortsæt at fjerne den anden lap.
- Identificer bughulen og åbn den ved at skære langs midteraksen af de muscular væg at eksponere organer. Med en tang skære den bageste vena cava og thorakalaorta; fjerne overskydende blod med et absorberende væv.
- At analysere de bosiddende og lepopulationer af alveolerne udføre bronchoalveolær lavage (BAL). Skær musklerne i den ventrale del af halsen at eksponere luftrøret og spiserøret; at adskille dem gøre indsnit i laterale og dorsale side af strukturerne.
- Løft luftrøret med pincet og lave et lille snit med en skalpel for at indføre en tynd spids overførselspipetten fyldt med 1 ml PBS uden Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA. Indgyde og aspirere den samlede mængde mindst tre gange; aspireres og overføre cellesuspensionen til et sterilt 1,5 ml rør og placere den på is.
- At analysere cellepopulationer stede i lungeparenkym først perfuse lungerne ved at injicere 5 ml PBS uden Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA i højre hjertekammeraf hjertet.
BEMÆRK: Dette vil fjerne de fleste af de røde blodlegemer og immunceller til stede i lungerne 'blodkar. Hvis perfusion blev udført korrekt, vil lunger farveskift fra lyserød til hvid. - Isoler hjertet fra lungerne ved at klemme den fra bunden af den venstre ventrikel og fint skåret blodkarrene med en saks for at fjerne det helt. Tag perfusionerede lunger og placere dem i cRPMI eller nukleinsyre konserveringsmiddel løsning afhængigt af den nedstrøms til analyse.
- Til analyse af cellepopulationerne i den sublinguale slimhinde, isolere lederen af dyret og fjerne spytkirtlerne og tilstødende blødt væv, hvis det ikke er blevet gjort i trin 3.2.1.
- Lav et snit på hver side af munden, indtil den når underkæbe fælles og adskille ringere kæbe sammen med tungen og gulv i munden, ved hjælp af stifter ordne det på dissektion bord. Træk op tungen; hjælp af en skalpel lave et snit, hvor base af tungen opfylder gulvet i munden, indtil den når den tredje molarer for at blotlægge den sublinguale slimhinde.
- Tag tungen helt; tage en 0,5 mm biopsitang og placere den ved siden af de nedre fortænder. Skær fra gingival indsættelse af den sublinguale væv og tryk forsigtigt, indtil gulvet i munden er skåret helt ud.
- Gentag en gang nu placere biopsitang tæt på tredje molarer for at fuldføre fjernelsen af den sublinguale væv. Placer på en ren rør indeholdende cRPMI eller nukleinsyre konserveringsmiddel.
3.2) forberedelse Prøve til FACS-analyse.
- Overfør lungerne væv isoleret fra hver mus i en 24-brønds plade og mos dem med en ren saks indtil opnåelse af små stykker af væv på cirka 2 mm. 1 ml per brønd af fordøjelse medium indeholdende 30 mg af type II-collagenase, 50 ug DNAse-I i 1 ml RPMI uden FBS. Pipette op og ned fem gange og inkuberes ved37 ° C og 5% CO2 i 40 minutter.
- Til analyse af cellepopulationer i den sublinguale væv erstatte fordøjelsen medium i 3.2.1 med et indhold af 2 enheder Dispase, 30 mg type II collagenase 50 ug DNAse-I i 1 ml RPMI. Inkubér væv opsamlet fra en mus i 500 ul fordøjelse medium i 20 min ved 37 ° C i en orbitalryster ved 50 rpm.
- Efter inkubation pipette op og ned op til 10 gange eller 30 sek indtil det meste af væv er blevet ødelagt. Filtreres cellesuspensionen selvom en 40 um steril cellefilter og vaskes med 5 ml PBS suppleret med 5 mM EDTA.
BEMÆRK: Fuldstændig fordøjelse af den ekstracellulære matrix og fibrøst væv ikke vil blive nået. Imidlertid er længere inkubationstider i nærværelse af collagenase og / eller dispase eller aggressiv triturering ikke anbefales, da det vil resultere i forøget celledød og destruktion af ekstracellulære proteiner, der påvirker det samlede resultat af FACS analyse. - Der centrifugeres ved 400 xg 5 min, 4 ° C.
- Til analyse af cellepopulationerne i BAL, centrifugeres cellerne ved 400 xg 5 min ved 4 ° C og fortsætte til trin 3.2.4.
- Til analyse af cellepopulationer i lymfeknuderne, placere en 70 um cellefilter på en steril petriskål og sætte lymfeknuder sammen med 1 ml cRPMI i sien. Tag springet til et 2 ml steril sprøjte og bruge det som en støder til at knuse lymfeknuderne mod si s mesh. Skyl cellefilter med 1 ml frisk cRPMI og overføre cellerne fra petriskålen til et sterilt rør.
- Tag en repræsentativ delmængde af hver prøve og plette den med trypanblåt for at bestemme antallet af levedygtige celler.
- Cellerne i FACS-EDTA: PBS-5 mM EDTA-1% bovint Albumin- at gøre op en suspension af 2x10 7 celler / ml, og der tilsættes 50 ul i et cytometer rør.
- Forbered en 2X antistof blanding indeholdende caopriate kombinationer af antistoffer mod overflademarkører og fluorochromer Ifølge de foreliggende FACS instrument. Der tilsættes 50 ul af 2X antistof blandingen i hvert rør, der indeholder cellesuspensionen.
BEMÆRK: hvert fluorochrom-mærket antistof for at bestemme den optimale mængde titreres der skal anvendes, for en detaljeret protokol, se reference 29. - Inkuber 30 minutter på is i mørke.
- Vask en gang med 3 ml FACS-EDTA og spin ned cellerne ved centrifugering ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C, cellerne resuspenderes i 200 pi af den samme buffer og analysere et flowcytometer.
BEMÆRK: Hvis håndtering af et stort antal prøver kan farvningsprotokol til FACS-analyse beskrevet ovenfor udføres i U-bottom 96-brønds plader i stedet for cytometer rør. Imidlertid skal, hvis der anvendes 96-brønds plader vasketrin udføres ved at tilsætte op til 200 pi FACS-EDTA og gentage den 4 gange spinning ned cellerne ved 400 x g i 5 minutter ved 4 ° C mellem hver Washing trin. - På dette tidspunkt, fastsætte prøver til analyse i flowcytometeret senere (op til 72 timer efter fiksering).
- Du kan løse cellerne, efter mærkning med FACS-antistoffer vaskes cellerne i PBS ingen Ca 2 + / Mg2 +, 1 mM EDTA uden FBS. Suspender cellerne i 50 pi af den samme buffer, og der tilsættes 50 pi af en frisk fremstillet 4% paraformaldehydopløsning i hypertonisk (2X) PBS-nr Ca 2 + / Mg2 +.
- Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur og vaskes 3 gange i FACS-EDTA.
- Resuspender cellerne i 200 pi FACS-EDTA og opbevares ved 4 ° C og beskyttet mod lys, i op til 72 timer.
BEMÆRK: FSC-SSC kan påvirkes af fiksering. Hvis fastsættelse af prøverne kontrollerer kompatibilitet fluorescens-mærkede antistoffer med producenten, da tandem farvestoffer kan nedbrydes i nærværelse af fikseringsmiddelpartiklerne agenter. Hvis prøverne stammede fra inficerede dyr fiksering anbefales stærkt at sikre, at ingen levedygtige patogener vil være til stede, når analysynge prøverne i FACS maskine da microaerosols kan genereres i forbindelse med købet af prøven.
4. Total RNA ekstraktion, cDNA syntese og Real Time PCR.
4.1) RNA-ekstraktion og cDNA-syntese.
- Homogeniseres vævet i nukleinsyre konserveringsmiddel opløsning af valg ved mekanisk forstyrrelse (f.eks ved hjælp af en rotor-stator-homogenisator med høj hastighed ryster væv ruptor og perler, etc.). Der centrifugeres ved 12.600 xg i 15 minutter og 4 ° C for at fjerne vævsrester. Supernatanten overføres til et rent rør.
- Ekstraheres RNA med den foretrukne fremgangsmåde i overensstemmelse med producentens instruktioner.
BEMÆRK: RNA er meget modtagelige for nedbrydning, hvis det ikke skal bruges straks efter isolering, gør portioner og gemme dem i RNAse gratis rør ved -80 ° C. Undgå gentagen nedfrysning og optøning. Rørene skal håndteres med handsker på alle tidspunkter. Efter optøning af prøverne enlways holde dem på is. - Absorbansen af nukleinsyrer ved 260 nm og beregne koncentrationen i pg / pl.
- Forbered DNAse-I blandes ved tilsætning af (i 1 prøve): 7.6 pi ultrarent vand, 1 pi 10X DNAse I-puffer, 0,4 ul DNAse-I (opformering kvalitet) lager 1 U / ul, og add 8.4 pi DNase-I blandes til hver prøve indeholdende 1 ug totalt RNA.
- Brug RNA ved en koncentration på 1 pg / pl og udfører retrotransskription reaktion (RT-PCR) ved tilsætning af 1 ml af det totale RNA som skabelon. Hvis prøverne er for fortyndet, og koncentrationen er lavere end forventet, tilsættes større mængder af totalt RNA i stedet for vand. Må ikke overstige 20% af den endelige reaktion volumen, når du tilføjer RNA specielt hvis RNA-ekstraktion protokol valg involveret phenol-chloroform-blanding, da phenol spor kan påvirke udbyttet af RT-PCR.
- Inkuber 15 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af 10 minutter ved 4 ° C eller ice. (Må ikke overstige inkubationstiden !!)
- Tilsæt 1 pi EDTA 25 mM (molekylærbiologisk kvalitet) til hvert rør og inkuberes ved 65 ° C i 10 minutter for at inaktivere DNAse-I.
- Forbered retrotransskription (RT) blanding som følger (for 1 reaktion): 1 pi tilfældige hexamerprimere stock 0,2 mg / ml, 1 pi dNTP lager 10 mM, 4 pi 5X M-MLV-RT buffer, 2 pi DTT 0,1 M, 1 pi RNAse OUT lager 40 U / ul, og 1 pi M-MLV retrotranscriptase lager 200 U / ul.
- Der tilsættes 10 ul af RT-PCR-blandingen til 10 ul DNAse I-reaktionsrør.
- Udføre PCR-reaktionen i en thermocycler ifølge følgende program:
1X cyklus: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 minutter, 70 ° C - Fortynd cDNA 1: 5 ved tilsætning af 80 pi ultrarent vand. Opbevar ved -20 ° C.
4.2) Real time PCR (qPCR).
- Forbered qPCR reaktion mix som følger (for 1 reaktion): 5 ul mester blanding indeholdende Taq-DNA-Polymerase, SYBR grønt farvestof, PCR-buffer, dNTP mix og MgCl2 (se 4.2.2 nedenfor); 0,9 pi af en 10 pM stamopløsning af den fremadrettede primer, 0,9 pi af en 10 pM stamopløsning af den reverse primer, 1.2 pi ultrarent vand, og 2 pi af cDNA skabelon tidligere fortyndet som anført i trin 4.1.10.
BEMÆRK: reagenskoncentration og cykling protokoller, der anvendes i dette afsnit, er optimeret til at blive udført specifikt med reagenser og instrumenter, der er beskrevet i "Tabel for Materialer og reagenser", andre mærker kan bruges, men reaktionsvolumener kan reagenskoncentration og cykling protokol variere. Tjek dine producentens anvisninger, før RT-qPCR. - Opsæt qPCR instrumentet på følgende måde:
1X cyklus: 15 min, 95 ° C
40X cykler: 15 sek, 95 ° C efterfulgt af 1 min, 60 ° C (på dette tidspunkt erhverve fluorescens).
BEMÆRK: For at relativ kvantificering af mRNA ifølge Ct metode 30 a reference gen skal vælges for normalisering af Ct-værdier. Henvisning gen af valg bør afprøves under specifikke assaybetingelser som sit udtryk kan variere, ACTB, GAPDH eller 18S er nogle af de gener, der sædvanligvis valgt som referencer. - Opsætning af tærskelværdien og analysere data.
Representative Results
Sublingual immunterapi med held kan anvendes til at modulere respons lungerne immunsystem. Vi viste, at en enkelt dosis af flagellin den TLR5 og NLRC4 agonist, kan inducere signifikant opregulering af mRNA, der koder kemokiner CXCL1, CCL20 og cytokin IL-6 sammenlignet med saltvandsbehandlede kontroller. Fold induktion af mRNA-niveauer toppede på 8 timer efter SLIT og vende tilbage til basisniveauer efter 20 timer (figur 1). Men når SLIT blev udført 2 timer før intranasal infektion med S. Pneumoniae niveauer CXCL1 og IL6-mRNA forblev signifikant opreguleret selv 24 timer efter SLIT i forhold til ikke-behandlede dyr (figur 2).
Analyse af cellepopulationer i BAL og lungevævet ved FACS afslørede, at dyr behandlet med FLIC af sublinguale havde øget antal neutrofiler i luftvejene, men ikke i lungerne væv (figur 3).
figur 4, SLIT med flagellin fremmes beskyttelse og forøget overlevelse mod akut pneumokokpneumoni.
Figur 1. Kinetik lungens transkriptionelle profil efter sublingual immunterapi med flagellin. Otte til 10 uger gamle BALB / c-mus (n = 4) blev behandlet med 10 ug flagellin eller saltvand ved sublinguale under anæstesi. Lunger blev opsamlet på forskellige tidspunkter og placeret i nukleinsyre konserveringsmiddel. Total RNA-ekstraktion blev udført, og cDNA blev syntetiseret. mRNA-niveauer blev evalueret ved real time PCR under anvendelse af specifikke primere, der er opført i Table 1. Relativ kvantificering blev udført i overensstemmelse ACt metode under anvendelse ACTB mRNA niveauer for normalisering. Resultater er vist som fold stigning sammenlignet med saltvand behandlede gruppe som median ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) beregnet ifølge Mann-Whitney-testen. Resultaterne er repræsentative for 2 uafhængige forsøg.
Figur 2. Lunger 'transskriptionsprofilen under pneumokokpneumoni efter sublingual immunterapi med flagellin. Otte til 10 uger gamle BALB / c-mus (n = 4 for kontrolgruppen og n = 7 for behandlet gruppe) blev behandlet med 10 ug flagellin eller saltvand ved sublinguale under anæstesi. 2 timer senere blev musene udfordret ved intranasal rute med den minimale dødelige dosis (MLD) forårsager 100% mortalitet af et klinisk isolat af S. pneumoniae-serotype 1-E1585, svarende til 4x10 5 CFU / 50 pi. Lunger blev opsamlet 24 timer efter udfordring og opbevares i nukleinsyre konserveringsmiddel indtil RNA-ekstraktion og cDNA-syntese blev udført. Real time PCR blev udført (Se primer liste i tabel 1) og relativ kvantificering blev udført ifølge ACt metode under anvendelse ACTB mRNA niveauer for normalisering. Resultater er vist som fold stigning sammenlignet med saltvand behandlede gruppe som median ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) beregnet ifølge Mann-Whitney-testen.
Figur 3. Analyse af polymorfkernede neutrofile (PMN) rekruttering i lungerne væv og luftveje efter slids. Otte til10 uger gamle BALB / c-mus (n = 4) blev behandlet med 10 ug flagellin eller saltvand ved sublinguale under anæstesi. 2 timer senere blev musene udfordret intranasalt med MLD S. pneumoniae-serotype 1-E1585. 24 timer efter udfordring blev BAL udført, og lungerne blev forarbejdet til FACS-analyse. PMN blev identificeret som Ly6G høj / CD11 høj / CD11c-negative celler og baseret på FCS-SSC profil. Resultaterne er udtrykt som procent af PMN med for de samlede celleantal i BAL eller lungerne. Søjler repræsenterer medianen ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) beregnet i henhold til envejs-Mann-Whitney-testen.
Figur 4. SLIT med flagellin beskytter mus mod akut lungebetændelse forårsaget af pneumokokker. S. pneumoniae-serotype 1-E1585. Overlevelse blev vurderet på en daglig basis. Kaplan-Meier kurver blev sammenlignet efter log-rank (Mantel-Cox) test. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) .Results er repræsentative for to uafhængige forsøg.
| Navn | 5'-3 ' | PCR-produkt længde (bp) |
| mB-actin_F | GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT | 68 |
| mB-actin_R | CGTCATCCATGGCGAACTG | |
| mCCL20_F | TTTTGGGATGGAATTGGACAC | 69 |
| mCCL20_R | TGCAGGTGAAGCCTTCAACC | |
| mCXCL1_F | CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA | 84 |
| mCXCL1_R | ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT | |
| MIL-6_f | GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA | 78 |
| MIL-6_R | AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA | |
| mTNFalpha_F | CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA | 63 |
| mTNFalpha_R | CCTCCACTTGGTGGTTTGCT | |
| mCxcl2_F | CCCTCAACGGAAGAACCAAA | 72 |
| mCxcl2_R | CACATCAGGTACGATCCAGGC |
Tabel 1. Primer liste anvendes til tidstro PCR-analyse. Specifikke primersekvenser, der anvendes til qPCR analyse. Frem og bak primere til mus ACTB er Cccl20, CXCL1, IL6, TNFa og CXCL1 præsenteret som 5'-3 'sekvenser og produktudvikling længde forventet er angivet i basepar (bp).
Discussion
Sublingual administration af terapeutiske midler har vist sig som et nyttigt middel til at modulere immunresponset i luftvejene. Den største fordel af SLIT til behandling af luftvejssygdomme er, at det ikke indebærer direkte levering af forbindelser til lungerne eller næsebor, er sikrere end behandlinger baseret på intranasal administration 31.
Sublingual immunterapi kan anvendes til at modulere immunreaktionen på forskellige måder, enten til induktion af regulatoriske responser, der kan mildne symptomerne på allergisk inflammation og astma 32 eller at inducere forbigående aktivering af medfødte immunmekanismer til behandling af akutte lungeinfektioner, som vist her.
Den musemodel præsenteres i denne video er en bekvem metode til screening af forskellige forbindelser som terapeutiske midler til SLIT.
Dette dyr model tilbyder et nyttigt middel til at fastslå virkningenaf SLIT reaktion lungerne immunsystem såvel som i andre organer (f.eks., drænende lymfeknuder eller distale slimhinder), der ikke kan efterlignes ved anvendelse af in vitro-modeller. Selv om der er flere papirer, der beskriver resultater opnået ved hjælp af sublingual immunterapi, ikke er blevet fremsat detaljerede metoder til procedurerne i sublingual indgivelse til rådighed endnu. Derudover kan modellen anvendes til evaluering af sublinguale vacciner til formål at give systemisk samt lokal beskyttelse i luftvejene.
Som vist i den ledsagende video, sublingual indgivelse af forbindelser er en simpel procedure, der let kan udføres uden behov for omfattende træning. Typisk vil en person dygtige i håndtering af dyr kræver 1 time at udføre SLIT i en gruppe af 10 mus bruger injicerbar bedøvelsesmidler som beskrevet i denne protokol. Hvis der udføres pneumokok udfordring så godt, vil 90 ekstra minutter skal udarbejdebakteriesuspensionen og udfør intranasal udfordring af dyrene.
FACS protokoller præsenteres her tillader bekvem karakterisering af virkningen af SLIT på det lokale stedet for administration drænende lymfeknuder samt deres effekter på lungerne 'celle dynamik.
Separat analyse af bronkoalveolær indhold og lungeparenkym er vigtigt at skelne luftvejene immunsystem hjemmehørende og infiltrerende celletyper fra dem, der forbliver i vævet. Analyse af BAL indhold muliggør studiet af alveolær makrofag såvel omsætning som dynamikken i cellerne rekruttering til de alveolære rum induceret af forskellige behandlinger, f.eks., PMN'er, eosinofile, monocytter. BAL kan også anvendes til at vurdere tilstedeværelsen af udskilte cytokiner og chemokiner ved enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) eller detektion af secernerede IgA-antistoffer fremkaldt efter sublingual vaccination. Undersøgelse af lungerne 'vævvil tillade karakterisering af andre celletyper, klassisk dendritiske celler, T-celler og B-celler.
Fremstilling af BAL-prøver og lymfeknuder til FACS-analyse er enkel. Efter prøvetagning, normalt 60 minutter kræves for at fuldføre farvningsprotokol i 10-20 prøver. I modsætning hertil vil isolering af celler fra lungerne eller sublinguale væv kræver mere tid, eftersom nedbrydning af den ekstracellulære matrix er påkrævet. Absorption af det terapeutiske middel leveret af sublinguale rute kan løses ved sporing af fluorescens eller radioaktivt mærkede molekyler under anvendelse af in vivo billeddannelse.
Sublingual immunterapi er en attraktiv metode til effektivt at inducere immunresponser i luftvejene samt systemisk, som kan anvendes til at behandle eller forebygge respiratoriske tilstande. Belysning af de mekanismer, der bestemmer aktivering vs tolerance over for immunreaktion i luftvejene efter SLIT Is afgørende at tillade rationelt design af nye terapeutiske strategier, der kan anvendes alene eller i kombination med tilgængelige behandlinger mod forskellige luftvejssygdomme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine solution (50 mg/ml) | Pharma Service, Uruguay | ||
| Xilacine solution (2 %) | Portinco S.A., Uruguay | ||
| Sterile 1 ml syringe | Modern, Uruguay | ||
| Sterile 27 G needle | Modern, Uruguay | ||
| RPMI 1640 | General Electric Health Care | E15885 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 302020 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | SIGMA | P4333 | |
| Sterile PBS without Ca2+/Mg2+ | PAA | H21002 | |
| Type-I Collagenase | Life Technologies/Gibco | 17100017 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse-I) | SIGMA | D4513 | |
| Dispase | Life Technologies/Gibco | 17105041 | |
| PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b | BD | 550993 | Clone M1/70 |
| APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c | BD | 550261 | Clone HL3 |
| APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G | BD | 560600 | Clone 1A8 |
| Sterile Saline Solution | Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay | ||
| Tryptic Soy Agar | BD Difco, France | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | Biokey, Uruguay | ||
| Sterile Petri Dishes | Greiner | 633180 | |
| p10 Pipette | Gilson | F144802 | |
| p20 Pipette | Eppendorf | 3120000097 | |
| p200 Pipette | Gilson | F123601 | |
| p200 Pipette | Capp | C200 | |
| p200 Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| p1000 Pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| Sterile Filter Tips p10 | Greiner | 771288 | |
| Sterile Filter Tips p200 | Greiner | 739288 | |
| Sterile Filter Tips p1000 | Greiner | 750288 | |
| Vortex | BIOSAN | V1-plus | |
| Stainless steel fine tip forceps | SIGMA | Z168785/Z168777 | Curved and straight |
| Dressing tissue forceps | SIGMA | F4392 | Length 8 inches |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4017 | Straight |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4142 | Curved |
| Mayo Scissors | SIGMA | Z265993 | |
| Scalpel | SAKIRA MEDICAL | ||
| Sterile Biopsy Punch Ø 3mm | Stiefel Laboratories Ltd. | 2079D | 5 mm diameter can also be used |
| Sterile 1.5 ml Tubes | Deltalab | 200400P | |
| Sterile 15 ml Tubes | Greiner | 188271 | |
| Sterile 50 ml Tubes | Greiner | 227261 | |
| Sterile serological pipettes 5 ml | Greiner | 606160 | |
| Sterile serological pipettes 10 ml | Greiner | 607160 | |
| Sterile serological pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Biological safety cabinet, class II | Thermo Scientific | 1300 series, type A2 | |
| Micro-Isolator Rack | RAIR IsoSystem | 76144W | Super Mouse 1800 AllerZone |
| Refrigerated Microcentrifuge | Eppendorf | Legend Micro 21R | |
| Microcentrifuge | Heraeus | Biofuge-pico | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorval ST40R | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Sterile Thin-tip pasteur pipettes | Deltalab | D210022 | |
| Sterile pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Sterile 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | T10282 | |
| Automatic Cell Counter - Countess | Life Technologies | C10227 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Life Technologies | C10312 | |
| Flow Cytometry Tubes | BD | 343675 | |
| Flow Cytometer - FACS Canto-II | BD | ||
| Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900 | Qiagen / Applied Biosystems | ||
| Trizol Reagent | Life Technologies | 15596-026 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I | Life Technologies | 18068-015 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I Buffer 10X | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| EDTA 25 mM | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| Ultra-Pure Water | Life Technologies | 10977 | Molecular Biology Grade |
| RNAse Out | Life Technologies | 100000840 | Molecular Biology Grade |
| Random Hexamer Primers | Life Technologies | N8080127 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT buffer | Life Technologies | 18057-018 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT enzime | Life Technologies | 28025-021 | Molecular Biology Grade |
| QuantiTect Syber Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | Molecular Biology Grade |
| Specific primers | Life Technologies | Molecular Biology Grade |
References
- Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
- Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
- Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
- Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. Changing needs of community-acquired pneumonia. J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).
- Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
- Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
- Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
- Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
- Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
- Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
- Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
- Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
- Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
- Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
- Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
- Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
- Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
- Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
- Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
- Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
- Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
- Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
- Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999 (2009).
- Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
- Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
- Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
- Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
- Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1 (2001).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
- Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
- Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).
