Protocol
NOTA: Tutti i campioni dei pazienti sono stati ottenuti con il consenso informato, e protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati da Stanford University Institutional Review Board (protocollo # 2188 e # 9999).
1. Isolamento delle cellule e Cultura:
- Ottenere tessuto adiposo sottocutaneo umano da pazienti di sesso femminile sani sottoposti a lipoaspirazione elettiva del ventre, fianchi, e / o regione della coscia in anestesia locale / generale. Assicurarsi che Institutional Review Board (IRB) di approvazione è stata ottenuta per il protocollo di isolare ASC da tessuti umani, e seguire le precauzioni di sicurezza istituzionali mentre si lavora con questi materiali.
- Per ottenere il SVF dal tessuto adiposo lipoaspirated, prima lavare il lipoaspirato tre volte con volumi uguali di 1x tampone fosfato salino (PBS) sterile. Con attenzione aspirare ed eliminare lo strato acquoso inferiore.
- Preparare il buffer collagenasi digestione: 0,075% Tipo I collagenasi a Hank diSoluzione salina bilanciata (HBSS). Preparare tampone FACS: 2% FBS, 1% P188 e l'1% Pen-Strep in PBS. Filtro entrambe le soluzioni che utilizzano una dimensione dei pori 0,22 micron filtro polietersulfone flusso veloce disponibile in commercio.
- Per digerire il tessuto adiposo lavato, aggiungere un volume uguale di tampone di digestione collagenasi e posizionare vaso di digestione saldamente in un bagno d'acqua agitazione per 60 min a 37 ° C (circa 180 frullati / min).
NOTA: E 'meglio utilizzare un volume di digestione nave più grande del necessario, in quanto ciò permette di digestione massima durante l'agitazione (cioè, 250 ml di tampone collagenasi digestione, 250 ml di tessuto adiposo lavati in un pallone sterile 1L). - Neutralizzare attività enzimatica aggiungendo un volume uguale di tampone FACS e consentendo di sedersi a temperatura ambiente per 5 min. Successivamente, centrifugare a 233 xg per 20 min a 4 ° C.
- Aspirare accuratamente e scartare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet SVF ad alta densità.
- Risospendere il pellet in 5-10 ml di RT rossotampone di lisi cellulare, in base alle dimensioni del pellet. Lasciare soluzione sedersi a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a 233 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo 5-10 ml di mezzi di crescita tradizionali, in base alle dimensioni del pellet (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% soluzione di penicillina-streptomicina [pen-strep]).
- Filtrare la sospensione attraverso un 100 micron filtro cella nylon per rimuovere i detriti cellulari.
- Centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet in 5-10 ml di mezzi di crescita tradizionali, in base alle dimensioni del pellet.
- Inserire 2 x 10 6 cellule in un piatto di coltura standard di 15 cm, stabilire colture primarie O / N a 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2. Mantenere a livelli sub-confluenti per impedire differenziazione spontanea a 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 nei substrati.
Densità cellulare in uno completamente: NOTAconfluenti 15 centimetri piatto è di circa 4-6 x 10 6 cellule.
2. Colorazione
- ASC culturali in mezzo di crescita tradizionale a 37 ° C / 21% O 2, 5% di CO 2, per 36 ore prima della colorazione / smistamento.
- ASC Ascensore da piastre di coltura utilizzando Accutase (come da protocollo del produttore).
- Lavare le cellule una volta con tampone FACS (PBS con il 2% e l'1% FBS pen-strep).
- Centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 0,5-1 ml di tampone FACS (a seconda del numero di cellule e la quantità di anticorpo desiderato).
NOTA: Il volume della sospensione cellulare, in conformità con le raccomandazioni del costruttore l'anticorpo FACS, determina la concentrazione di anticorpi. Tuttavia, la titolazione di concentrazione di anticorpi, utilizzando una concentrazione iniziale di 1: 100, è di solito consigliata se è la prima volta di utilizzare un anticorpo. - Contare il numero totale dicellule utilizzando un emocitometro.
- Riserva 100 aliquote ul a 1,5 ml provette da utilizzare per un campione senza macchia e controlli solo colore (in base al numero di anticorpi fluorescenti utilizzate).
- Aggiungere gli anticorpi monoclonali fluorescenza marcata adeguati (a concentrazioni predeterminate, secondo le istruzioni del produttore) e incubare per 20-30 minuti sul ghiaccio, al riparo dalla luce.
- Per etichettare sottopopolazione osteogenic: Diluire anti-CD90 (APC CD90 anti-umano (Thy1)) o anti-CD105 (FITC anti-umano CD105 (endoglin)) in tampone FACS ad una concentrazione di 1:50.
- Per etichettare altre popolazioni cellulari (ad esempio, ematopoietiche e cellule endoteliali): Diluire anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), e / o anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS tampone a una concentrazione di 1:50.
- Se non si usa anticorpi coniugati direttamente, utilizzare un anticorpo primario biotinilato con un secondo streptavidina coniugato appropriatoanticorpi ary, quali streptavidina PE-Cy7, a una diluizione di 1: 100.
- Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte: riempire tubi con tampone FACS e centrifugare a 233 xg per 5 minuti a 4 ° C, aspirando surnatante.
- Risospendere le cellule in 400-500 campioni microlitri FACS tampone e filtro attraverso un colino 70 micron cella nylon per rimuovere grumi di cellule.
- Trasferire cellule marcate in tubi FACS con piano filtro e mantenere i campioni in ghiaccio per la durata dell'analisi.
3. Fluorescence-activated cell sorting
NOTA: Le seguenti operazioni impongono conoscenza nella cella fluorescenza attivate (FACS) o l'assistenza di un tecnico specializzato.
- Utilizzando il software FACS appropriate, trame di analisi progettuale esaminare forward scatter (FSC), side scatter (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Red, Pacific Blue, fluoresceina isotiocianato (FITC), Allophycocyanin (APC) e qualsiasi altro uso fluoroforod per etichettare le cellule.
- Prima di essere caricato nel cell sorter, brevemente vortice ogni campione per sospendere nuovamente le cellule.
- Iniziare con analisi del campione non colorato per impostare porte per la popolazione totale di cellule, di escludere detriti cellulari, e determinare autofluorescenza basale.
- Aggiungere ioduro di propidio (PI) al campione non colorato e analizzarlo per visualizzare la popolazione di cellule vive all'interno della popolazione cellulare totale. Costruire un cancello intorno a questa popolazione.
- Analizzare un campione di controllo unico colore per ogni fluorocromo per impostare la compensazione della fluorescenza.
- Analizzare il campione colorato per impostare la posizione di porte per l'ordinamento.
- Aggiungere PI al campione macchiato per macchiare cellule morte.
- Ordina le popolazioni di cellule etichettate. Ordina in entrambi 1,5 ml provette o tubi conici (15 ml) contenenti terreno di coltura.
- Cessare manualmente classificare una volta ottenuta la quantità necessaria di cellule.
- Noiing FACS, eseguire un controllo della purezza analizzando una piccola frazione (ad es., 500 cellule) della popolazione cellulare acquisita.
NOTA: Questo passaggio conferma la purezza delle popolazioni cellulari ordinati. Idealmente, la purezza dovrebbe essere maggiore di 90-95%. - Cellule centrifugare a 233 xg per 5 min a 4 ° C immediatamente dopo il completamento della cernita e risospendere in 1 ml di mezzo fresco contenente 10% FBS.
NOTA: La quantità di materiale utilizzato può essere aumentato in base alle dimensioni del pellet di cellule. - Piatto su piastre rivestite di gelatina per migliorare la vitalità cellulare. A seconda del rendimento cellulare finale, piastra 300.000 cellule per bene in un 6-pozzetti, 100.000 cellule per pozzetto in una piastra di 12 pozzetti.
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Representative Results
Utilizzando CD90 come marcatore per le cellule con risultati migliorati osteogenesi in isolamento di una popolazione altamente arricchito di ASC umani (Figura 1A, 1B). ASC sono state colorate con Pacific Blue coniugati CD45 anti-umane, coniugati con coniugato CD105 anti-umana, e APC-coniugato anti-CD90 umano. Dopo la cernita, il livello di purezza era superiore al 98%, come quantificato mediante analisi post-ordinamento.
Gruppi di cellule in base ai profili trascrizionali consentiti per potenziale isolamento di due nuovi sottopopolazioni Definizione. Per caratterizzare il potenziale osteogenico di ciascuna sottopopolazione promettente (CD90 + e CD105 basso), così come quella della popolazione misti in vitro, le cellule sono state coltivate in terreno di differenziamento osteogenico per 14 giorni, come precedentemente descritto 6,8,9. Alcalina colorazione fosfatasi (utilizzato per la diagnosi precoce di formazione ossea 10) al 7 ° giorno è risultato significativamente aumentato nel CD90 + (Figura 2A). Questo è stato osservato sia grossolanamente e dopo quantificazione (Figura 2A). Analogamente, colorazione Alizarina Red (un test utilizzato per rilevare mineralizzazione matrice extracellulare ed una metrica per end-terminale differenziazione osteogenica 9) al giorno 14 ha dimostrato che CD90 + ASC poterono mineralizzare una quantità significativamente maggiore di matrice extracellulare (Figura 2B). Isolati ASC conservano la capacità di subire la differenziazione osteogenico dopo la cernita, ma può richiedere un paio di giorni per recuperare. È essenziale eseguire tutte le ulteriori esperimenti con cellule passaggio basso, come ASC diventano senescente durante la propagazione in coltura.
Figura 1: (A) Porte per dimensione cellulare e della complessità sono stati disegnati per escludere detriti cellulari e isolare una popolazione of singole cellule per ulteriori analisi. (B) analisi FACS di single-ordinati CD90 (a sinistra) e single-ordinati CD105 (a destra) ASC 36 ore dopo la raccolta ASC. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: (A) fosfatasi alcalina colorazione (in alto) e quantificazione (inferiore) di ASC dopo 7 giorni di coltura in terreno di differenziamento osteogenico (B) alizarina colorazione rosso (in alto) e la quantificazione di colorazione (inferiore) di ASC dopo 14 giorni. della cultura in terreno di differenziamento osteogenico. CD90 + ASC e cellule CD105 bassi mostrano un aumento della fosfatasi alcalina colorazione e la mineralizzazione della matrice extracellulare, rispetto alle cellule senza pettorale (* p <0.05; a due code della studentessa delt-test). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Attualmente, l'isolamento di sottopopolazioni omogenei di ASC dal SVF di tessuto adiposo umano rimane una sfida anche se obiettivo auspicabile. Isolamento di sottopopolazioni ASC pro-osteogeniche è particolarmente desiderabile, poiché tali cellule possono essere usati per studiare la formazione e l'omeostasi dei tessuti scheletrici. Tuttavia, la SVF di tessuto adiposo ospita una significativa eterogeneità in materia di staminali la capacità delle cellule e potenziale di differenziazione. 11 Le basi molecolari di questa eterogeneità non può essere compreso da popolazioni pool di cellule, e invece richiede analisi di singole cellule. 12 Con questo approccio, marcatori di superficie strettamente associata con la capacità di differenziazione osteogenica di ASC può essere identificato.
Il fattore più critico per il successo di arricchimento ASC, come descritto nel metodo di cui sopra, è correlato agli anticorpi utilizzati per FACS. Bisogna prudente selezionare un anticorpo con alta affinità per il celmarcatore l-superficie in questione. Idealmente, dovrebbe essere un anticorpo coniugato primaria rispetto a un metodo di marcatura indiretta, che richiede più passaggi e quindi, una maggiore probabilità di morte cellulare, perdita di cellule ed errore competenza. Inoltre, piccole modifiche durante FACS possono aumentare la vitalità cellulare. Questi includono l'ordinamento in un recipiente freddo, mantenendo le cellule in ghiaccio in ogni momento, l'ordinamento delle cellule in recipienti che contengono terreni di coltura e anche, placcatura le popolazioni cellulari acquistati su piastre di coltura che sono stati pre-rivestite con il 10% di gelatina. È importante eseguire una post-sorta analisi di purezza, per garantire la purezza delle cellule filtrate.
Questa tecnica è limitata dalla disponibilità di attrezzature FACS e competenze all'interno di una struttura. Inoltre, i campioni elementari sono eterogenei, l'espressione di marcatori di superficie cambierà su base individuale. Come summenzionato, è indispensabile effettuare tutti gli esperimenti con cellule passaggio basso, come ASCs diventano senescenti durante la propagazione della cultura. Inoltre, è noto che ASC mostrano un cambiamento nell'espressione fenotipica in condizioni in vitro che possono alterare la biologia delle cellule staminali. Così, per la traduzione clinica, sarebbe ottimale per ottenere una popolazione di cellule altamente purificate per trapianto diretto o semina cellulare per un ponteggio senza la necessità di coltura in vitro. Inoltre, i grandi volumi di lipoaspirazione che devono essere trattati per isolare il SVF può essere gravoso per chi non conosce la tecnica, come discusso e affrontato da Zuk e colleghi in una recente pubblicazione 13. Come per il metodo descritto da Zuk et al., Questo protocollo può facilmente essere scalata su o giù per accogliere il volume di lipoaspirato e può essere adattato per isolare ASC dal tessuto grasso ottenuto attraverso abdominoplasties ed altre procedure simili.
CD90 e CD105 sono stati precedentemente individuati già mesenchimali staminali cmarcatori ELL, sia in BM-MSC e popolazioni ASC. In linea con precedenti ricerche, il CD90 + popolazione rappresentavano circa il 50% del SVF appena isolato. 14 Per contro, solo circa il 5-10% della iniziale SVF espresso CD105. 6 In particolare, con passaggi successivi, espressione CD105 rapidamente aumentato da quasi zero a espressione quasi ubiquitaria dopo 4-7 giorni di coltura. E 'noto che ASC presentano notevole deriva fenotipica durante l'espansione in vitro, che possono alterare la biologia delle cellule staminali. 15-17 Idealmente, applicazioni cliniche di cellule staminali potrebbe comportare l'uso immediato di popolazioni di cellule purificate per il trapianto diretta o semina su un ponteggio , senza la necessità di coltura in vitro. La percentuale di cellule CD90 + può variare tra i diversi campioni lipoaspirato in origine depot-dipendente o grassi maniera dipendente dall'età. Tuttavia, utilizzando come marcatore CD90 superficie cellulare consente o arricchimentofa sottopopolazione di ASC umane con maggiore potenziale osteogenico. Questo metodo di arricchimento osteogenica ha il potenziale per servire come un nuovo mezzo per promuovere la formazione ossea rapida e robusta in pazienti con difetti scheletrici critici dimensioni. Noi abitualmente osserviamo che il rendimento delle cellule approssimativa da lipoaspirazione standard è 5 x 10 7 cellule nucleate / 500 ml di lipoaspirazione con il metodo di raccolta di cui sopra, anche se, come descritto sopra questo può variare in base a origine deposito di grasso o dati anagrafici del paziente. 18 Yoshimura e colleghi hanno riferito che ASC rappresentano 10-35% della popolazione di cellule nucleate nel SVF. 19 Pertanto, vi è un notevole potenziale per la semina diretta di un ponteggio per l'attuazione di strategie di ingegneria del tessuto osseo a seguito arricchimento osteogenico di ASC utilizzando FACS.
Stem ingegneria dei tessuti a base di cellule per applicazioni sperimentali e cliniche spesso richiede popolazioni di cellule altamente purificate. Altro hiEsistono metodi gh-throughput di purificazione come alternative più semplici a FACS, includono panning, complemento esaurimento, e l'ordinamento delle cellule magnetiche-attivata (MACS). Tuttavia, in certe situazioni, FACS è necessario e vantaggioso: quando si desidera l'isolamento delle sottopopolazioni altamente puri, quando si verifica il marcatore di superficie di destinazione rado nella popolazione di cellule, o quando le cellule devono essere separati basa su diversi livelli di espressione della stessa superficie marker.
Utilizzando sia singola cella analisi microfluidica basata trascrizionale e fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule, endoglin (CD105) e Thy-1 (CD90) sono stati trovati per essere associate a differenze di espressione dei geni ASC osteogenici. L'analisi statistica dei singoli cellulari profili trascrizionali dimostrato che la bassa espressione di CD105 e alta espressione di CD90 descrivere sottogruppi di ASC, con maggiore capacità osteogenica. Queste proteine sono stati successivamente utilizzati per arricchire di sottopopolazioni di cellule osteogeniche derived da tessuto adiposo sottocutaneo umana. 6,20
Insieme, questi dati dimostrano l'efficacia di ordinamento ASC sulla base di specifici marcatori di superficie delle cellule che sono correlate alle attività trascrizionale osteogenica. Anche se la fattibilità di questo approccio è dimostrato qui, attraverso l'utilizzo di CD90 e CD105 come esempi, ulteriori analisi deve essere fatto per includere tutte le combinazioni promettenti di espressione dell'antigene di superficie che altamente correlate con l'attività trascrizionale osteogenica.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha un interesse finanziario in uno qualsiasi dei prodotti, dispositivi, o farmaci citati in questo manoscritto. Nessuno degli autori ha alcun concorrente interesse finanziario a riferire.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research concessione R01-DE021683-01 e National Institutes of Health Research concessione R01-DE019434 a MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship per MTCDCW è stata sostenuta dalla ACS Franklin Martin Faculty Research Fellowship, Il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa, e la Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable 250 ml Conical Tubes | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
References
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