L'eterogeneità trascrizionale all'interno delle cellule stromali umane di derivazione adiposa può essere definita a livello di singola cellula utilizzando marcatori di superficie cellulare e geni osteogenici. Descriviamo un protocollo che utilizza la citometria a flusso per l'isolamento di sottopopolazioni cellulari con aumentato potenziale osteogenico, che può essere utilizzato per migliorare la ricostruzione scheletrica craniofacciale.
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Articolo metodologico
Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSC) sono considerate il gold standard per le applicazioni di ingegneria tissutale basate su cellule staminali. Tuttavia, il processo mediante il quale devono essere prelevati può essere associato a una significativa morbilità del sito donatore. Al contrario, le cellule stromali di derivazione adiposa (ASC) sono più facilmente abbondanti e più facilmente raccolte, il che le rende un'alternativa interessante alle BM-MSC. Come le BM-MSC, le ASC possono differenziarsi in cellule del lignaggio osteogenico e possono essere utilizzate in applicazioni di ingegneria tissutale, come la semina su scaffold per l'uso in difetti scheletrici craniofacciali. Le ASC sono ottenute dalla frazione vascolare stromale (SVF) del tessuto adiposo digerito, che è una miscela eterogenea di ASC, cellule endoteliali vascolari e murali, cellule muscolari lisce, periciti, fibroblasti e cellule circolanti. L'analisi citofluorimetrica ha dimostrato che il profilo dei marcatori di superficie per le ASC è simile a quello per le BM-MSC. Nonostante diversi rapporti pubblicati stabiliscano marcatori per il fenotipo ASC, c'è ancora una mancanza di consenso sui profili che identificano le cellule osteoprogenitrici in questa popolazione eterogenea. Questo protocollo descrive come isolare e utilizzare una sottopopolazione di ASC con una maggiore capacità osteogenica di riparare difetti calvari di dimensioni critiche.
Introduzione
La natura eterogenea delle popolazioni di cellule staminali non è ancora completamente compresa e rimane un grave ostacolo allo sviluppo di applicazioni terapeutiche clinicamente efficaci basate sulle cellule staminali. Uno dei modi più comuni per caratterizzare una popolazione eterogenea di cellule staminali è quello di impiegare un metodo di selezione cellulare, come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), per separare le cellule in base ai loro profili di espressione dei marcatori di superficie. Man mano che i metodi di smistamento diventano più complessi, diventa possibile identificare sottopopolazioni funzionali di cellule più distinte. Le tecn....
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Protocollo
NOTA: Tutti i campioni dei pazienti sono stati ottenuti con il consenso informato, e protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati da Stanford University Institutional Review Board (protocollo # 2188 e # 9999).
1. Isolamento delle cellule e Cultura:
- Ottenere tessuto adiposo sottocutaneo umano da pazienti di sesso femminile sani sottoposti a lipoaspirazione elettiva del ventre, fianchi, e / o regione della coscia in anestesia locale / generale. Assicurarsi che Institutional Review Board (IRB) di approvazione è stata ottenuta per il protocollo di isolare ASC da tessuti umani, e seguire le precauzioni di sicurezza istit....
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Risultati
Utilizzando CD90 come marcatore per le cellule con risultati migliorati osteogenesi in isolamento di una popolazione altamente arricchito di ASC umani (Figura 1A, 1B). ASC sono state colorate con Pacific Blue coniugati CD45 anti-umane, coniugati con coniugato CD105 anti-umana, e APC-coniugato anti-CD90 umano. Dopo la cernita, il livello di purezza era superiore al 98%, come quantificato mediante analisi post-ordinamento.
Gruppi di cellule in base ai profili trascrizionali co.......
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Discussione
Attualmente, l'isolamento di sottopopolazioni omogenei di ASC dal SVF di tessuto adiposo umano rimane una sfida anche se obiettivo auspicabile. Isolamento di sottopopolazioni ASC pro-osteogeniche è particolarmente desiderabile, poiché tali cellule possono essere usati per studiare la formazione e l'omeostasi dei tessuti scheletrici. Tuttavia, la SVF di tessuto adiposo ospita una significativa eterogeneità in materia di staminali la capacità delle cellule e potenziale di differenziazione. 11 Le basi mo.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha un interesse finanziario in uno qualsiasi dei prodotti, dispositivi, o farmaci citati in questo manoscritto. Nessuno degli autori ha alcun concorrente interesse finanziario a riferire.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research concessione R01-DE021683-01 e National Institutes of Health Research concessione R01-DE019434 a MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship per MTCDCW è stata sostenuta dalla ACS Franklin Martin Faculty Research Fellowship, Il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa, e la Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette coniche monouso da 250 ml | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, glucosio alto, GlutaMAX Integratore | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Soluzione antisettica povidone/iodio | Purdue | PFC-67618015017 | |
| salina bilanciata di Hank, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Siero fetale bovino, certificato, origine USA | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Soluzione di distacco cellulare | Tecnologie delle cellule staminali | 7920 | |
| APC Topo Anti-Umano CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Topo anti-Umano CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Umano CD45 eFluor 450 (sostituzione Pacific Blue) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Strumento Aria II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
Riferimenti
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298
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Ristampe e permessi
