Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы больных были получены с информированного согласия, и экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Стэнфордского университета Institutional Review Board (протокол № 2188 и № 9999).
1. Выделение клеток и культура:
- Получить человеческого подкожной жировой ткани от здоровых пациенток, проходящих выборные липоаспирация животе, фланг, и / или области бедра под местной / общая анестезия. Убедитесь, что Экспертный совет (IRB) одобрение получено для протокола изоляции ИСС из тканей человека и следуйте институциональные меры предосторожности при работе с такими материалами.
- Чтобы получить СФДВ от lipoaspirated жировой ткани, первый мыть липоаспирата три раза равными объемами стерильного 1x фосфатно-солевом буфере (PBS). Тщательно аспирата и отбросить нижний водный слой.
- Подготовка коллагеназы пищеварения буфера: 0,075% Тип I коллагеназы в ХэнкаСбалансированный солевой раствор (HBSS). Подготовка FACS буфера: 2% FBS, 1% P188 и 1% Пен-Strep в PBS. Фильтр оба решения, используя коммерчески доступный размер пор быстрый поток полиэфирсульфоновой фильтр 0,22 мкм.
- Переваривать промывают жировой ткани, добавить равный объем коллагеназы пищеварения буфера и помещают сосуд пищеварения надежно встряхивании на водяной бане в течение 60 мин при 37 ° С (примерно 180 качает / мин).
Примечание: Лучше всего использовать больший объем пищеварения сосуд, чем это требуется, так как это позволяет максимально пищеварения при встряхивании (т.е. 250 мл коллагеназы пищеварения буфера 250 мл жировой ткани промывают в 1 л стерильной колбе). - Нейтрализовать ферментативную активность добавлением равного объема FACS буфера и позволяет сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин. Далее, центрифуге при 233 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
- Тщательно аспирата и отбросить супернатант, стараясь не потревожить высокой плотности SVF гранул.
- Ресуспендируют осадок в 5-10 мл РТ красныйбуфера для лизиса клеток, в зависимости от размера гранул. Оставьте раствор, чтобы сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин и центрифуге при 233 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок путем добавления 5-10 мл традиционной ростовой среде, в зависимости от размера гранул (Дульбекко в модификации Дульбекко [DMEM] / 10% FBS / 1% пенициллина-стрептомицина решение [перо стрептококк]).
- Суспензию фильтруют через сито нейлона клеток 100 мкм для удаления остатков клеток.
- Центрифуга на 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, и отбросить супернатант, не нарушая гранул.
- Ресуспендируют осадок в 5-10 мл традиционных СМИ роста, в зависимости от размера гранул.
- Поместите 2 × 10 6 клеток в стандартной 15 см блюдо культуры и создать первичные культуры O / N на 37 ° C / 21% O 2, 5% СО 2. Поддержание в суб-сливающийся уровнях с целью предотвращения спонтанной дифференцировке при 37 ° С / 21% O 2, 5% СО 2 в среде роста.
Плотность клеток в полной мере: ПРИМЕЧАНИЕсливной 15 см пластины приблизительно 4-6 х 10 6 клеток.
2. Окрашивание
- Культура ИСС в традиционной среде роста при 37 ° С / 21% O 2, 5% CO 2 в течение 36 ч перед окрашиванием / сортировки.
- Лифт ИСС от культуры пластин с использованием Accutase (в соответствии с протоколом производителя).
- Вымойте клеток один раз FACS-буфера (PBS с 2% FBS и 1% пера стрептококк).
- Центрифуга на 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Удалите супернатант, не нарушая гранул. Ресуспендируют клеток в 0,5-1 мл FACS буфера (в зависимости от числа клеток и количество антител нужной).
ПРИМЕЧАНИЕ: объем клеточной суспензии, в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя FACS антитела, определяет концентрацию антител. Тем не менее, титрование концентрации антител, с использованием исходной концентрации 1: 100, как правило, рекомендуется, если это первый раз использовать антитела. - Подсчитайте общее количествоклеток с использованием гемоцитометра.
- Резервный 100 мкл аликвоты в 1,5 мл центрифужные пробирки, которые будут использоваться для неокрашенной пробы и одноцветных контроля (в соответствии с количеством флуоресцентных антител, используемых).
- Добавьте соответствующие флуоресцентно-меченных моноклональных антител (при заданных концентраций, в соответствии с инструкциями изготовителя) и инкубировать в течение 20-30 мин на льду, защищают от света.
- Для обозначения остеогенной субпопуляции: Развести анти-CD90 (APC анти-CD90 человека (Thy1)) или анти-CD105 (FITC анти-человеческого CD105 (эндоглин)) в FACS буфере до концентрации 1:50.
- Чтобы присвоить другие клеточные популяции (например, кроветворной и эндотелиальные клетки): Развести анти-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), анти-CD34 (Anti-Human CD34 APC), и / или анти-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) в FACS буфере до концентрации 1:50.
- Если не используется непосредственно конъюгированных антител, использовать биотинилированного первичного антитела с соответствующим стрептавидин-конъюгированные второйичных антитела, такие как стрептавидин PE-Cy7, в разведении 1: 100.
- После инкубации промыть клетки дважды: заполнить трубы с буфером FACS и центрифуги в 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, супернатант аспирацией.
- Ресуспендируют клеток в 400-500 мкл FACS буфера и фильтра образцов через сито нейлон клеток 70 мкм, чтобы удалить скопления клеток.
- Передача меченых клеток в FACS труб с фильтром верхней и сохранить образцы на льду в течение всего срока анализа.
3. флуоресценции активирован сортировки клеток
Примечание: Следующие шаги мандат предыдущие знания в флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS) или помощь квалифицированным специалистом.
- Использование программного обеспечения соответствующих FACS, анализа проектирования участков для изучения рассеяния вперед (ФСБ), боковое рассеивание (SSC), Фикоэритрин (PE) -Texas Красный, Pacific Blue, флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), аллофикоцианином (APC) и любое другое использование флюорофорd маркировать клетки.
- Перед загрузкой в клеточного сортера, кратко вихря каждого образца для ресуспендирования клеток.
- Начать с анализом образца неокрашенной, чтобы установить ворота для общего количества клеток, чтобы исключить продукты распада клеток, а для определения базового аутофлюоресценция.
- Добавить пропидийиодидом (PI) для неокрашенной пробы и анализировать ее для того, чтобы визуализировать население живых клеток в общей численности населения клеток. Построить ворота вокруг этого населения.
- Анализ контрольного образца одного цвета для каждого флуорохромом, чтобы установить компенсацию флуоресценции.
- Анализ окрашенных образец, чтобы установить положение ворот для сортировки.
- Добавить PI для окрашенных образца для того, чтобы окрашивать мертвые клетки.
- Сортировать меченых клеточных популяций. Сортировка в любой 1,5 мл центрифужные пробирки или конические пробирки (15 мл), содержащем культуральную среду.
- Вручную прекратить сортировки когда была получена необходимое количество клеток.
- Намчисле FACS, выполните проверку на чистоту с помощью анализа небольшую долю (напр.,, 500 ячеек) приобретенной клеточной популяции.
Примечание: Этот шаг подтверждает чистоту отсортированных клеточных популяций. В идеале, чистота должна быть больше, чем 90-95%. - Центрифуга клетки при 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С сразу после завершения сортировки и ресуспендируют в 1 мл свежей среды, содержащей 10% FBS.
Примечание: Количество используемых сред может быть увеличена в зависимости от размера из клеточного осадка. - Пластина на покрытые желатином пластин для повышения жизнеспособности клеток. В зависимости от конечного выхода клеток, пластины 300000 клеток на лунку в 6-луночный планшет, 100000 клеток на лунку в 12-луночный планшет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование CD90 в качестве маркера для клеток с улучшенными результатами остеогенеза в изоляции из высокообогащенного населения человеческих ИСС (рис 1а, 1б). ИСС окрашивали Pacific Blue-сопряженных анти-человеческого CD45, FITC-сопряженных анти-человеческого CD105 и APC-сопряженных анти-человеческого CD90. После сортировки, уровень чистоты был больше, чем 98%, как количественно с помощью анализа после сортировки.
Определение группы элементов на основе транскрипции профилей, разрешенных для предполагаемого выделении двух новых субпопуляций. Для характеристики остеогенной потенциал каждого перспективного субпопуляции (CD90 + и CD105 низкий), а также, что из несортированный населения в пробирке, клетки культивировали в остеогенной дифференцировки среде в течение 14 дней, как было описано ранее 6,8,9. Щелочная окрашивание фосфатазы (используется для раннего обнаружения образования костной ткани 10) на 7-й день был существенно увеличен в CD90 + (фиг.2А). Это наблюдается как грубо и после количественного (рис 2а). Кроме того, ализарин красный окрашивание (анализ используется для обнаружения внеклеточного матрикса минерализации и метрику для конечного терминала остеогенной дифференцировки 9) на 14 день показал, что CD90 + ИСС смогли минерализации значительно большее количество внеклеточного матрикса (рис 2б). Изолированные ИСС сохраняют способность пройти остеогенной дифференцировки после сортировки, но может потребоваться несколько дней, чтобы восстановиться. Важно выполнять все дальнейшие эксперименты с низкими клеток проезд, как ИСС стать стареющей при распространении в культуре.
Рисунок 1: (A) Ворота размера клеток и сложности были разработаны, чтобы исключить остатков клеток и изолировать популяции OF отдельные клетки для дальнейшего анализа. (B) FACS анализ одного отсортированы CD90 (слева) и одной отсортированы CD105 (справа) ИСС 36 ч после сбора урожая ASC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: (А) щелочной фосфатазы окрашивания (вверху) и количественное (нижней) ИСС после 7 дней культивирования в остеогенной дифференцировки среды (В) ализарин красный окрашивание (вверху) и количественное определение окрашивания (нижней) ИСС через 14 дней. культуры в остеогенной дифференцировки среды. CD90 + ИСС и CD105 низкие клетки показывают увеличение щелочная фосфатазы окрашивания и внеклеточного матрикса минерализации по сравнению с неотсортированных клеток (* р <0,05; двусторонний студентаT-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящее время, изоляция однородных групп населения ИСС из SVF в жировой ткани человека остается сложной, хотя желанной целью. Выделение про-остеогенных ASC субпопуляций особенно желательно, так как такие клетки могут быть использованы для изучения формирования и гомеостаз скелетных тканей. Тем не менее, SVF жировой ткани таит значительную неоднородность в отношении стволовых потенциала и дифференцировки клеток потенциал. 11 Молекулярная основа для этого неоднородности не могут быть поняты из объединенных популяциях клеток, а вместо этого требуется анализ отдельных клеток. 12 При таком подходе, поверхностные маркеры тесно связаны с остеогенной дифференцировки мощность ИСС могут быть идентифицированы.
Наиболее важным фактором успешного обогащения ИСС, как описано в указанном выше способе, относится к антителам, используемых для FACS. Нужно быть разумным, чтобы выбрать антитело с высоким сродством к CELL-поверхностный маркер под вопросом. В идеале, он должен быть первичным конъюгированного антитела, в отличие от косвенным методом окрашивания, что требует несколько шагов и, таким образом, повышенный риск гибели клеток, гибели клеток и ошибок начисления. Кроме того, незначительные изменения во FACS может увеличить жизнеспособность клеток. Они включают в себя сортировку в прохладном сосуда, сохраняя клетки на льду в любое время, сортировка клеток в сосудах, которые содержат питательных сред, а также, металлизированный полученные клеточных популяций на культуральных планшетах, которые были предварительно покрыты с 10% желатина. Важно провести анализ чистоты пост-сортировки, с тем чтобы обеспечить чистоту отсортированных клеток.
Эта методика ограничена наличием FACS оборудования и опыта в объекте. Кроме того, как первичные образцы являются неоднородными, экспрессии поверхностных маркеров изменится на индивидуальной основе. Как упоминалось выше, очень важно, чтобы выполнить все эксперименты с низкими клеток прохода, а ASCс стать стареющей при распространении в культуре. Кроме того, известно, что ИСС обладают сдвиг в фенотипической экспрессии в условиях ин витро, который может привести к изменению биологии стволовых клеток. Таким образом, для клинического перевод, было бы оптимальным для получения высокоочищенного клеточной популяции для прямой трансплантации или посева клеток на леске без необходимости культивирования в пробирке. Кроме того, большие объемы липоаспирата, которые должны быть обработаны, чтобы изолировать SVF может быть обременительным для тех, кто незнаком с техникой, как это обсуждалось и рассмотрены Zuk и коллег в недавней публикации 13. В соответствии с методом, описанным Zuk и др., Этот протокол легко можно масштабировать вверх или вниз, чтобы вместить объем липоаспирата и могут быть адаптированы, чтобы изолировать ИСС из жировой ткани, полученной через абдоминопластике и других аналогичных процедур.
CD90 и CD105 ранее были определены как в начале мезенхимальных стволовых сELL маркеры, как в BM-MSC и населения ASC. В соответствии с предыдущих исследований, CD90 + популяции составляют примерно 50% от свежевыделенными СФДВ. 14 В отличие от этого, только около 5-10% от исходного СФДВ выражена CD105. 6 Следует отметить, что с последовательными проходами, выражение CD105 быстро увеличивается от почти от нуля до почти вездесущего выражении после 4-7 дней в культуре. Известно, что ИСС обладают значительным фенотипическим дрейф в процессе расширения в пробирке, которая может изменить биологию стволовых клеток. 15-17 идеале, клиническое применение стволовых клеток будет включать немедленное использование очищенных клеточных популяций для прямого трансплантации или посева на эшафот , без необходимости для выращивания в пробирке. Процент CD90 + клеток может варьироваться в зависимости от различных образцов липоаспирата в жировых депо в зависимости от происхождения и возраста-зависимым способом. Тем не менее, с использованием CD90 в клеточной поверхности маркера позволяет обогащения OFA субпопуляции человека ИСС с повышенной остеогенной потенциала. Этот метод остеогенной обогащения имеет потенциал, чтобы служить новое средство для стимулирования быстрого и надежного формирования костной ткани у пациентов с критическими размера скелетных дефектов. Мы регулярно заметить, что приблизительный выход клеток из стандартного липоаспирата 5 х 10 7 ядросодержащих клеток / 500 мл липоаспирата с использованием вышеупомянутого способа уборки урожая, хотя, как описано выше, это может варьироваться в зависимости от жировых депо происхождения или демографии пациентов. 18 Yoshimura и коллеги сообщили, что ИСС представляют 10-35% населения ядерных клеток в НВФ. 19 Таким образом, существует значительный потенциал для прямого посева лески для реализации инженерных стратегий костной ткани после остеогенной обогащения ИСС с использованием FACS.
Стволовые клетки на основе инженерно ткани для экспериментальных и клинических приложений часто требуется особо чистые популяции клеток. Другое приветметоды GH-пропускной очистки существовать как простых альтернатив FACS, включают панорамирование, истощение комплемента, и магнитно-активированный сортировки клеток (MACS). Тем не менее, в некоторых ситуациях, FACS является необходимым и предпочтительным: когда выделение высокочистых субпопуляций желательно, когда целевая поверхность маркера происходит нечасто в клеточной популяции, или когда клетки должны быть разделены на основе различных уровней экспрессии и той же поверхности маркер.
Использование как микрофлюидальный на основе одной клетки транскрипции анализ и флуоресценции активирован сортировки клеток, эндоглина (CD105) и Thy-1 (CD90), оказались связаны с различиями в ASC выражения остеогенных генов. Статистический анализ транскрипционных профилей одноклеточных показал, что низкая экспрессия CD105 и высокой экспрессией CD90 описать подгруппы ИСС с повышенной остеогенной мощности. Эти белки были впоследствии использованы для обогащения остеогенных клеток субпопуляций дerived от человеческого подкожной жировой ткани. 6,20
Вместе эти данные показывают эффективность сортировки ИСС на основе конкретных маркеров клеточной поверхности, которые коррелируют с остеогенной транскрипционной активности. Хотя целесообразность такого подхода показано здесь, за счет использования CD90 и CD105 в качестве примеров, дальнейший анализ должно быть сделано, чтобы включать в себя все перспективные комбинации экспрессии антигена поверхности, что высоко коррелируют с остеогенной транскрипционной активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов не имеют финансовую заинтересованность в какую-либо продукцию, устройств или наркотиков, упомянутых в этой рукописи. Ни один из авторов не имеют каких-либо конкурирующих финансовых интересов, чтобы сообщить.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным институтом исследований в области здравоохранения гранта R01-DE021683-01 и национальных институтов исследований в области здравоохранения гранта R01-DE019434 в MTL; Медицинского института Говарда Хьюза исследовательский грант на MTCDCW была поддержана ACS Франклин Мартин факультета исследовательский грант, The Hagey лаборатории детской регенеративной медицины и Стэнфордский исследовательский университет Здоровье ребенка института факультета Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable 250 ml Conical Tubes | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
References
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
- Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
- Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
- Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
- Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
- Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
- James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720 (2009).
- Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
- Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211 (2011).
- Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585 (2013).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
- Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
- McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
- Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8 (2014).
- Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
