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Neuroscience

गोल खिड़की झिल्ली के माध्यम से माउस भीतरी कान virally मध्यस्थता जीन डिलिवरी के लिए शल्य चिकित्सा पद्धति

Published: March 16, 2015 doi: 10.3791/52187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

Abstract

Sensorineural बधिरता से कार्यात्मक वसूली लक्ष्य को हासिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है जीन थेरेपी, सुनवाई हानि के लिए योगदान है कि अंतर्निहित आणविक और आनुवंशिक तंत्र की बेहतर समझ प्रदान करने के लिए वादा किया है। भीतरी कान में वैक्टर का परिचय मौजूदा ढांचे को चोट जबकि कम से कम व्यापक रूप से कोक्लीअ भर एजेंट वितरित कि एक तरह से किया जाना चाहिए। इस पांडुलिपि आणविक, pharmacologic, और चूहों प्रसव के बाद 10 दिन और गोल खिड़की झिल्ली (RWM) के माध्यम से पुराने वायरल वितरण का उपयोग माउस कर्णावत उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक के बाद चुपचाप कान मे कहा शल्य दृष्टिकोण का वर्णन है। खून की कमी को कम करने और पशु मृत्यु दर से परहेज करते हुए इस शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण स्काला त्य्म्पनी में तेजी से और प्रत्यक्ष वितरण सक्षम बनाता है। इस तकनीक को आवश्यक भीतरी और मध्य कान की संरचना के साथ ही गर्दन की मांसपेशियों को पूर्ण सुनवाई जबकि संरक्षण के लिए नगण्य या कोई नुकसान शामिल है। इस शल्य चिकित्सा तकनीक, vesicular glutam की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए3 पीटकर (VGLUT3 को) चूहों एक एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी-1) का उपयोग भीतरी कान को VGLUT3 के प्रसव के बाद सुनवाई ठीक हो जाए कि जन्मजात बहरेपन की एक माउस मॉडल का एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ट्रांसपोर्टर खा लिया।

Introduction

जीन थेरेपी लंबे आनुवंशिक सुनवाई हानि के लिए एक संभावित उपचार के रूप में सुझाव दिया गया है, लेकिन इस क्षेत्र में सफलता एक मायावी बनी हुई है। तिथि करने के लिए, virally मध्यस्थता के तरीके में अपेक्षाकृत दुर्गम कोक्लीअ के भीतर विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को लक्षित करने के रिप्ले की क्षमता की वजह से predominated है। दोनों एडिनोवायरस (ए वी) और एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) कर्णावत जीन डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया गया है। AAVs कारणों में से एक नंबर के लिए कोक्लीअ में फायदेमंद हैं। वे प्रतिकृति की कमी के वायरस होते हैं और कुशलता से न्यूरॉन्स, सुनवाई हानि के कारणों में से एक नंबर के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को ट्रांसजेनिक अणुओं स्थानांतरित कर सकते हैं। सेल में एएवी प्रविष्टि विशिष्ट रिसेप्टर्स 2 द्वारा मध्यस्थता है; सेल प्रकार transduced किया जा करने के साथ इस प्रकार, एक विशेष सीरोटाइप की पसंद संगत होना चाहिए। AAVs प्रभावी रूप से बालों की कोशिकाओं तीन transfect और टीआरए के स्थिर, लंबी अवधि की अभिव्यक्ति है, जिसके परिणामस्वरूप मेजबान जीनोम में शामिल कर सकते हैंnsgenic प्रोटीन और सेल 4 में प्ररूपी परिवर्तन। ऐसे बाल-सेल उत्थान के रूप में अल्पकालिक अनुप्रयोगों के लिए जरूरी नहीं कि फायदेमंद है, जबकि लंबी अवधि अभिव्यक्ति आनुवंशिक दोष के स्थिर बचाव के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। AAVs किसी भी मानव की बीमारी या संक्रमण के साथ जुड़े हैं और कोई ototoxicity 5,6,7 का प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं, क्योंकि वे हानि 8 सुनवाई की विरासत में मिला रूपों के लिए जीन थेरेपी में इस्तेमाल के लिए एक आदर्श उम्मीदवार हैं।

वायरल वैक्टर का उपयोग स्तनधारी भीतरी कान में बहिर्जात आनुवंशिक सामग्री का स्थानांतरण पिछले दशक में अध्ययन किया गया है और नुकसान नौ की सुनवाई के आनुवंशिक और अधिग्रहण दोनों रूपों के इलाज के लिए एक आशाजनक तकनीक के रूप में उभर रहा है। कोक्लीअ संभवतः कई कारणों के लिए जीन थेरेपी के लिए एक आदर्श लक्ष्य है: अपने छोटे मात्रा की जरूरत वायरस की एक सीमित मात्रा में आवश्यक 1); अन्य अंग प्रणालियों सीमा दुष्प्रभाव से 2) अपने रिश्तेदार अलगाव; और 3) अपने तरल पदार्थ से भरे कक्षों वायरल की सुविधा केभूलभुलैया 10, 11,12,13,14, 15 भर में वितरण।

जन्मजात बधिरता के माउस मॉडल एक व्यवस्थित, replicable रास्ते में भीतरी कान के विकास पर नजर रखने के अध्ययन के कई तरीके के प्रयोग के लिए अनुमति देते हैं। माउस cochleae के छोटे आकार के कुछ शल्य कठिनाई पेश करता है, माउस अन्य प्रजातियों के 16 से अधिक कई प्रयोगात्मक फायदे के साथ आनुवंशिक सुनवाई हानि के अध्ययन में एक अत्यंत महत्वपूर्ण मॉडल के रूप में कार्य करता है। माउस मॉडल आनुवंशिक संबंध विश्लेषण, विस्तृत रूपात्मक टिप्पणियों का संग्रह है, और रोगजनक परिदृश्यों का अनुकरण के माध्यम से विशेषताओं की एक सीमा के आकलन के लिए अनुमति देते हैं; जैसे, वे virally मध्यस्थता जीन थेरेपी के लिए अच्छा उम्मीदवार हैं। तकनीकी विकास के साथ संयुक्त चूहों में व्यापक आनुवंशिक अध्ययनों से यह संभव प्रयोगशालाओं 17,18, 19, 20,21 के पार एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों उत्पन्न करने के लिए बनाया है। Furthermorदोनों हासिल कर लिया और इस पशु मॉडल 22, 23,24 में कठोर परीक्षण की इजाजत दी, चूहों में सुनवाई हानि phenotypes के विरासत में मिला लिए ई, कई मॉडल मौजूद हैं। इस प्रकार, एक माउस मॉडल में virally मध्यस्थता जीन थेरेपी का उपयोग करते हुए सुनवाई को सही करने के लिए मानव रोग के लिए एक इलाज के लिए खोज में एक उपयुक्त पहला कदम है।

हम पहले vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 3 (VGLUT3) की कमी ट्रांसजेनिक चूहों की वजह से आईएचसी रिबन अन्तर्ग्रथन 25 में ग्लूटामेट रिहाई की कमी के बहरा पैदा कर रहे हैं कि पता चला है। इस उत्परिवर्तन संवेदी बालों की कोशिकाओं के एक प्राथमिक अध: पतन के लिए नेतृत्व नहीं है, क्योंकि इन उत्परिवर्ती चूहों संभावित जन्मजात सुनवाई हानि के लिए कर्णावत जीन थेरेपी का परीक्षण करने के लिए, जिसमें एक उत्कृष्ट मॉडल हैं।

तिथि करने के लिए, कर्णावत जीन थेरेपी के लिए वायरल वितरण तकनीकों का एक नंबर एक cochleostomy के माध्यम से गोल खिड़की झिल्ली प्रसार, गोल खिड़की झिल्ली इंजेक्शन, और वितरण सहित वर्णित किया गया है। प्रबल कर रहे हैंial फायदे और इन तरीकों नौ में से प्रत्येक का नुकसान।

यहाँ हम दौर खिड़की झिल्ली (RWM) के माध्यम से VGLUT3 को माउस भीतरी कान के लिए virally मध्यस्थता जीन डिलीवरी के लिए एक शल्य चिकित्सा पद्धति की रिपोर्ट। पोस्ट-auricular RWM इंजेक्शन विधि उत्कृष्ट सुनवाई संरक्षण के साथ न्यूनतम इनवेसिव है, और अपेक्षाकृत तेज है। हम पहले से प्रकाशित किया है, इस माउस मॉडल में सुनवाई बहाल करने के प्रयास में, VGLUT3 जीन (AAV1-VGLUT3) ले जाने के लिए एक AAV1 वेक्टर प्रसव के बाद 12 दिन में इन बहरा चूहों के कोक्लीअ में पेश किया गया था (पी! @), जिसके परिणामस्वरूप में 26 सुनवाई की बहाली। Transgene प्रोटीन अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) का उपयोग कर सत्यापित किया गया था, जबकि VGLUT3 को चूहों में सुनवाई, श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) द्वारा सत्यापित किया गया था। इस पद्धति इस प्रकार virally की मध्यस्थता जीन थेरेपी होगा अन्यथा बहरापन में यह परिणाम है कि एक आनुवांशिक दोष सही कर सकते हैं कि यह दर्शाता है।

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Protocol

नोट: एनआईएच नैतिकता दिशा निर्देशों और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, सैन फ्रांसिस्को की मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल आवश्यकताओं के साथ पालन सभी प्रक्रियाओं और पशु हैंडलिंग।

1. सर्जरी के लिए पशु की तैयारी

  1. एक साफ, समर्पित अंतरिक्ष में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को पूरा। सर्जरी से पहले एक गिलास मनका अजीवाणु साथ बाँझ, सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, प्रसव के बाद दिन में 10-12 (P10-12) FVB चूहों का उपयोग करें। अलग अलग उम्र और चूहों के तनाव एक विशेष परियोजना की जरूरतों को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Bulla हड्डी कठिन हो जाता है क्योंकि P40 से बड़े चूहों चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
  2. Ketamine हाइड्रोक्लोराइड (100 मिलीग्राम / किग्रा), xylazine हाइड्रोक्लोराइड (10 मिलीग्राम / किग्रा), और acepromazine (किग्रा / 2 मिलीग्राम) के एक मिश्रण की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहों anesthetize। जानवर अब इस तरह के पैर की अंगुली चुटकी के रूप में दर्दनाक उत्तेजनाओं, को प्रतिक्रिया के बाद ही शल्य चिकित्सा की तैयारी शुरू करो। यदि necessarवाई, मूल संवेदनाहारी विमान बहाल करने के लिए संवेदनाहारी कॉकटेल के एक बूस्टर खुराक (एक पांचवें मूल खुराक) प्रशासन।
    नोट: इस उम्र में मनाया मृत्यु दर के सबसे संवेदनाहारी अधिक मात्रा के कारण होता है, क्योंकि इस कदम पर अपना ध्यान रखना।
  3. जानवर की झपकी पलटा दबा, संज्ञाहरण के दौरान नम आंखों रखने के लिए एक सुरक्षात्मक नेत्र मरहम के साथ पशु की आंखों को कवर किया।
  4. माउस पूरी तरह से जाग रहा है जब तक के बाद संज्ञाहरण हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए, प्रक्रिया के दौरान एक हीटिंग पैड पर बढ़ाया गर्दन के साथ माउस की स्थिति।
  5. एक क्लिपर के साथ छोड़ दिया के बाद auricular क्षेत्र दाढ़ी और शल्य हेरफेर से पहले 70% इथेनॉल और povidone आयोडीन के साथ कीटाणुरहित।

2. सर्जिकल प्रक्रिया तथा वेक्टर इंजेक्शन

  1. मध्य कर्ण Bulla बेनकाब करने के लिए एक के बाद चुपचाप कान मे कहा दृष्टिकोण का प्रयोग करें। पोस्ट-auricular मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए छोटे कैंची से चमड़े के नीचे ऊतक काटकर अलग कर देना। वसा ऊतकों retracting वें के बादचीरा के ई पीछे की ओर, लौकिक हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए चीरा सीधा करने के लिए सही और बाईं ओर करने के लिए मांसपेशियों को अलग। इस चीरा पर्याप्त दृश्य के साथ आराम से काम करने के लिए काफी लंबे समय है कि सुनिश्चित करें।
  2. एक 25 जी सुई के साथ मध्य कर्ण Bulla छेदना और कोक्लीअ के बेसल बारी करने के लिए उपयोग की अनुमति के लिए पीठ की हड्डी छीलने से संदंश के साथ आवश्यक के रूप में छेद का विस्तार करें, और उसके बाद stapedial धमनी और गोल खिड़की झिल्ली कल्पना करने के लिए पर्याप्त रूप से चौड़ा (RWM) ।
  3. एक borosilicate केशिका विंदुक के साथ केंद्र में धीरे RWM पंचर। इस बिंदु पर RWM के माध्यम से तरल पदार्थ तपका निरीक्षण करें; यह सामान्य है। तपका स्थिर हो गया है रुको जब तक (कोक्लीअ से effluxed द्रव एक बाँझ फिल्टर पेपर के साथ सूख जाता है)।
    नोट: पकड़े और RWM वेध संभव के रूप में छोटे रूप में है, इसलिए है कि गिलास सुई को आगे बढ़ाने जब ख्याल रखना। इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप पर निर्भर करता है, pipettes के एक पिपेट का उपयोग कर एक micromanipulator का उपयोग कर या हाथ से पकड़धारक।
  4. उसी तरह से पैच दबाना pipettes तैयार कर रहे हैं डांड़ी एक पिपेट का उपयोग इंजेक्शन के लिए pipettes तैयार करें। टिप व्यास बड़े (लगभग 15 माइक्रोन व्यास में) बाहर में वायरस pipetting और आसानी से किया जाता है कि इतना है कि सुनिश्चित करें।
  5. एक इंजेक्शन पिपेट में AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP या AAV2-GFP के 1 से 2 μl ड्रा। तपका (5 मिनट 10) स्थिर, microinject एक ही छेद के माध्यम से स्केला टिम्पनी में यह तय मात्रा पहले से RWM में किया जाता है के बाद।
  6. पेशी का एक छोटा सा प्लग के साथ पिपेट बाहर खींच के बाद जल्दी से आरडब्ल्यू आला सील और दौर की खिड़की से रिसाव से बचने के लिए पेशी पर रखा गया ऊतक चिपकने की एक छोटी सी बूंद के साथ सुरक्षित।
    नोट: बहुत अच्छी तरह से सुई कोक्लीअ-इस कदम से किसी भी perilymph रिसाव को रोकने के लिए पेशी का एक छोटा सा प्लग के साथ हटा दिया जाता है के बाद इस छेद सील सुनवाई की रक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण है। सील करने के लिए विफलता पूरी तरह से RWM समय के साथ सुनवाई हानि में परिणाम होगा।
  7. इंजेक्शन के बाद, कवरवसा ऊतकों के साथ श्रवण Bulla में छेद, उनके सामान्य स्थिति में पोस्ट-auricular मांसपेशियों और वसा ऊतकों लौटने और एक 6-0 या छोटे से absorbable क्रोमिक सीवन के साथ परतों में घाव सीवन।
  8. Povidone आयोडीन के साथ घाव कीटाणुरहित।

3. पश्चात की देखभाल

  1. एक गर्म पिंजरे में चूहों प्लेस और वे पूरी तरह से वापस तो माँ के साथ उन्हें स्थानांतरित बरामद कर रहे हैं जब तक उन्हें नायाब मत छोड़ो। यह मां के साथ वापस पिल्ले डालने से पहले पिंजरे से पुरुष को दूर करने के लिए सिफारिश की है।
  2. सूजन और दर्द का प्रबंधन करने के लिए चमड़े के नीचे Carprofen postoperatively के एनलजेसिया और तीन दिनों के लिए उसके बाद हर 24 घंटे के लिए (2 मिलीग्राम / किग्रा), प्रशासन। संकट, असामान्य वजन घटाने, दर्द, या संक्रमण के लक्षण के लिए दैनिक जानवरों की निगरानी करें। आम तौर पर सभी चूहों को सामान्य रूप में अभिनय किया जाना चाहिए सर्जरी के बाद 3 दिन के द्वारा। संकट या बीमारी के कोई लक्षण 3 दिन के बाद एक माउस में दिखाई देते हैं, टी euthanizing पर विचारसंस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार वह माउस।

श्रवण brainstem रिस्पांस (ABR) रिकॉर्डिंग का उपयोग वायरल प्रसव के बाद Cochlear फंक्शन 4. आकलन

नोट: श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) एक श्रवण खोपड़ी के अंतर्गत रखा इलेक्ट्रोड के माध्यम से मस्तिष्क में चल रही बिजली की गतिविधि से निकाला और दर्ज संभावित पैदा की है। पशु ध्वनि के साथ प्रेरित है। जिसके परिणामस्वरूप रिकॉर्डिंग एक श्रवण उत्तेजना की शुरुआत के बाद पहली बार 10 मिसे में श्रवण मार्ग में लगातार अंक की विद्युतीय गतिविधि को प्रतिबिंबित कि पाँच लहरों के होते हैं।

  1. Acepromazine बिना छोड़कर, इस प्रोटोकॉल की धारा 1.2 में वर्णित के रूप में ketamine हाइड्रोक्लोराइड और xylazine हाइड्रोक्लोराइड का एक मिश्रण की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize।
  2. माउस पूरी तरह से जाग रहा है जब तक के बाद संज्ञाहरण हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए, श्रवण परीक्षण के दौरान एक हीटिंग पैड पर माउस रखें।
    नोट: का प्रयोग करेंइस प्रयोग में निम्नलिखित ध्वनि उत्तेजनाओं: (; 31 हर्ट्ज प्रस्तुति दर 5 मिसे अवधि) पर क्लिक करें।
  3. बाएं कान (संदर्भ) के पंख के नीचे, शिखर पर subdermal सुई इलेक्ट्रोड, जगह और contralateral कान के नीचे (भूमि) और पहले एक साउंड प्रूफ कक्ष 27,28 में वर्णित के रूप में रिकॉर्डिंग ABRs शुरू करते हैं। नीचे अधिकतम आयाम से 5 डीबी ध्वनि दबाव स्तर के अंतराल में रिकॉर्ड ABR waveforms।
  4. ABR थ्रेसहोल्ड postoperatively के रूप में जल्दी के रूप में 4 दिनों वायरल प्रसव के बाद निर्धारित बनाने के लिए
    नोट: थ्रेसहोल्ड लहरों के लिए चोटियों प्रतिक्रिया है, जिस पर सबसे कम उत्तेजना स्तर के रूप में परिभाषित किया गया है कि मैं वी स्पष्ट रूप से कर रहे थे और दृश्य निरीक्षण पर बार-बार उपस्थित।
  5. मैं कर्णावत तंत्रिका से गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए वेव उपाय। एक detectable ABR तरंग है कि पैदावार सबसे कम उत्तेजना स्तर दहलीज के रूप में परिभाषित किया गया है।

Immunofluorescence का उपयोग 5. Cochlear Transgene प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. Intrap की एक ज्यादा से चूहों anesthetizeKetamine हाइड्रोक्लोराइड और xylazine हाइड्रोक्लोराइड का एक मिश्रण की eritoneal इंजेक्शन acepromazine बिना छोड़कर, इस प्रोटोकॉल की धारा 1.2 में वर्णित है।
  2. जानवर अब इस तरह के पैर की अंगुली चुटकी के रूप में दर्दनाक उत्तेजनाओं, को प्रतिक्रिया के बाद ही सिर सिर काटना।
  3. 26 में वर्णित के रूप में पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए बाहर है और इस प्रक्रिया cochleae काटना। विरोधी VGLUT3 और विरोधी मायोसिन 7A एंटीबॉडी का उपयोग कर्णावत पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस की एक विस्तृत प्रोटोकॉल अकिल एट अल।, 2013 29 में वर्णित है।
  4. 250 कमजोर पड़ने: GFP लेबलिंग के लिए, एक पर एक खरगोश विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कर्णावत पूरे आरोह सेते हैं।
  5. पीबीएस में 4000: पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए दो बार cochleae कुल्ला और फिर Cy2 संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी में 2 घंटे के लिए सेते एक पतला।
  6. 10 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ cochleae कुल्ला और 15 मिनट के लिए DAPI के साथ उन्हें सेते हैं।
  7. गिलास स्लाइड पर cochleae माउंट और अंड का निरीक्षणconfocal इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ एक खुर्दबीन एर।

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Representative Results

तकनीकी सुविधाओं और कर्णावत आणविक चिकित्सा के लिए पोस्ट-auricular दृष्टिकोण की उपयोगिता को सत्यापित करने के लिए, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP और AAV2-GFP के RWM के माध्यम से P10-12 चूहों भीतरी कान में कर दिया गया। यह दृष्टिकोण इनर बालों की कोशिकाओं के भीतर सफल transgene अभिव्यक्ति को दर्शाता है (आईएचसी) (VGLUT3 चित्रा 1 और GFP चित्रा 2 और GFP चित्रा 3A), बाहरी बालों की कोशिकाओं (OHC) (GFP के चित्रा 2) और समर्थन कोशिकाओं (GFP के चित्रा 2 और चित्रा 3 ए) 26 कोर्टी चोट के महत्वपूर्ण अंग के बिना। कर्णावत पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों (चित्रा 2 और चित्रा 3A) में देखा GFP व्यक्त विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का अवलोकन एएवी सीरोटाइप की पसंद transduced जा करने के लिए सेल प्रकार के साथ संगत होना चाहिए कि यह दर्शाता है। चित्रा 2 और चित्रा 3 ए 1, चित्रा 26 बहुत अच्छा टीआर दिखानेIHCs और OHCs दोनों में ansfection, साथ ही AAV1 या AAV2-GFP या AAV1-VGLUT3 अभिकर्मक के बाद कोक्लीअ भर transgene प्रोटीन (GFP / VGLUT3) का वितरण। AAV1-VGLUT3 अभिकर्मक (3B चित्रा) के बाद VGLUT3 व्यक्त IHCs का वितरण 26 RWM के माध्यम से अभिकर्मक करीब वायरल वितरण की साइट के लिए उच्च अभिकर्मक दरों को सूचित किया है कि अन्य तरीकों से पूरी कोक्लीअ के माध्यम से और अधिक प्रभावी और वर्दी है कि पता चलता है। हम अभिकर्मक दर (चित्रा 1) 26 भीतरी कान में इंजेक्शन वायरस की मात्रा को बढ़ाने के द्वारा और अधिक प्रभावी बनाया जा सकता है कि मिल गया है।

कोई कर्णावत क्षति के साथ VGLUT3 को माउस IHCs में सफल VGLUT3 अभिव्यक्ति की हमारी अवलोकन बचाया को चूहों में ABRs को मापने के द्वारा सुनवाई का परीक्षण करने के लिए हमें का नेतृत्व किया। चित्रा -4 ए और 4B चित्रा 26 दस्तावेज़ में AAV1-VGLUT3 के बाद चुपचाप कान मे कहा RWM वितरण की क्षमता आंतरिक ईVGLUT3 को चूहों की गिरफ्तारी जन्मजात सुनवाई हानि के इस माउस मॉडल में बचाव सुनवाई का उत्पादन करने के लिए। श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) निशान को (चित्रा -4 ए) बचाया VGLUT3 में बहाल, और ABR थ्रेसहोल्ड जंगली प्रकार चूहों (4B चित्रा) में देखा उन लोगों के लिए औसत दर्जे का है और तुलनीय थे।

चित्र 1
चित्रा 1:। P10-P12 को चूहों को RWM वायरल प्रसव के बाद VGLUT3 आईएचसी अभिकर्मक ट्रांसफ़ेक्ट cochleae विरोधी Myo7a एंटीबॉडी, एक बाल-सेल मार्कर, और VGLUT3 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर immunofluorescence द्वारा P30 पर जांच की गई। को चूहों से IHCs Myo7a ही व्यक्त करते हुए Myo7a और VGLUT3, केवल गुम्मट में सभी IHCs में व्यक्त किया गया। बचाया माउस cochleae VGLUT3 व्यक्त कुछ IHCs दिखाया है, और सभी IHCs Myo7a (पंक्ति 3) आईएचसी व्यक्त की। इनर बालों की कोशिकाओं। से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण26। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: माउस कर्णावत पूरे माउंट जंगली प्रकार P10-P12 चूहों को RWM AAV2-GFP के वितरण AAV2-GFP माउस कोक्लीअ करने के बाद चुपचाप कान मे कहा दृष्टिकोण का उपयोग वायरल वितरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस।। AAV2-GFP के वितरण P10-12 में किया गया था और ट्रांसजेनिक GFP अभिव्यक्ति एक विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग P21 पर कोक्लीअ में जांच की गई थी। WT चूहों में GFP अभिव्यक्ति (हरा) कर्णावत पूरे माउंट इनर बालों की कोशिकाओं (आईएचसी) की तुलना में बाहरी बालों की कोशिकाओं (OHC) में मजबूत GFP अभिव्यक्ति दिखा।

चित्र तीन
चित्रा 3: माउस Coc GFP के कोक्लीअ अभिव्यक्ति के लिए AAV1-GFP के वितरण इनर बालों की कोशिकाओं (आईएचसी) और समर्थन कोशिकाओं (ए), लेकिन नहीं OHCs में देखा जाता है जंगली प्रकार P10-P12 चूहों को RWM AAV1-GFP के प्रसव के बाद। बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस-पूरा पर्वत hlear , VGLUT3 को चूहों (बी) के कोक्लीअ को AAV1-VGLUT3 वितरण VGLUT3 अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप केवल IHCs में जबकि। AAV1-VGLUT3 प्रसव के बाद VGLUT3 को चूहों कोक्लीअ में VGLUT3 व्यक्त IHCs की संख्या भीतरी कान के लिए दिया वायरस की राशि का निर्भर करता है; वायरस के 0.6 μl इंजेक्ट किया गया था जब वायरस की एक μl दिया गया था के बाद IHCs की 100% VGLUT3 व्यक्त जबकि उदाहरण के लिए, IHCs का 40%, VGLUT3 व्यक्त किया। वायरस के 0.6 μl इंजेक्ट किया गया था जब सुप्रीम मध्य बारी, या आधार के बीच VGLUT3 अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं था। 26 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण।

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। चित्रा 4: श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) आकलन AAV1-VGLUT3 प्रसव के बाद प्रतिनिधि ABR waveforms बचाया और जंगली प्रकार चूहों के बीच इसी तरह के थे; इसके विपरीत, कोई ABR waveforms को चूहों (ए) में देखा गया था। बचाया को चूहों भी औसत दर्जे का ABR थ्रेसहोल्ड दिखाया। ये ABR थ्रेसहोल्ड मापा सभी आवृत्तियों (बी) के लिए WT चूहों में देखा उन लोगों के बराबर थे। मैं:। 26 से अनुमति के साथ ABR लहर आई पुनर्मुद्रण यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस काम में, हम विस्तार से बहाल करने या एक आनुवंशिक दोष से समझौता किया है कि सामान्य श्रवण समारोह बचाव के लक्ष्य के साथ, कर्णावत जीन थेरेपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तकनीक का वर्णन है। यह आम तौर पर Atraumatic है के रूप में, इस दृष्टिकोण कर्णावत जीन स्थानांतरण या अन्य संभावित आणविक उपचारों 30 के लिए सुरक्षित है। कर्णावत उपचार के लिए अन्य तरीकों एक उदर दृष्टिकोण 24, माउस और गिनी पिग में cochleostomy 31,32 और अन्त: कर्णोदकीय थैली वितरण 33 सहित वर्णित किया गया है। हमारे अनुभव में, बाद के auricular दृष्टिकोण तेज, सरल है, और कम चोट और पशु मृत्यु दर के साथ जुड़े। इसके अलावा, के बाद चुपचाप कान मे कहा दृष्टिकोण आघात का कम मौका और 34,35,36 सुनवाई के जुड़े नुकसान के साथ RWM के बेहतर दृश्य प्रदान करता है। इस रिपोर्ट वीं में AAV1-VGLUT3 की डिलीवरी का प्रदर्शन करके कर्णावत आणविक चिकित्सा के लिए पोस्ट-auricular दृष्टिकोण के तकनीकी पहलुओं और उपयोगिता दस्तावेजोंVGLUT3 और GFP (चित्रा 1 और चित्रा 2 और चित्रा 3A) दोनों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप और जन्मजात सुनवाई हानि के इस माउस मॉडल में बचाव सुनवाई RWM के माध्यम से ई भीतरी कान,। जीन डिलीवरी के लिए विधियों का वर्णन पूर्व के अध्ययन कोर्टी 12,37,38,39,40,41 के अंग के महत्वपूर्ण क्षेत्रों में ही सीमित ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति दिखाया। इन मतभेदों कोक्लीअ में वायरल तैयारी की गुणवत्ता, वायरल वेक्टर के अनुमापांक, प्रयोग सीरोटाइप, या बस अपर्याप्त वायरल वितरण के कारण हो सकता है। इसके विपरीत, इस के बाद चुपचाप कान मे कहा दृष्टिकोण का उपयोग कर हम कोक्लीअ भर AAV2-GFP अभिकर्मक (चित्रा 2 और चित्रा 3 ए) के बाद दोनों आंतरिक और बाह्य बालों की कोशिकाओं और एक पत्रकार जीन (GFP) के वितरण के लिए बहुत अच्छा अभिकर्मक दर प्राप्त करने में सक्षम थे। AAV1-VGLUT3 (3B चित्रा) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट IHCs के प्रतिशत के आधार पर हमने RWM के माध्यम से अभिकर्मक अधिक eff के सुझाव है किवायरल आवेदन 42 की साइट के लिए करीब बेसल बारी में उच्च अभिकर्मक दरें, जो सूचना दी गिनी पिग, में वर्णित है कि सहित अन्य तरीकों की तुलना में पूरे कोक्लीअ के माध्यम से ective और वर्दी। कम से कम एक साल और एक आधे के लिए कोक्लीअ के भीतर GFP / VGLUT3 के दीर्घकालिक अभिव्यक्ति, अन्य पशु मॉडल और विभिन्न अंग प्रणालियों 38,43 से प्राप्त आंकड़ों के अनुरूप है।

इसके अतिरिक्त, ट्रांसफ़ेक्ट कोक्लीअ के histologic विश्लेषण हलकी लीक vascularis और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स 26 सहित Corti के अंग के cytoarchitecture के उत्कृष्ट संरक्षण के साथ, एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के कोई सबूत का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, एक cochleostomy कार्यरत तरीकों कि इसके विपरीत में, वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल RWM अभिकर्मक कर्णावत नुकसान का कारण नहीं था, और अधिक मात्रा में 31,32 इंजेक्ट किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग आघात का अभाव बराबर ABR thresho प्रदर्शन द्वारा सत्यापित किया गया थासंचालित और नियंत्रित कर कान के बीच LDS, एक 4 अंत में, RWM के माध्यम से एएवी-VGLUT3 वितरण ABR में हुई एट अल। ज़िया ने देखा है कि इसी तरह WT चूहों (चित्रा -4 ए और 4B चित्रा) 26 में देखा उन लोगों के बराबर थ्रेसहोल्ड ढूँढने। हम चूहों के सभी उम्र में इस तकनीक का इस्तेमाल किया है, लेकिन Bulla हड्डी छेदना करने के लिए कठिन हो जाता है और Bulla से टूटी हुई हड्डी युवा चूहों की तुलना में पुराने में तेज है, क्योंकि यह P40 से अधिक उम्र के चूहों में तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है। Bulla हड्डी का एक टुकड़ा गर्दन ऊतकों lacerates अगर बड़ी उम्र में, सावधानी से नहीं लिया जाता है तो खून बह रहा हो सकता है।

पहले से दिखाया गया था के रूप में अंत में, इस रिपोर्ट को एक एएवी आधारित सदिश का उपयोग माउस में कर्णावत कोशिकाओं के कई प्रकार में सफल जीन स्थानांतरण दस्तावेजों। जीन डिलीवरी की इस तकनीक को सुनने के नुकसान के लिए नेतृत्व नहीं करता है, आघात को कम करता है, और कोक्लीअ, इंक के भीतर सेल प्रकार की एक किस्म के व्यापक अभिकर्मक में परिणाम कर सकते हैंबालों की कोशिकाओं और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स luding। यह सुनने के नुकसान की जन्मजात और अधिग्रहण रूपों के अन्य प्रकारों के लिए काफी संभावना आवेदन किया है, और यह भी सुनवाई हानि के माउस मॉडल में आणविक उपचारों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

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References

  1. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  2. Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
  3. Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
  4. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
  5. Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
  6. Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
  7. Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
  8. Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
  9. Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
  10. Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
  11. Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
  12. Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  13. Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
  14. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  15. Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
  16. Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
  17. Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
  18. Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
  19. Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
  20. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  21. Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
  22. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
  23. Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
  24. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  25. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  26. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  27. Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
  28. Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
  29. Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
  30. Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  31. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  32. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  33. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  34. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  35. Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
  36. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  37. Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
  38. Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
  39. Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
  40. Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
  41. Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
  42. Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
  43. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 97 जीन थेरेपी अभिकर्मक एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) माउस कोक्लीअ इनर बालों की कोशिकाओं (आईएचसी) Vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 3 (VGLUT3)।
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Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

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