Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kirurgisk metode for viralt genavlevering til Mouse Inner Ear gjennom det runde vinduet Membrane

Published: March 16, 2015 doi: 10.3791/52187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

Abstract

Genterapi, som brukes for å oppnå funksjonell utvinning fra sensorineurale døvhet, lover å gi bedre forståelse av de underliggende molekylære og genetiske mekanismer som bidrar til hørselstap. Innføring av vektorer inn i det indre øret må gjøres på en måte som er mye distribuerer midlet gjennom hele sneglehuset samtidig minimere skade på det eksisterende strukturer. Dette manuskriptet beskriver en post-auricular kirurgiske tilnærming som kan brukes for mus cochlea terapi bruker molekylære, farmakologisk, og viral levering til mus postnatal dag 10 og eldre via det runde vinduet membran (RWM). Det kirurgiske tilnærming muliggjør rask og direkte levering i scala tympani samtidig minimere blodtap og unngå dødelighet dyr. Denne teknikken innebærer ubetydelig eller ingen skade på viktige strukturer i indre og mellomøret samt nakkemusklene mens helt bevare hørselen. For å demonstrere effekten av dette kirurgisk teknikk, vesicular glutamspiste transporter 3-knockout (VGLUT3 KO) mus blir brukt som et eksempel på en musemodell av medfødt døvhet som gjenoppretter høre etter levering av VGLUT3 til det indre øret ved hjelp av en adenoassosiert virus (AAV-1).

Introduction

Genterapi har lenge vært foreslått som en potensiell behandling for genetisk hørselstap, men suksess på dette området har vært unnvikende en. Hittil har viralt medierte metoder dominerte grunn den teoretiske muligheten til å målrette bestemte celletyper innenfor den relativt utilgjengelig cochlea. Begge adenovirus (AV) og adenoassosiert virus (AAV) har vært brukt i cochlea genavlevering. AAVs er fordelaktige i sneglehuset for en rekke årsaker. De er replikering-mangel virus og effektivt kan overføre transgene molekyler til ulike celletyper, inkludert nevroner, et viktig mål for en rekke årsaker til hørselstap. AAV inntreden i cellen blir mediert av spesifikke reseptorer 2; Således må valget av en bestemt serotype være kompatibelt med de celletypene som skal omformes. AAVs effektivt kan transfektere hårceller 3 og innlemme i vertsgenomet, hvilket resulterer i stabile, langtids ekspresjon av transgenic protein og fenotypisk endring i cellen 4. Selv om ikke nødvendigvis en fordel for kortsiktige programmer som hår-celle gjenfødelse, er langsiktig uttrykk veldig viktig for stabil redning av genetiske defekter. Fordi AAVs ikke er forbundet med noen menneskelig sykdom eller infeksjon og demonstrere ingen ototoksisitet 5,6,7, de er en ideell kandidat for bruk i genterapi for nedarvede former for hørselstap 8.

Overføring av eksogene genetisk materiale inn i pattedyr indre øret ved hjelp av virale vektorer er undersøkt de siste ti årene og fremstår som en lovende teknikk for behandling av både genetiske og ervervede former for hørselstap 9. Sneglehuset er potensielt et ideelt mål for genterapi av flere grunner: 1) sin lille volum nødvendiggjør en begrenset mengde av viruset nødvendig; 2) sin relative isolasjon fra andre organsystemer grenser bivirkninger; og 3) dets væskefylte kamre lette virallevering over hele labyrinten 10, 11,12,13,14, 15.

Musemodeller av medfødt døvhet tillate bruk av mange metoder for studie for å overvåke utviklingen av det indre øret på en systematisk, replicable måte. Mens den lille størrelsen på muse cochleae ikke presentere noen kirurgisk vanskelighetsgrad, fungerer musen som en svært viktig modell for studiet av genetiske hørselstap, med flere eksperimentelle fordeler fremfor andre arter 16. Musemodeller tillate vurdering av en rekke egenskaper gjennom genetisk kobling analyse, innsamling av detaljerte morfologiske observasjoner, og simulere patogene scenarier; som sådan, de er gode kandidater for viralt mediert genterapi. Omfattende genetiske studier på mus kombinert med teknologiske fremskritt har gjort det mulig å generere genmodifiserte mus i en reproduserbar måte på tvers av laboratorier 17,18, 19, 20,21. Furthermore, det finnes mange modeller for både kjøpt og arvet hørselstap fenotyper hos mus, slik streng testing i denne dyremodell 22, 23,24. Dermed korrigere hørsel ved hjelp av viralt mediert genterapi i en musemodell er en passende første skritt i jakten på en kur for sykdom hos mennesker.

Vi har tidligere vist at transgene mus som manglet vesicular glutamat Transporter 3 (VGLUT3) er født døv på grunn av mangel av glutamat utgivelse i IHC bånd synapse 25. Fordi denne mutasjonen ikke fører til en primær degenerasjon av den sensoriske hårceller, disse mutante mus er potensielt en utmerket modell for å teste cochlea genterapi for medfødt hørselstap.

Hittil har en rekke virus leverings teknikker for cochlea genterapi blitt beskrevet, inkludert rundt vindu membran diffusjon, runde vinduet membran injeksjon, og levering via en cochleostomy. Det er potenteial fordeler og ulemper ved hver av disse tilnærmingene 9.

Her rapporterer vi en kirurgisk metode for viralt genavlevering til VGLUT3 KO mus indre øret gjennom det runde vinduet membran (RWM). Den post-auricular RWM injeksjon metode er minimal invasiv med utmerket hørsel bevaring, og er relativt rask. Som vi tidligere har publisert, i et forsøk på å gjenopprette hørsel i denne musemodellen, ble en AAV1 vektor som bærer genet VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) føres inn i sneglehuset av disse døve mus ved postnatal dag 12 (P! @), Noe som resulterer i restaurering av å høre 26. Hørsel i VGLUT3 KO mus ble verifisert av auditive hjernestammen respons (ABR), mens transgene protein uttrykk ble bekreftet ved hjelp immunfluorescens (IF). Denne metodikken demonstrerer dermed at viralt-mediert genterapi kan korrigere en genetisk feil som ellers ville resulterer i døvhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer og dyr håndtering holdt NIH etiske retningslinjer og godkjent protokoll kravene i Institutional Animal Care og bruk komité ved University of California, San Francisco.

1. Klargjøre Animal for kirurgi

  1. Utføre kirurgiske prosedyrer i en ren, dedikert plass. Autoklav alle kirurgiske instrumenter, sterilisere med et glass-perle sterilisator før operasjonen.
    MERK: I denne protokollen, bruker postnatal dag 10-12 (P10-12) FVB mus. Ulike aldre og stammer av mus kan brukes til å møte behovene til et bestemt prosjekt. Mus eldre enn P40 kan være utfordrende fordi bulla bein blir enda vanskeligere.
  2. Bedøve mus med intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin-hydroklorid (100 mg / kg), xylazin-hydroklorid (10 mg / kg) og acepromazin (2 mg / kg). Begynn kirurgisk forberedelse først etter at dyret ikke lenger reagerer på smertefulle stimuli, for eksempel tå klype. Hvis imidlertid nødvendigy, administrere en boosterdose (en femtedel opprinnelig dose) av narkosen cocktail å gjenopprette den opprinnelige bedøvelse flyet.
    MERK: Ta vare på dette trinnet fordi det meste av dødelighet observert ved denne alderen er forårsaket av bedøvelse overdose.
  3. Dekke dyrets øyne med en beskyttende oftalmisk salve for å holde øynene fuktige under anestesi, undertrykke dyrets blunkerefleksen.
  4. Før musen med halsen utvidet på en varmepute gjennom hele prosedyren før musen er helt våken, for å forebygge post anestesi hypotermi.
  5. Barbere venstre post-aurikulær region med en klipper og desinfiser med 70% etanol og povidon-jod før kirurgisk manipulering.

2. Kirurgisk prosedyre og Vector Injection

  1. Bruk en post-aurikulær tilnærming for å avdekke tromme bulla. Incise underhudsvevet med liten saks for å avsløre den post-aurikulær muskel. Etter trekke tilbake fettvev til the bakre side av snittet, skille musklene til høyre og venstre side vinkelrett på snittet for å eksponere tinningbenet. Sørg for at dette snittet er lang nok til å jobbe komfortabelt med tilstrekkelig visualisering.
  2. Perforere tromme bulla med en 25 G nål og å utvide hullet som er nødvendig med pinsett ved å trekke benet tilbake for å tillate tilgang til den basale omdreining av sneglehuset, og deretter utvide seg i tilstrekkelig grad til å visualisere stapedial arterien, og det runde vindu membran (RWM) .
  3. Punktere RWM forsiktig i sentrum med en borosilikat kapillær pipette. Observere væske utstrømning gjennom RWM på dette punktet; dette er normalt. Vent til dyseutstrømningen har stabilisert seg (den effluxed fluid fra sneglehuset blir tørket med et sterilt filterpapir).
    MERK: Vær forsiktig når du holder og fremme glass nålen slik at RWM perforering er så liten som mulig. Avhengig av mikroskop, holder pipettene ved hjelp av en mikromanipulator eller for hånd ved hjelp av en pipetteholderen.
  4. Forberede pipetter for injeksjon ved hjelp av en pipette puller på samme måte patch clamp pipetter er forberedt. Sørge for at diameteren spissen er store (ca. 15 mikrometer i diameter), slik at pipettering viruset inn og ut er gjort lett.
  5. Utarbeide 1 til 2 mL av AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP eller AAV2-GFP i en injeksjons pipette. Etter at utstrømningen er stabilisert (5 til 10 min), microinject dette fast volum inn i scala tympani gjennom samme hull tidligere laget i RWM.
  6. Tett RW nisje raskt etter å trekke ut pipetten med en liten plugg av muskel og fest den med en liten dråpe vevlim plassert på muskelen for å unngå lekkasje fra det runde vinduet.
    MERK: Seal dette hullet veldig godt etter at nålen er fjernet med en liten plugg av muskel for å hindre enhver perilymph lekkasje fra cochlea-dette trinnet er avgjørende for å bevare hørselen. Unnlatelse av å forsegle helt RWM vil resultere i hørselstap over tid.
  7. Etter injeksjon, dekkehull i hørsels bulla med fettvev, returnere post-auricular muskler og fettvev til sin vanlige posisjon og sy såret i lag med en 6-0 eller mindre absorberbare krom sutur.
  8. Desinfiser såret med povidon-jod.

3. Postoperativ Care

  1. Plasser mus i et varmt bur og ikke la dem uten tilsyn før de er fullt restituert og deretter flytte dem tilbake med moren. Det anbefales å fjerne den mannlige fra buret før du setter valpene tilbake med moren.
  2. Administrere subkutan Carprofen (2 mg / kg) for smertelindring postoperativt og hver 24 timer etterpå i 3 dager, for å administrere betennelse og smerte. Overvåke dyrene daglig for tegn på stress, unormal vekttap, smerte eller infeksjon. Generelt med 3. dag etter operasjonen alle musene bør normalt opptrer. Ved tegn på stress eller sykdom vises i en mus etter 3. dag, bør du vurdere euthanizing than mus som per institusjonelle retningslinjer.

4. Vurdering av Cochlear Funksjon Etter Viral Levering Ved hjelp av Auditory hjernestammen respons (ABR) Recordings

MERK: auditive hjernestammen respons (ABR) er en auditiv fremkalt potensial hentet fra pågående elektrisk aktivitet i hjernen og registrert via elektroder plassert under hodebunnen. Dyret blir stimulert med lyd. Den resulterende opptaket består av fem bølger som reflekterer den elektriske aktiviteten i suksessive punkter i hørselsbanen i de første 10 msek etter inntreden av en auditiv stimulus.

  1. Anesthetize mus ved intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketaminhydroklorid og xylazin hydroklorid som beskrevet i kapittel 1.2 i denne protokollen, bortsett uten acepromazin.
  2. Plasser musen på en varmepute hele hørselstest før musen er helt våken, for å forebygge post anestesi hypotermi.
    MERK: Brukfølgende lyd stimuli i dette eksperimentet: klikk (5 ms varighet, 31 Hz presentasjon rate).
  3. Plassere subdermale nålelektroder på toppunktet, under pinna av venstre øre (referanse), og under den kontralaterale øret (jord) og starte opptak abrs som tidligere beskrevet i en lydisolert kammer 27,28. Rekord ABR bølgeformer i 5 dB lydtrykk nivå intervaller ned fra maksimal amplitude.
  4. Bestem ABR terskler postoperativt så tidlig som fire dager etter viral levering
    MERK: Terskel er definert som den laveste stimulus nivå hvor respons topper for bølger I-V var tydelig og gjentatte ganger til stede på visuell inspeksjon.
  5. Mål Wave jeg å analysere aktiviteten fra cochlea nerve. Det laveste nivået stimulus som gir en påvisbar ABR bølgeform er definert som terskelen.

5. Cochlear Transgene Protein Expression Bruke Immunfluorescens

  1. Anesthetize mus med en overdose av intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketaminhydroklorid og xylazin hydroklorid som beskrevet i kapittel 1.2 i denne protokollen, bortsett uten acepromazin.
  2. Halshogge hodet først etter at dyret ikke lenger reagerer på smertefulle stimuli, for eksempel tå klype.
  3. Dissekere cochleae ut og prosess for hel-mount immunfluorescens som beskrevet 26. En detaljert protokoll av cochlea hel-mount immunfluorescens hjelp av anti-VGLUT3 og anti-myosin 7a antistoffer er beskrevet i Akil et al., 2013 29.
  4. For GFP merking, inkuber cochlea hel-monteringer over natten ved 4 ° C med kanin-anti-GFP-antistoff ved 1: 250 fortynning.
  5. Skyll cochleae to ganger i 10 minutter med PBS og deretter inkubert i 2 timer i geite-anti-kanin-IgG konjugert til Cy2 fortynnet 1: 4000 i PBS.
  6. Skyll cochleae to ganger med PBS i 10 minutter og inkuber dem med DAPI i 15 min.
  7. Monter cochleae på objektglass og observere under et mikroskop med confocal immunfluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å kontrollere de tekniske funksjonene og nytten av post-aurikulær tilnærming for cochlea molekylær terapi, ble AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP og AAV2-GFP levert inn P10-12 mus indre øret via RWM. Denne tilnærmingen viser vellykket transgene uttrykk innenfor indre hårcellene (IHC) (VGLUT3 Figur 1 og GFP Figur 2 og GFP figur 3A), ytre hårcellene (OHC) (GFP figur 2) og støtteceller (GFP figur 2 og figur 3A) 26 uten betydelig organ Corti skade. Observasjonen av forskjellige celletyper som uttrykker GFP sett i cochlea hele montert immunfluorescens-bilder (Figur 2 og Figur 3a) viser at valget av AAV serotype må være kompatibel med de celletypene som skal transduserte. Figur 1, figur 2 og figur 3A 26 viser svært god transfection i begge IHCs og OHCs, så vel som fordeling av transgenet protein (GFP / VGLUT3) gjennom hele sneglehuset etter AAV1 eller AAV2-GFP eller AAV1-VGLUT3 transfeksjon. Fordelingen av IHCs uttrykker VGLUT3 etter AAV1-VGLUT3 transfeksjon (figur 3B) 26 antyder at transfeksjon via RWM er mer effektiv og ensartet gjennom hele cochlea enn andre metoder som har rapportert høyere transfeksjonsandeler nærmere stedet av viral levering. Vi har funnet at transfeksjonsandeler kan gjøres mer effektiv ved å øke volumet av virus injiseres inn i det indre øret (Figur 1) 26.

Vår observasjon av vellykket VGLUT3 uttrykk i VGLUT3 KO mus IHCs uten cochlea skade førte oss til å teste hørsel ved å måle abrs i de reddet KO mus. 4A og 4B 26 dokument evne post-aurikulær RWM levering av AAV1-VGLUT3 inn indre ear av VGLUT3 KO mus å produsere høre redning i denne musemodell for medfødt hørselstap. Auditive hjernestammen respons (ABR) spor ble restaurert i VGLUT3 reddet KO (Figur 4A), og de ​​ABR tersklene var målbare og sammenlignbare med de sett i villtype mus (Figur 4B).

Figur 1
Figur 1:. VGLUT3 IHC transfeksjon etter RWM viral levering til P10-P12 KO ​​mus Den transfektert cochleae ble undersøkt ved P30 ved immunfluorescens hjelp av anti-Myo7a antistoff, et hår-cellemarkør, og et antistoff mot VGLUT3. Myo7a og VGLUT3 ble uttrykt i alle IHCs bare i WT, mens IHCs fra KO mus uttrykkes bare Myo7a. Den reddet mus cochleae viste noen IHCs uttrykker VGLUT3, og alle IHCs uttrykt Myo7a (rad 3) IHC:. Indre hårcellene. Opptrykk med tillatelse fra26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Mouse cochlea-hel-mount immunfluorescens etter RWM AAV2-GFP levering til villtype P10-P12 mus AAV2-GFP ble brukt for å vurdere viral levering hjelp av post-aurikulær tilnærming til muse cochlea.. AAV2-GFP levering ble gjort på P10-12 og transgen GFP uttrykk ble undersøkt i sneglehuset på P21 hjelp av en anti-GFP antistoff. GFP uttrykk (grønn) i WT mus cochlea-hel-mount vise sterkere GFP uttrykk i ytre hårcellene (OHC) enn indre hårcellene (IHC).

Figur 3
Figur 3: Mouse coc hlear hel-mount immunfluorescens etter RWM AAV1-GFP levering til villtype P10-P12 mus. Etter AAV1-GFP levering til cochlea uttrykk for GFP er sett i indre hårcellene (IHC) og støtteceller (A), men ikke OHCs , mens AAV1-VGLUT3 levering til cochlea av VGLUT3 KO mus (B) resulterte i VGLUT3 uttrykk bare i IHCs. Antallet IHCs uttrykker VGLUT3 i VGLUT3 KO mus cochlea etter AAV1-VGLUT3 levering avhenger av mengden virus levert til det indre øret; for eksempel 40% av IHCs uttrykt VGLUT3 når 0,6 ul av viruset ble injisert, mens 100% av IHCs uttrykt VGLUT3 etter en ul av viruset ble levert. Det var ingen forskjell i VGLUT3 ekspresjon mellom toppen, midt-sving, eller base når 0,6 ul av viruset ble injisert. Opptrykk med tillatelse fra 26.

g "/>
. Figur 4: Auditory hjernestammen respons (ABR) vurdering Representative ABR bølgeformer etter AAV1-VGLUT3 levering var lik mellom reddet og villtype mus; I motsetning til dette ble ingen ABR bølgeformer sett i KO-mus (A). Reddet KO mus viste også målbare ABR terskler. Disse ABR terskler var sammenlignbare med de som ble sett i WT mus for alle frekvenser målt (B). I:. ABR bølge I. Opptrykk med tillatelse fra 26 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet, vi beskriver i detalj en teknikk som kan brukes for cochlea genterapi, med mål om å gjenopprette eller redde normal auditiv funksjon som er kompromittert av en genetisk defekt. Som det er typisk atraumatisk, er denne tilnærmingen trygg for cochlea genoverføring eller andre potensielle molekylære terapier 30. Andre tilnærminger for cochlea-terapi har blitt beskrevet, inkludert en ventral tilnærming 24, cochleostomy 31,32 og endolymfatiske sac levering 33 i mus og marsvin. I vår erfaring, er den post-aurikulær tilnærming raskere, enklere, og assosiert med redusert skader og dødelighet dyr. Videre etter aurikulær tilnærming gir bedre visualisering av RWM med mindre sjanse for traumer og tilhørende tap av hørsel 34,35,36. Denne rapporten dokumenterer de tekniske aspektene og nytte av den post-aurikulær tilnærming for cochlea molekylær terapi ved å demonstrere levering av AAV1-VGLUT3 til the indre øret via RWM, noe som resulterer i transgen ekspresjon av både VGLUT3 og GFP (figur 1 og figur 2, og figur 3A) og høre redning i denne musemodell av medfødt hørselstap. Tidligere studier som beskriver metoder for genet levering viste bare begrenset transgene uttrykk i kritiske områder av organ Corti 12,37,38,39,40,41. Disse forskjellene kan skyldes kvaliteten av det virale preparat, titeren av den virale vektor, serotype anvendes, eller bare utilstrekkelig viral levering inn i sneglehuset. I kontrast, ved hjelp av denne post-aurikulær tilnærming vi var i stand til å oppnå svært gode transfeksjonsandeler til både indre og ytre hårcellene og distribusjon av en reporter gen (GFP) etter AAV2-GFP transfeksjon (figur 2 og figur 3A) hele sneglehuset. Basert på prosentandelen av IHCs transfektert med AAV1-VGLUT3 (figur 3B), foreslår vi at transfeksjon via RWM er mer effektiv og uniform gjennom hele cochlea enn andre metoder, inkludert det som er beskrevet i marsvin, som rapporterte høyere transfeksjonsandeler i basal sving, nær stedet av viral programmet 42. Den langsiktige uttrykk for GFP / VGLUT3 i sneglehuset, i minst et og et halvt år, er i samsvar med data innhentet fra andre dyremodeller og ulike organsystemer 38,43.

I tillegg histologisk analyse av transfektert cochlea viste ingen tegn til en betennelsesreaksjon, med utmerket bevaring av cytoarchitecture av orgelet i Corti, inkludert stria vascularis og spiral ganglion nevroner 26. Videre, i motsetning til metoder som er ansatt en cochleostomy, den RWM transfeksjonen brukt i denne studien ikke forårsake cochlea skade, og høyere volumer kan injiseres 31,32. Mangel på traumer ved hjelp av denne teknikken ble bekreftet ved å vise tilsvarende ABR terskelenlds mellom operert og styrer ører, en finne som ligner på det man ser av Xia et al. 4 Til slutt, AAV-VGLUT3 levering gjennom RWM resulterte i ABR terskler kan sammenlignes med de som ble sett i WT mus (Figur 4A og 4B) 26. Vi har brukt denne teknikken i alle aldre av mus, men det er teknisk utfordrende i mus eldre enn P40 fordi bulla bein blir vanskeligere å perforere og brukket bein fra bulla er skarpere i eldre enn hos yngre mus. På eldre aldre, kan hvis forsiktighet ikke er tatt blødning oppstå hvis en del av bulla bein lacerates halsen vev.

I konklusjonen, dokumenterer denne rapporten vellykket genoverføring inn flere typer cochlea celler i mus ved hjelp av en AAV-basert vektor som tidligere ble vist. Denne teknikken av genet levering minimerer traume, ikke fører til hørselstap, og kan resultere i omfattende transfeksjon av en rekke celletyper i sneglehuset, incInkl hårcellene og spiral ganglion nevroner. Den har stort potensial søknad for andre typer av medfødte og ervervede former for hørselstap, og kan også brukes til en rekke molekylære behandlinger i musemodeller av hørselstap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  2. Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
  3. Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
  4. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
  5. Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
  6. Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
  7. Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
  8. Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
  9. Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
  10. Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
  11. Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
  12. Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  13. Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
  14. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  15. Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
  16. Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
  17. Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
  18. Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
  19. Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
  20. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  21. Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
  22. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
  23. Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
  24. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  25. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  26. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  27. Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
  28. Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
  29. Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
  30. Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  31. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  32. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  33. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  34. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  35. Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
  36. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  37. Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
  38. Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
  39. Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
  40. Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
  41. Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
  42. Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
  43. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).

Tags

Nevrovitenskap Genterapi Transfeksjon adenoassosiert virus (AAV) Mus cochlea Indre hårcellene (IHC) Vesicular glutamat Transporter 3 (VGLUT3).
Kirurgisk metode for viralt genavlevering til Mouse Inner Ear gjennom det runde vinduet Membrane
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., … More

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter