Abstract
Genterapi, som används för att uppnå funktionell återhämtning från sensorineural dövhet, lovar lämna bättre förståelse av de bakomliggande molekylära och genetiska mekanismer som bidrar till hörselnedsättning. Införande av vektorer in i innerörat måste göras på ett sätt som har brett distribuerar medlet i snäckan och samtidigt minimera skador på de befintliga strukturerna. Detta manuskript beskriver en post-aurikulär kirurgisk metod som kan användas för mus cochlea terapi med användning av molekylära, farmakologisk och viral leverans till möss postnatal dag 10 och äldre via runda fönstermembranet (RWM). Denna kirurgisk metod möjliggör snabb och direkt leverans till scala tympani samtidigt minimera blodförlust och undvika djurdödligheten. Denna teknik innebär försumbar eller ingen skada på viktiga strukturer i inner och mellanörat samt nackmusklerna samtidigt helt bevara hörseln. För att demonstrera effekten av detta kirurgisk teknik, den vesikulära glutamåt transportör 3 knockout (VGLUT3 KO) möss kommer att användas som ett exempel på en musmodell av kongenital dövhet som återvinner höra efter leverans av VGLUT3 till innerörat med hjälp av en adeno-associerat virus (AAV-1).
Introduction
Genterapi har länge föreslagits som en potentiell behandling för genetisk hörselnedsättning, men framgång inom detta område har varit svårfångade 1. Hittills har viralt medierade metoder dominerade grund den teoretiska möjligheten att rikta specifika celltyper inom den relativt otillgängliga snäckan. Båda adenovirus (AV) och adeno-associerat virus (AAV) har använts för cochlea gentillförsel. AAV är fördelaktiga i snäckan för ett antal skäl. De är replikeringsfattiga virus och kan effektivt överföra transgena molekyler till olika celltyper inklusive nervceller, ett viktigt mål för ett antal orsaker till hörselnedsättning. AAV inträde i cellen förmedlas av specifika receptorer 2; Följaktligen får valet av en viss serotyp vara förenlig med de celltyper som ska transduceras. AAV kan effektivt transfektera hårceller 3 och införliva i värdgenomet, vilket resulterar i en stabil, långsiktig expression av den transgenic protein och fenotypisk förändring i cellen 4. Även om inte nödvändigtvis fördelaktiga för kortsiktiga applikationer såsom hår-cellsregenere, är mycket viktigt för stabil räddning av genetiska defekter långsiktig expression. Eftersom AAV inte förknippas med någon mänsklig sjukdom eller infektion och demonstrera ingen ototoxicitet 5,6,7, de är en idealisk kandidat för användning i genterapi för ärftliga former av hörselnedsättning 8.
Överföring av genetiskt material i däggdjursinnerörat med hjälp virala vektorer har studerats under det senaste årtiondet och framstår som en lovande teknik för behandling både genetiska och förvärvade former av hörselnedsättning 9. Snäckan är potentiellt ett idealiskt mål för genterapi av flera skäl: 1) dess liten volym nödvändiggör en begränsad mängd av viruset som behövs; 2) dess relativa isolering från andra organsystem gränser biverkningar; och 3) dess vätskefyllda kamrar underlättar virusleverans i hela labyrinten 10, 11,12,13,14, 15.
Musmodeller av kongenital dövhet möjliggör en användning av många metoder för undersökning för att övervaka utvecklingen av innerörat på ett systematiskt, replikerbar sätt. Medan den lilla storleken hos mus hörselsnäckor medför några kirurgisk svårighet, tjänar musen som en extremt viktig modell i studien av genetisk hörselnedsättning, med flera experimentella fördelar jämfört med andra arter 16. Musmodeller tillåter bedömning av en rad egenskaper genom genetisk kopplingsanalys, samling av detaljerade morfologiska observationer, och simulerar patogena scenarier; som sådana, de är goda kandidater för viralt medierad genterapi. Omfattande genetiska studier på möss i kombination med tekniska framsteg har gjort det möjligt att generera genetiskt modifierade möss på ett reproducerbart sätt över laboratorier 17,18, 19, 20,21. Furthermore, finns det många modeller för både förvärvade och nedärvda hörselförlust fenotyper hos möss, vilket gör rigorösa tester i denna djurmodell 22, 23,24. Således korrigera hörsel använder viralt medierad genterapi i en musmodell är ett lämpligt första steg i sökandet efter ett botemedel för mänskliga sjukdomar.
Vi har tidigare visat att transgena möss som saknar vesikulär glutamat transportör 3 (VGLUT3) föds döva på grund av brist på glutamatfrisättning vid IHC band synapsen 25. Eftersom denna mutation inte leder till en primär degeneration av sensoriska hörselceller, dessa muterade möss är potentiellt en utmärkt modell, i vilken för att testa cochlea genterapi för medfödd hörselnedsättning.
Hittills har ett antal virala leveranstekniker för cochlea genterapi har beskrivits, inklusive runda fönstermembranet diffusion, runda fönstermembranet injektion, och tillförsel via en cochleostomy. Det finns potentaial fördelar och nackdelar med vart och ett av dessa tillvägagångssätt 9.
Här rapporterar vi en kirurgisk metod för viralt medierad gentillförsel till VGLUT3 KO mouse innerörat genom det runda fönstermembranet (RWM). Den post aurikulär RWM injektion metod är minimalt invasiv med utmärkt hörsel konservering, och är relativt snabb. Som vi tidigare har publicerats, i ett försök att återställa hörseln i denna musmodell, var en AAV1 vektor bär VGLUT3 genen (AAV1-VGLUT3) införs i snäckan av dessa döva möss vid postnatal dag 12 (P! @), Vilket resulterar i restaurering av hörsel 26. Utfrågning i VGLUT3 KO möss verifierades med hörselhjärnstammen svar (ABR), medan transgen proteinuttryck verifierades med hjälp immunofluorescens (IF). Denna metodik visar således att viralt medierad genterapi kan korrigera en genetisk defekt som annars skulle resulterar i dövhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla förfaranden och djurhantering följs NIH etiska riktlinjer och godkända protokollkraven i Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of California, San Francisco.
1. Förbereda Animal för kirurgi
- Utför kirurgiska ingrepp i en ren, dedikerad utrymme. Autoklavera alla kirurgiska instrument, sterilisera med ett glas-pärla autoklav före operation.
OBS: I detta protokoll använder postnatal dag 10-12 (P10-12) FVB möss. Olika åldrar och stammar av möss kan användas för att möta behoven hos ett specifikt projekt. Möss äldre än P40 kan vara utmanande eftersom bulla benet blir svårare. - Bedöva möss med intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin-hydroklorid (100 mg / kg), xylazin-hydroklorid (10 mg / kg), och acepromazin (2 mg / kg). Börja kirurgiska förberedelser först efter att djuret inte längre svarar på smärtsamma stimuli, såsom tå nypa. Om NECESSÄRy, ge en boosterdos (en femtedel den ursprungliga dosen) av narkos cocktail att återställa den ursprungliga narkos planet.
OBS: Var försiktig vid detta steg eftersom de flesta av dödlighet observerad vid denna ålder orsakas av bedövningsmedel överdos. - Täck djurets ögon med en skyddande oftalmologiska salva för att hålla ögonen fuktiga under narkos, trycka djurets blinkreflex.
- Placera musen med halsen förlängas på en värmedyna under hela proceduren tills musen är helt vaken, för att förhindra post anestesi hypotermi.
- Raka vänstra post aurikulär region med en klippare och desinficera med 70% etanol och povidonjod före kirurgisk manipulation.
2. Den kirurgiska ingrepp och Vector Injection
- Använd en post-auricular strategi att exponera trum bulla. Incise subkutana vävnaden med en liten sax för att exponera den post auricular muskler. Efter att dra tillbaka fettvävnad till the bakre sidan av snittet, separera musklerna till höger och vänster sida vinkelrät mot snittet för att exponera den tinningbenet. Se till att detta snitt är tillräckligt lång för att arbeta bekvämt med adekvat visualisering.
- Perforera trum bulla med en 25 G nål och expandera hålet som behövs med pincett genom avskalning benet tillbaka för att medge åtkomst till den basala sekelskiftet koklea, och sedan vidgas tillräckligt mycket för att visualisera stapedial artären och det runda fönstermembranet (RWM) .
- Punktera RWM försiktigt i mitten med en borosilikatglas kapillär pipett. Observera vätske utflöde genom RWM på denna punkt; detta är normalt. Vänta tills utflödet stabiliserats (den effluxed fluiden från snäckan torkas med ett sterilt filterpapper).
OBS: Var försiktig när du håller och föra fram glasålen så att RWM perforering är så liten som möjligt. Beroende på mikroskopet används, hålla pipetterna med användning av en mikromanipulator eller för hand med användning av en pipettinnehavare. - Förbered pipetterna för injektion med en pipett avdragare samma sätt patch clamp pipetter är beredda. Se till att spetsen diametern är stor (ca 15 pm i diameter), så att pipettera viruset in och ut görs enkelt.
- Rita upp 1 till 2 pl AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP eller AAV2-GFP till en injektion pipett. Efter utflödet stabiliseras (5 till 10 min), mikroinjicera detta åtgärdas volym i scala tympani genom samma hål som tidigare gjorts i RWM.
- Täta RW nisch snabbt efter att dra ut pipetten med en liten plugg av muskler och fäst med en liten droppe vävnadsadhesiv placeras på muskeln för att undvika läckage från det runda fönstret.
OBS: Täta detta hål mycket väl efter nålen avlägsnas med en liten plugg av muskler för att förhindra perilymfa läckage från snäckan-detta steg är avgörande för att bevara hörseln. Underlåtenhet att täta helt RWM kommer att resultera i hörselskador över tiden. - Efter injektionen, täckerhål i hörsel bulla med fettvävnad, returnera de post auricular muskler och fettvävnad till sin normala position och sutur såret i skikt med en 6-0 eller mindre absorberbar krom sutur.
- Desinficera såret med povidon-jod.
3. Postoperativ vård
- Placera möss i en varm bur och inte lämna dem utan uppsikt tills de är helt åter sedan flytta tillbaka dem med modern. Det rekommenderas att ta bort den manliga från buren innan valparna tillbaka med mamman.
- Administrera subkutan Karprofen (2 mg / kg) för smärtlindring postoperativt och varje 24 tim därefter i 3 dagar, för att hantera inflammation och smärta. Övervaka djuren dagligen för tecken på obehag, onormal viktminskning, smärta eller infektion. Generellt vid den 3: e dagen efter operationen alla möss bör agerar normalt. Om några tecken på ångest eller sjukdom visas i en mus efter den 3: e dagen, överväga euthanizing tHan mus enligt institutionens riktlinjer.
4. Bedömning av Cochlear Funktion Efter Viral Leverans Använda Auditory Brainstem Response (ABR) Inspelningar
OBS: Hörselhjärnstammen svar (ABR) är en auditiv evoked potential utvinns ur pågående elektrisk aktivitet i hjärnan och registreras via elektroder placerade under hårbotten. Djuret stimuleras med ljud. Den resulterande inspelningen består av fem vågor som ger den elektriska aktiviteten i successiva punkter i hörselvägen i de första 10 ms efter början av en auditiv stimulus.
- Söva möss genom intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin hydroklorid och xylazinhydroklorid som beskrivs i avsnitt 1.2 i detta protokoll, utom utan acepromazin.
- Placera musen på en värmedyna under hörseltestet tills musen är helt vaken, för att förhindra post anestesi hypotermi.
OBS: Användföljande ljudstimuli i detta experiment: klicka (5 ms varaktighet, 31 Hz presentationshastigheten). - Placera subdermala nålelektroder vid vertex, nedanför pinna på vänster öra (referens), och under den kontra örat (jord) och börja spela in ABRS som tidigare beskrivits i en ljudisolerad kammare 27,28. Rekord ABR vågformer i 5 dB ljudtrycksnivå intervaller ner från maximal amplitud.
- Bestäm ABR trösklar postoperativt så tidigt som 4 dagar efter viral leverans
OBS: Tröskel definieras som den lägsta stimulans nivå där svars toppar för vågor I-V var klart och upprepade gånger före vid en okulärbesiktning. - Mät Wave Jag analysera aktiviteten från cochlea nerv. Den lägsta stimulus nivå som ger en detekterbar ABR vågform definieras som tröskelvärdet.
5. Cochlear Transgene Protein Expression Använda Immunfluorescens
- Bedöva möss genom en överdos av intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin hydroklorid och xylazinhydroklorid som beskrivs i avsnitt 1.2 i detta protokoll, utom utan acepromazin.
- Halshugga huvudet först efter att djuret inte längre svarar på smärtsamma stimuli, såsom tå nypa.
- Dissekera hörselsnäckor ut och process för hel-mount immunofluorescens som beskrivs 26. En detaljerat protokoll av cochlea hel-mount immunofluorescens med användning av anti-VGLUT3 och anti-myosin 7a antikroppar beskrivs i Akil et al., 2013 29.
- För GFP märkning, inkubera cochlea hela-fästen natten vid 4 ° C med en kanin anti-GFP-antikropp vid 1: 250 utspädning.
- Skölj hörselsnäckor två gånger under 10 min med PBS och därefter inkubera under 2 timmar i get-anti-kanin-IgG konjugerat till Cy2 utspädd 1: 4000 i PBS.
- Skölj hörselsnäckor med PBS två gånger under 10 minuter och inkubera dem med DAPI för 15 min.
- Montera hörselsnäckor på objektglas och observera under ett mikroskop med konfokal immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att verifiera de tekniska egenskaperna och nyttan av efter auricular strategi för cochlea molekylär terapi, var AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP och AAV2-GFP levereras i P10-12 möss innerörat via RWM. Detta tillvägagångssätt visar framgångsrik transgenexpression inom inre hårcellerna (IHC) (VGLUT3 Figur 1 och GFP Figur 2 och GFP figur 3A), yttre hårcellerna (OHC) (GFP Figur 2) och stödjande celler (GFP Figur 2 och figur 3A) 26 utan signifikant Cortis organ skada. Observationen av olika celltyper som uttrycker GFP ses i cochlea hela-mount immunofluorescens bilder (Figur 2 och Figur 3A) visar att valet av AAV serotyp måste vara förenliga med de celltyper som ska omvandlade. Figur 1, Figur 2 och Figur 3A 26 visar mycket bra transfection både IHCS och OHCs, samt distribution av transgen protein (GFP / VGLUT3) hela snäckan efter AAV1 eller AAV2-GFP eller AAV1-VGLUT3 transfektion. Fördelningen av IHCS uttrycker VGLUT3 efter AAV1-VGLUT3 transfektion (Figur 3B) 26 antyder att transfektion via RWM är mer effektiv och enhetlig genom hela snäckan än andra metoder som har rapporterat högre transfektion hastigheter närmare platsen för viral leverans. Vi har funnit att transfektion hastigheter kan göras mer effektiva genom att öka volymen av viruset injiceras i innerörat (figur 1) 26.
Vår observation av framgångsrika VGLUT3 uttryck i VGLUT3 KO mus IHCS utan cochlea skador ledde oss att testa hörsel genom att mäta ABRS i de räddade KO möss. Figur 4A och Figur 4B 26 dokument förmåga postöron RWM leverans av AAV1-VGLUT3 i inre ear av VGLUT3 KO möss att producera hörsel räddning i denna musmodell av medfödd hörselnedsättning. Auditiv hjärnstammen svar (ABR) spår återställdes i VGLUT3 räddade KO (Figur 4A), och trösklarna ABR var mätbara och jämförbara med dem som ses i vildtyp möss (Figur 4B).
Figur 1:. VGLUT3 IHC transfektion efter RWM viral leverans till P10-P12 KO möss Den transfekterade hörselsnäckor undersöktes vid P30 genom immunofluorescens med hjälp av anti-Myo7a antikropp, ett hår-cellsmarkör, och en antikropp mot VGLUT3. Myo7a och VGLUT3 uttrycktes i alla IHCS endast i WT, medan IHCS från KO möss uttryckte bara Myo7a. Den räddade musen hörselsnäckor visade vissa IHCS uttrycker VGLUT3 och alla IHCS uttryckte Myo7a (rad 3) IHC:. Inre hårcellerna. Reprint med tillstånd från26. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mus cochlea hel-mount immunofluorescens efter RWM AAV2-GFP leverans till vildtyp P10-P12 möss AAV2-GFP användes för att bedöma viral leverans med hjälp av post-öron förhållningssätt till musen snäckan.. AAV2-GFP leverans gjordes vid P10-12 och transgen GFP uttryck undersöktes i snäckan på P21 med hjälp av en anti-GFP antikropp. GFP uttryck (grön) i WT möss cochlea hel-mount visa starkare GFP uttryck i yttre hårceller (OHC) än inre hårcellerna (IHC).
Figur 3: Mus coc hlear hel-mount immunofluorescens efter RWM AAV1-GFP leverans till vildtyp P10-P12 möss. Efter AAV1-GFP leverans till snäckan uttryck av GFP ses i inre hårcellerna (IHC) och stödjande celler (A), men inte OHCs , medan AAV1-VGLUT3 leverans till snäckan av VGLUT3 KO-möss (B) resulterade i VGLUT3 uttryck endast i IHCS. Antalet IHCS uttrycker VGLUT3 i VGLUT3 KO möss koklea efter AAV1-VGLUT3 leverans beror av mängden virus som levereras till innerörat; exempelvis 40% av IHCS uttryckt VGLUT3 när 0,6 | il av viruset injicerades, medan 100% av IHCS uttryckt VGLUT3 efter 1 il av viruset levererades. Det fanns ingen skillnad i VGLUT3 uttryck mellan spetsen, mid-sväng, eller bas när 0.6 pl virus injicerades. Reprint med tillstånd från 26.
g "/>
. Figur 4: Auditory hjärnstammen svar (ABR) bedömning Representativa ABR vågformer efter AAV1-VGLUT3 leverans liknade mellan räddade och vildtypsmöss; däremot har inga ABR vågformer ses i KO möss (A). Räddade KO möss visade också mätbara trösklar ABR. Dessa ABR trösklar var jämförbara med de som ses i WT möss för alla frekvenser uppmätta (B). I:. ABR wave I. Reprint med tillstånd från 26 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete har vi i detalj beskriva en teknik som kan användas för cochlea genterapi, med målet att återställa eller rädda normal hörselfunktion som äventyras av en genetisk defekt. Eftersom det är typiskt atraumatisk, är detta tillvägagångssätt säkert för överföring cochlea gen eller andra potentiella molekylära terapier 30. Andra metoder för cochlea terapi har beskrivits, bland annat en ventral tillvägagångssätt 24, cochleostomy 31,32 och endolymphatic sac leverans 33 i mus och marsvin. Enligt vår erfarenhet är det postöron tillvägagångssätt snabbare, enklare och förknippas med minskad skada och djur dödlighet. Vidare erbjuder den post auricular tillvägagångssätt förbättrad visualisering av RWM med mindre risk för trauma och tillhörande förlust av hörsel 34,35,36. Denna rapport dokumenterar de tekniska aspekterna och användbarhet av post-öron strategi för cochlea molekylär terapi genom att visa leverans av AAV1-VGLUT3 i the innerörat via RWM, vilket resulterar i transgen expression av både VGLUT3 och GFP (figur 1 och figur 2 och figur 3A) och hörsel räddning i denna musmodell av medfödd hörselnedsättning. Tidigare studier som beskriver metoder för genleverans visade endast begränsade transgen uttryck i kritiska områden av organ Corti 12,37,38,39,40,41. Dessa skillnader kan bero på kvaliteten av den virala beredningen, titern av den virala vektorn, serotyp används, eller helt enkelt otillräcklig viralt leverans i snäckan. Däremot använder denna efter auricular synsätt kunde vi få mycket bra transfektion priser till både inre och yttre hårceller och distribution av en reporter gen (GFP) efter AAV2-GFP transfektion (Figur 2 och Figur 3A) hela snäckan. Baserat på andelen IHCS transfererats med AAV1-VGLUT3 (Figur 3B), föreslår vi att transfektion via RWM är mer effektiva och enhetlig genom hela snäckan än andra metoder, inklusive den som beskrivs i marsvin, som rapporterade högre transfektion talen i basala tur, nära platsen för viral ansökan 42. Den långsiktiga uttryck av GFP / VGLUT3 inom hörselsnäckan, i minst ett och ett halvt år, är förenlig med uppgifter från andra djurmodeller och olika organsystem 38,43.
Dessutom histologisk analys av transfekterade snäckan visade inga tecken på en inflammatorisk reaktion, med utmärkt bevarande av cytoarchitecture av Cortis organ, inklusive stria vascularis och spiral ganglieneuroner 26. Vidare, i motsats till metoder som används en cochleostomy, den RWM transfektion används i föreliggande studie orsakade inte cochlea skador, och högre volymer kan injiceras 31,32. Brist på trauma med denna teknik verifierades genom att visa motsvarande ABR thresholds mellan drivs och kontrollera öron, en hitta liknande den som ses av Xia et al. 4 Slutligen resulte AAV-VGLUT3 leverans via RWM i ABR trösklar jämförbara med de som ses i WT möss (Figur 4A och Figur 4B) 26. Vi har använt denna teknik i alla åldrar av möss, men det är tekniskt utmanande i möss äldre än P40 eftersom bulla benet blir svårare att perforera och brutna ben från bulla är skarpare i äldre än hos yngre möss. I högre åldrar, kan om försiktighet inte tas blödning inträffa om en bit av bulla ben river hals vävnader.
Sammanfattningsvis dokumenterar denna rapport framgångsrika genöverföring i flera typer av cochlea celler i musen med hjälp av en AAV-baserad vektor som tidigare visats. Denna teknik för genavgivning minimerar trauma, inte leder till hörselnedsättning, och kan leda till utbredd transfektion av olika celltyper inom snäckan, including hårceller och spiral ganglieneuroner. Den har stor potentiell tillämpning för andra typer av medfödda och förvärvade former av hörselnedsättning, och kan även tillämpas på en mängd olika molekylära terapier i musmodeller av hörselnedsättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
- Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
- Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
- Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
- Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
- Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
- Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
- Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
- Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
- Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
- Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
- Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
- Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
- Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
- Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
- Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
- Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
- Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
- Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
- Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
- Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
- Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).
