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Biology

检测和DNA损伤分析小鼠骨骼肌 Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

双和单链DNA断裂12,23末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）缺口末端标记（TUNEL）是利用末端转移酶酶连接的dUTP 3的进程的结束。 TUNEL法检测细胞凋亡和DNA损伤的由Gavrieli 等人 1,12,24首次报道在20年前。它已经被评估，并在不同的组织筹备7,23,27,40优化。 TUNEL法已被用于研究局部缺血诱导的细胞死亡的神经元6,14,29和心肌43,44的，兴奋毒性神经元细胞死亡30,31，并作为在关节炎治疗39的生物标记物。它也被用作在各种人类癌症2,3,15,32,37,38,42的预后因子和肿瘤细胞标记物。

DNA损伤和细胞死亡检测的替代方法存在，但他们有技术挑战和警告。 Southern印迹可用于quantifýDNA损伤在整个组织裂解7,9-11，但这种方法不提供蜂窝级别分辨率和难以量化。彗星试验是需要从细胞中提取4,20,28,36保存细胞核的替代的基于细胞的方法。虽然彗星试验工作良好对培养分离的细胞，它是更难以从骨骼肌组织8,21准备完整的细胞核。如同Southern印迹，彗星试验不提供从全肌肉组织匀浆细胞类型特定的信息。另一个替代TUNEL法是使用抗单链DNA 25,33,41或针对参与DNA损伤应答和细胞死亡途径（ 如 p53基因，H2AX，和半胱氨酸蛋白酶）13,17,22,40蛋白免疫组织化学。这样的基于抗体的方法需要的抗体的透彻表征和优异的抗体特异性，以产生一个高的信号 - 背景比。即使在规格IFIC抗体存在，它们可能需要通过抗原修复程序34,35变性靶蛋白。正如我们在这里讨论，抗原修复肌肉组织会导致不可接受的高自发荧光。不像其他方法，TUNEL实现DNA损伤检测具有高信号和低背景，特异性好，可以用简单的阳性和阴性对照，良好的组织穿透，不需要抗原修复和细胞级的分辨率进行测试。此外，TUNEL法需要大约4小时，以完成的，而另一种方法通常需要过夜孵育。

我们研究骨骼肌细胞死亡的脊髓性肌萎缩症（SMA）10是由谢，李和他的同事16产生的小鼠模型。为了量化凋亡细胞中的肌，我们开发了组织制备，染色和定量的方法，其工作原理鲁棒跨不同skeleTAL肌肉群在小鼠不同发育时间点。我们用市售的TUNEL标记试剂盒和市售的图像分析软件。我们也成功地使用了TUNEL测定结合免疫荧光染色在脊髓10。

此处所描述的方法是谁想要以评估骨骼肌组织病理学，疾病的机制，老化机制，和发育（前和产后）细胞死亡的调查是有用的。的TUNEL技术是DNA损伤和修复和细胞死亡在模型系统中，其中的细胞的一个子集是受影响和细胞水平分辨率是必要的研究特别有用。

这部影片描述了解剖，组织处理，切片，与小鼠骨骼肌基于荧光的TUNEL标记。它还描述了半自动化的TUNEL信号定量的方法。

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Protocol

注：在本协议中描述的所有动物的程序进行按照指南中的生26全国学院的实验室动物的护理和使用的建议。协议（MO13M391）是经美国约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会。

1.新生小鼠牺牲，解剖和固定

  1. 牺牲一个新生小鼠通过CO 2吸入。
  2. 立即切断膝盖以上的后肢。直到大约出生后第7天，腿部骨头都软得足以切断通过与大型实验室剪刀或锋利的刀片，并随后节低温恒温器。
  3. 放置在磷酸盐缓冲盐水（PBS）在10毫升冰冷的4％多聚甲醛的后肢在一个15毫升管。
  4. 浸泡修复多聚甲醛的后肢为4-24小时，在4℃。胚胎组织只需要几个小时固定用S的。
    1. 避免固定时间超过24小时，因为这可能会降低TUNE​​L法效率。
  5. 通过浸渍在蔗糖溶液Cryoprotect后肢。
    1. 在相同的15ml试管改变多聚甲醛在PBS中的10％蔗糖，孵育过夜，在4℃。
    2. 变化到在PBS中30％蔗糖，孵育过夜，在4℃或直到后肢汇到管的底部。组织可能会留在30％蔗糖的时间较长，但前提是蔗糖已无菌过滤。

2.组织包埋

  1. 填写标记嵌入模具中途与包埋剂。
  2. 放置后肢上的包埋介质的顶部上，与切侧尽可能靠近到一个壁的模具。标记在模具的外侧后肢的方向。
    1. 嵌入多个后肢切在同一个块。但是，必须确保所有欣是非常重要的在块dlimbs被定向为平行于彼此，以获得部分在沿着肢体的轴相匹配的水平。
  3. 覆盖后肢与包埋剂。如果后肢转移而浇筑中，重新定位他们钝尖镊子或牙签。
  4. 允许嵌入介质渗透到组织，在室温下至少15分钟。
  5. 地方模具直接在干冰或异戊烷干冰冷冻包埋剂。一定要保持模具的水平在任何时候，避免包埋组织移位。
  6. 保持冷冻的模具在-80℃，直到准备切割，长达数月。

3. Cryosectioning嵌入式四肢

  1. 设置低温恒温室温度至-20℃，对象温度至-18℃;调整目标温度需要下降。
  2. 平衡的低温恒温室内部的组织块至少30分钟。正确的块温度erature是部分质量是至关重要的。
  3. 切横截面的厚度为10微米或更小。较厚的部分不会被TUNEL试剂充分渗透。使用防卷板，叶片和叶片角度（一般为5°）推荐用于低温恒温器。
  4. 收集的部分上明胶或vectabond涂覆载玻片在室温下。立即放入干冰幻灯片框。请用干冰放置在靠近低温恒温器近在咫尺单独的容器幻灯片框。
    1. 通过肢体的长轴切割横向连续切片，跳过100-200微米。收集至少3个相邻段在每一个串行水平。

4. TUNEL法对后肢部分使用市售的试剂盒（所有步骤在室温下，除非另有说明）

  1. 解冻幻灯片使用节至室温并干燥过夜或过周末。
  2. 补充水分通过immersin节克载玻片在PBS中用于在科普林缸2×10分钟。用干擦实验室，周围的部分尽可能删除尽可能多的液体。
  3. 通透节
    1. 使用一个非蛋白水解，皂甙类的商业试剂或0.5％吐温20和0.05％的Triton X100的PBS。
    2. 将滑动到一个湿室中。一个简单的湿度室是一个具有紧盖子空枪头盒，具有加入刚好足够的水来覆盖盒子的底部。
    3. 吸管足够试剂到滑动覆盖部分（50微升足以用于新生小鼠肢体）。不直接吸取到的部分中，作为重复的搅拌可导致部抬离滑动。
    4. 使用钝头镊子，放置封口膜的小矩形上的部分，以摊开试剂的滴的顶部，并完全覆盖部分。如果有气泡的封口膜下形成，轻轻抬离，干燥，重新申请。
    5. 孵育的幻灯片与permeabili矩阵特殊积试剂1小时在有盖的湿度室中。如果部分开始从滑动升空，通透时间可减少到30分钟。
    6. 在一个科普林缸2×5分钟在PBS洗幻灯片。封口膜矩形应该浮到顶部并随后可以取出并丢弃。
    7. 使用实验室擦拭，干周围的部分尽可能多的液体。
  4. 末端转移酶介导的DNA断裂标记
    1. 按照试剂盒说明书进行1X末端转移酶标记缓冲液，吸管足够的标记缓冲到幻灯片，以支付组织切片（50微升足以新生小鼠四肢）。孵育在湿度室中5分钟。另外，沉浸在幻灯片中末端转移酶标记缓冲液中科普林罐子。
    2. 按照试剂盒说明书进行末端转移酶标记组合。该套件包括钴，镁和锰的阳离子;锰阳离子行之有效上的各种组织，包括骨骼肌，神经系统TISS的UE，肝脏，皮肤，和骨。
    3. 对于阳性对照，DNA酶（试剂盒中标记为“核酸酶”）添加到转移酶标记组合。可替代地，在37℃下预治疗在核酸酶缓冲液用DNase阳性对照部分1小时，按试剂盒的说明。保持DNA酶溶液和DNA酶处理的部分远离其他的实验部分，以防止交叉污染。
    4. 对于阴性对照，省略标签组合转移酶的酶。
    5. 使用实验室擦拭从幻灯片尽可能消除尽可能多的末端转移酶标记缓冲液。吸管末端转移酶标签组合到滑动（每节50微升），盖用封口膜的一个新的矩形，并孵育在湿度室中在37℃下1小时。
    6. 按照试剂盒说明书进行1个挡车器。使用实验室擦拭以从滑动除去末端转移酶标记组合，并加入200-300微升终止缓冲液，以覆盖组织切片，并孵育在湿度室中5分钟。阿尔替换地，沉浸在幻灯片中挡车器在科普林罐子。
    7. 在PBS洗幻灯片2×2分钟。使用实验室擦拭从幻灯片尽可能消除尽可能多的PBS。
  5. 荧光标记
    1. 按照试剂盒说明书准备荧光标签解决方案的DNA断裂标记的dNTP。吸管溶液到滑动（每节50微升），盖用封口膜的一个新的矩形，并孵育在湿度室中20分钟。
    2. 洗幻灯片在PBS 2分钟的科普林罐子。使用实验室擦拭以从滑动除去尽可能多的PBS尽可能。
    3. 稀释的Hoechst 33258核染色在PBS中的1微克/毫升和吸管到滑动（100-200微升足以覆盖部分）。孵育在湿度室中5分钟。
    4. 洗3次5分钟，于PBS中。
    5. 盖玻片与抗淬灭荧光安装媒体和密封用指甲油的边缘。
jove_title“> 5。数字图像采集

  1. 获得使用常规荧光显微镜用DAPI，FITC和德克萨斯红滤波器（或等同物）的图像。使用较高的放大倍数的物镜（20X或40X），以验证该标记是成功的核（完整的或片段化）进行标记。 10倍的目标是足够的TUNEL阳性泪点定量。
  2. 收集的Hoechst染色，TUNEL染色和自发荧光信号的图像作为三个独立的假色通道组合在一个图像。如果TUNEL荧光标签是绿色的红色滤光器，图像自身荧光信号，并且反之亦然钳住。
    1. 保留所有成像设置幻灯片后续阈值和定量之间的等价物。对于每一个过滤器，预先设定和记录的曝光时间，增益和分档（没有分级是最好的）;不使用自动曝光或增益设置。
    2. 使用试错发现曝光和增益的设置，将最好的捕获INTEN的范围sities所有染色切片。确保没有饱和的像素获得的图像，因为这会偏向定量。
  3. 取的感兴趣的整个肌肉群的图像。这可能需要多个图像被“缝合”在一起。

6.图像分析

  1. 使用市售的图像分析程序来分析TUNEL染色数字图像。分析使用商业软件在此显示。可替代地，从美国国立卫生研究院的自由软件ImageJ的可用于分析TUNEL染色。
  2. 毗邻染色与HE染色（H＆E）的TUNEL染色部分一个部分，并采取全断面数字图像与传统的明显微镜。结合使用该H＆E影像与解剖图谱5,18,19跟踪解剖结构进行量化。
  3. 用TUNEL通道关闭时，手动跟踪的区域的轮廓进行量化，使用赫斯特和自体荧光渠道指导。所跟踪的区域转换成掩模（一组选定的象素的座标被分析）。
  4. 打开TUNEL通道。使用的强度，在图像分析程序阈值函数，设置下限阈值，排除所有自发荧光信号。
  5. 应用相同的阈值设置在书房集中的所有图像。阈值转换成选择口罩。
  6. 对于每一个图像，结合肌区掩模和TUNEL掩模。新的组合将面膜仅代表追查肌肉区域内TUNEL信号。
  7. 对合并面膜面膜进行定量分析，确定物体的数量和对象跟踪的肌肉区域内的TUNEL信号的区域。使用ImageJ的粒子分析仪功能，执行此。

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Representative Results

有了成功的染色，TUNEL阳性信号应该是足够明亮的自体荧光通过设定强度阈值隔离开来。在低放大倍数TUNEL阳性对象中可能出现的骨骼肌（ 图1A），为亮不规则碎片。然而，在较高的放大倍率，与经典的细胞凋亡形态一些TUNEL阳性对象应观察，如果所涉及的细胞死亡的类型是细胞凋亡（ 图1B）。阳性对照（DNA酶加）应该具有丰富TUNEL阳性信号，均匀地分布在所有的组织中的部分（ 图1C）。阴性对照酶（TdT酶从反应中省略）应产生低强度的背景和自身荧光信号仅（ 图1D）。皮肤提供了一个内部阳性对照在全腿部分，因为这组织具有正常的细胞凋亡（ 图1A）的比率很高。

红血细胞，骨细胞和内皮细胞可能有助于显著自身荧光信号（ 图2）。这是明智的图像中没有荧光标记，以确保自身荧光单独通道的每个部分不误正TUNEL信号。真TUNEL阳性信号应具有高得多的强度比自身荧光，以便它可以通过设置图像强度阈值（ 图2A，中间行）来分离。可替换地，自体荧光通道可以数字从TUNEL通道减去，得到TUNEL阳性信号（ 图2A，底行）。

这里所描述的TUNEL标记方法已用于量化骨骼肌细胞死亡中的SMA 10的小鼠模型。 TUNEL标记示出的增加的凋亡型材在腿部肌肉的5日龄的SMA的小鼠的数量，与同窝对照（ 图3A）相比。在细胞凋亡的增加是上述量化的由所描述的方法，表示在多个肌群（ 图3B）统计学显著差异。

图1
图1：小鼠后肢肌肉代表TUNEL标记。 （A）TUNEL标记的鼠后肢显示胫骨前肌，胫骨和皮肤横切面。 TA - 胫前，FDL - 屈趾长肌，EDL - 趾长伸肌。绿色 - TUNEL，蓝色 - 细胞核，红色 - 自体荧光信号。虚线划定的肌肉领域定量。皮肤邻接后肢肌肉提供了一个内部​​阳性对照TUNEL标记。比例尺= 200微米。（B）代表的高倍率图像识别胚胎TUNEL阳性的结构（绿色）第13天小鼠的骨骼肌作为凋亡细胞核。比例尺= 10微米，A和 B Fayzullina和马丁2014年10修饰。（C）横向鼠标后肢部分TUNEL标记的DNA酶处理后作为阳性对照。大多数核拥有明亮TUNEL标记。比例尺= 50微米。（D）的相同小鼠后肢所示C横向部分（半邻接在C部分）的TUNEL标记与末端转移酶酶省略以用作阴性对照。没有亮TUNEL阳性信号;唯一的绿色信号是由自体荧光共定位所检测用的红色信道信号。比例尺= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：组织自发荧光必须考虑和从定量分析时TUNEL标记排除。 （A）鼠标后肢横向与TUNEL标签和自体荧光部分：原始图像（上排），以调整后的阈值相同的图像（中间行），而同样的图像与自体荧光（红色）通道中扣除（下排）。阈值消除了大部分的红血细胞和内皮细胞的自体荧光，但不染色工件（箭头，中间行）。道减法也消除了染色神器（箭头，下排）。绿色 - TUNEL，红 - 自体荧光蓝 - 核。比例尺= 100微米。灰色矩形在一个划定区域放大的B。（B）红色自发荧光板的高放大倍率的图像。红血细胞和一些内皮细胞（箭头），和一个TISSUE染色工件（箭头）autofluoresce在红色和绿色荧光的过滤器。比例尺= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3：TUNEL标记示出的细胞死亡在新生儿的SMA的小鼠的骨骼肌从SMA的小鼠下后肢肌肉在5日龄是由TUNEL法标记为（A）的 TUNEL标记示出的多个轮廓凋亡在多种肌肉群中的SMA小鼠。肌肉（右）与同窝控制（左）进行比较。绿色 - TUNEL，蓝色 - 赫斯特（核），红 - 自体荧光。虚线划定量化肌肉地区。 TA - 胫前，FDL - 屈挖itorum长肌，EDL - 趾长伸肌。比例尺= 200微米。（B）的 TUNEL标记定量为标准化为肌肉的总像素区的TUNEL信号的总像素面积。示，n = 4时表示±标准误差 - 5只小鼠。对每个肌肉群（单尾t检验）SMA和控制之间的统计显着性：* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。这个数字已经被修改Fayzullina和马丁2014年10。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

的方法来检测和描述定量分析DNA损伤相关的细胞凋亡的小鼠骨骼肌。该过程包括组织收获，TUNEL染色，数字图像采集和图像分析。需要常见的组织学用品，工具，以及一个特殊的商业的TUNEL试剂盒是必要的。所需的基本的大设备项目是一个低温恒温器，落射荧光显微镜用数字图像的能力，以及用于图像分析的计算机系统。

实验者应该意识到潜在的陷阱。组织自发荧光的荧光成像的主要问题。在unperfused动物，剩下的红血细胞，将有助于相当高的自体荧光信号。内皮细胞也可以显著自身荧光。因此，重要的是要确认，自发荧光不误TUNEL阳性信号。这种评估是容易被拍摄图像中的信道没有FL完成uorophore，用于比较和减法可能从TUNE​​L阳性通道。在这种方式中，基于荧光的TUNEL法优于比色法明显微镜方法不提供对背景染色内部对照。

组织固定将对TUNEL标记的成功显著影响。最好是尽量减少固定时间多聚甲醛，不超过24小时。胚胎和新生儿的组织，需要固定时间超过24小时显著短。

当TUNEL标记是成功的，TUNEL阳性信号应比背景自发荧光高得多，所以该信号可以容易地由强度阈门控用图像分析软件隔离。使用加热的标准协议在柠檬酸盐缓冲27,35抗原修复可能略有改善低TUNEL信号，如果加热时间保持在最低水平（5分钟），但这种预处理10DS减少TUNEL信号，如果加热被延长更长的时间（ 如 20分钟，95℃）。抗原修复会增加背景自发荧光和假阳性，并且因此可以否定在信噪比从增加的TUNEL信号中的任何收获。

的TUNEL信号测量必须正常化要么定量总肌肉区域或单位面积定量细胞核的数目。由于TUNEL措施凋亡细胞核，理想的正常化将是总的细胞核。然而，即使在相对薄（10微米）的肌肉切片中，肌纤维和细胞核是如此之多，包装如此紧密，这是不可能的自动计数的Hoechst染色的细胞核由阈值和粒子分离算法。人工计数也很劳动密集型和不准确的。可行的办法是要正常化肌肉总面积。

该TUNEL法，用适当的组织处理使用技术和阳性和阴性对照，是一个比较快的，可重复的，定量的，用于检测DNA损伤和细胞死亡的组织的方法。它可以被用来确认细胞凋亡作为病理机制，以确定受影响的细胞类型，并评估治疗性治疗的功效。这个过程将是有价值的研究人员在骨骼肌疾病和损伤，包括SMA，ALS，肌营养不良，毒素引起肌病的领域，和运动生理学。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

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Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

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