Summary
En fremgangsmåde blev udviklet til direkte at udlede humane neurale stamceller fra hæmatopoietiske progenitorceller beriget fra perifere blodceller.
Abstract
Human sygdom specifikke neuronale kulturer er afgørende for generering af in vitro-modeller for humane neurologiske sygdomme. Men den manglende adgang til primære humane voksne neurale kulturer rejser unikke udfordringer. Den seneste udvikling i inducerede pluripotente stamceller (IPSC) giver en alternativ metode til at udlede neurale kulturer fra hudfibroblaster gennem patient specifik iPSC, men denne proces er arbejdskrævende, kræver særlig ekspertise og store mængder af ressourcer, og kan tage flere måneder. Dette forhindrer den brede anvendelse af denne teknologi til undersøgelse af neurologiske sygdomme. For at overvinde nogle af disse spørgsmål, har vi udviklet en metode til at udlede neurale stamceller direkte fra humane voksne perifert blod, uden om IPSC afledning proces. Hæmatopoietiske progenitorceller beriget fra human voksen perifert blod blev dyrket in vitro og transficeret med Sendai-virusvektorer indeholdende transkriptionelle faktorer Sox2, okt3/4, Klf4, og c-myc. Transfektionen resulterer i morfologiske ændringer i cellerne, som er yderligere udvalgt ved hjælp af humane neurale stamfader medium indeholdende basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF). De resulterende celler er kendetegnet ved ekspressionen for neural stamcelle markører, såsom nestin og SOX2. Disse neurale stamceller kan yderligere differentieres til neuroner, astroglia og oligodendrocytter i specificeret differentiering medier. Brug let tilgængelige blodprøver humane perifere, kan denne metode bruges til at udlede neurale stamceller til yderligere differentiering til neurale celler til in vitro modellering af neurologiske lidelser og kan gå videre undersøgelser i forbindelse med patogenesen og behandling af disse sygdomme.
Introduction
In vitro neuronale kulturer er blevet anvendt som et vigtigt redskab til studier af neurologiske sygdomme. Primær dyr (hovedsagelig gnaver) neurale kulturer 1, 2 og humane neurale cellelinier afledt fra gliomer eller andre tumorer er de mest almindeligt anvendte i sådanne undersøgelser. Det er imidlertid blevet erkendt, at der er betydelige forskelle mellem gnaver og humane celler. Mange resultater baseret på gnavere ikke kan oversættes til mennesker. Desuden vil der med den hurtige udvikling inden analysere masse genomisk information og forholdsvis let gen redigering og hele genomsekventering, er tendensen mere og mere gearet til at opdage sygdoms tilbøjelige gener og afgrænse deres funktioner og roller i specifikke sygdomme, hvilket gør de få menneskelige neuronale cellelinier har kun begrænset anvendelse. Teoretisk humane primære neurale kulturer afledt af prøver af patient nervesystem er det bedste valg, men de er umuligt at opnå; derfor alternativ methods er nødvendige. I de senere år har nogle fremgangsmåder blevet fulgt, med to værende den mest skelnes. Efter udviklingen af den teknik genererer inducerede pluripotente stamceller (IPSC) ved hjælp af muse og humane somatiske celler 3, 4, kan neurale celler yderligere differentieret fra dem 5-7. Men generering og karakterisering iPSC kræver intensiv arbejdskraft, teknikker og tid input, undertiden endda uoverkommeligt. Kort efter blev en anden tilgang udviklet til direkte omdanne nerveceller fra somatiske celler 8, 9. Som de resulterende neuroner er ikke-proliferative, begrænser dets anvendelse i intensive undersøgelser og lægemiddelscreening, som kræver en stor mængde celler. For at tage fordelene ved begge teknikker, direkte afledning af neurale stamceller / stamceller fra somatiske celler er blevet udforsket af flere grupper 10-12, som går uden om den kedelige proces med iPSC generation og karakterisering, men stadig bestemdes en anstændig række neurale stamceller til senere neural differentiering. Vi har tidligere vist, at efter indførelsen af Yamanaka transkriptionsfaktorer i hæmatopoietiske progenitorceller, kan neurale stamceller frembringes direkte ved hjælp af en neural progenitorcelle vælge medium 13. Her rapporterer vi metoden i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilsætning af hæmatopoietiske stamceller fra voksne fuldblod
BEMÆRK: hæmatopoietiske stamceller eller CD34 + -celler kan oprenses fra perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) afledt fra en række kilder, herunder navlestrengsblod, leukaferese materiale og fuldblod ved hjælp af densitetsgradientcentrifugering metoder. Fremgangsmåden vist her benytter fuldblod som et eksempel.
- Isolering af PBMC'er fra fuldblod:
- Tilføj 4,5 ml lymfocytseparationsmedium til SepMate rør ved pipettering det gennem det centrale hul i indsatsen.
- Blodprøven fortyndes med et lige volumen sterilt DPBS indeholdende 2% human serum (v / v). For eksempel fortyndes 5 ml af prøven med 5 ml DPBS + 2% humant serum.
- Tilføj den fortyndede prøve ved at pipettere det ned i siden af røret. Pas på ikke at hælde prøven direkte gennem det centrale hul.
- Centrifuger ved 1.200 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt supernatanten over PMBC laget.
- Opsaml PBMC lag (uklar) til et nyt rør.
- Der tilsættes 15 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) indeholdende 2% human serum ind i røret og der centrifugeres ved 150 xg i 10 minutter ved RT med bremsen.
- Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 15 ml DPBS indeholdende 2% human serum. Tæl antallet af celler.
- Centrifuger ved 690 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern alle supernatanten fra røret.
- Resuspender celler ved 1 x 10 7 celler pr 15 ml Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) indeholdende 1% antibiotika (v / v) og 10% human serum (v / v).
- Inkubér cellerne O / N ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator, før isolering CD34 + celler.
- Positiv selektion af CD34 + -celler fra PBMCer ved hjælp af CD34 MultiSort Kit:
BEMÆRK: arbejde hurtigt og bruge præ-kølet løsninger til at gøre cellerne kulde og forhindre cappingaf antistoffer på celleoverfladen og ikke-specifik cellemærkning pr kittet instruktion.- Saml alle PMBC'erne i en 50 ml rør og tælle antallet af totale celler i mediet.
- Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 10 min. Fjern alle supernatanten fuldstændig.
- Resuspender op til 10 8 celler pr 300 gl i perle-buffer (DPBS indeholdende 0,5% human serum (v / v) og 2 mM EDTA).
- Tilsæt 100 pi FcR Blokering Reagent og tilsættes 100 pi af CD34 MultiSortMicroBeads.
- Bland godt og inkuberes i 30 minutter i køleskab (2 - 8 ° C).
- Vask cellerne ved tilsætning af 2 ml af perle buffer per 10 8 celler og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten fuldstændig.
- Resuspender op til 10 8 celler i 500 pi buffer.
- Placer MACS LS-søjle i det magnetiske felt i en MACS Separator og forberede kolonne ved skylning med 3 ml perle buffer.
- Påfør cellesuspension på center af søjlen. Umærkede celler vil strømme igennem, som kan indsamles, hvis det foretrækkes.
- Vask kolonne tre gange med 3 ml perle buffer.
- Fjern kolonnen fra separatoren og placere den på en 15 ml rør.
- Der tilsættes 5 ml perle buffer på søjlen og skyl straks de magnetisk mærkede celler ved at trykke stemplet i kolonnen.
- Tilføj 20 pi MultiSort Frigivelse Reagens per 1 ml cellesuspension. Bland godt og inkuberes i 10 minutter i køleskab (2 - 8 ° C).
- Tilføj 1 - 2 ml perle buffer per 10 7 celler og centrifuger cellerne ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten fuldstændig.
- Resuspender celler i 50 pi bead buffer per 10 7 celler.
- Tilsæt 30 pi MultiSort stopreagens per 10 7 celler og inkuberes i 15 minutter i køleskabet.
- Der tilsættes 5 ml perle buffer og centrifugeres cellerne ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes.
2. Afledning af induceret neurale stamceller fra CD34 + -celler
- CD34 + celler kultur:
BEMÆRK: Frisk fremstillet medium bør anvendes inden for 7 dage, når de opbevares i køleskab. Signifikant CD34 celler tab kunne observeres efter 24 timer, men signifikant proliferation af celler skal være mærkbar, især efter dag 5. Hvis celleantallet aftager kontinuerligt eller der er ingen proliferation, betyder det enten dårlig kvalitet af medium eller CD34-celler, og cellerne bør ikke anvendes til næste trin.- Resuspender og kultur CD34 + celler i CD34 opretholder medium (StemSpan SFEM medium indeholdende human thrombopoietin (TPO, 100 ng / ml), fms-lignende tyrosinkinase 3 (Flt-3) ligand (100 ng / ml) og stamcellefaktor (SCF, 100 ng / ml), interleukin-6 (IL-6, 20 ng / ml) og interleukin-7 (IL-7, 20 ng / ml)) i en 24-brønds plade (op til 3 x 10 5 / brønd i 1 ml medium per brønd) ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator.
- After 24 timer, indsamle de flydende celler og centrifuger cellerne ved 110 xg ved stuetemperatur for at slippe af eventuelle vedhæftede celler og cellerester. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml frisk CD34 opretholde medium og frø i en ny 24-brønds plade (op til 1 x 10 5 / brønd) ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator i yderligere 5 dage.
- Erstat halvdelen af mediet hver anden dag ved forsigtigt at aspirere den øverste halvdel af supernatant, mens CD34 + -celler er flydende på bunden af brøndene (figur 1A).
- Sendai-virus transfektion:
- På dag 5, indsamle CD34 cellerne og centrifugeres cellerne ved 170 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes.
- Resuspender cellerne i frisk medium ved 1 x 10 5 / brønd i en plade med 24 brønde i 1 ml medium.
- Optø en cytotune-IPS Sendai omprogrammering kit ved først at nedsænke bunden af rørene i et 37 ° C vandbad i 10 sekunder og derefter fuldstændig tø ent RT. Kort centrifugeres rørene og sætte dem på is. Forbered virus blandingen Sendai ved at blande den anbefalede mængde af hvert virus noteret på Analysecertifikatet (COA) for den tilsvarende parti. MOI 15 anbefales.
- Tilføj Sendai virus mix til hver brønd af CD34 celler. Bland brøndene ved forsigtigt at ryste. Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator.
- Overhold transfektionseffektiviteten efter 24 timer. Bemærk at celleaggregater og sfære dannelse er indikatorer for en vellykket transfektion (figur 1B).
- Skift halvdelen af mediet ved forsigtigt at overføre den øverste halvdel af medium til et andet godt. Hvis der er celle kugler i den nye godt, tilsæt den samme mængde frisk medium.
- Skift medium hver forleden ved at gentage trin 2.2.6.
- Neural stamcelle induktion:
BEMÆRK: Afhængigt af celle betingelser, omkring 5 eller 7 dage efter transfektion, vil monolag adhærente celler nå op på 30 -50% konfluens (figur 1C).- Fjern supernatanter indeholdende flydende celler og kugler og derefter tilsættes 1 ml neural progenitorcelle medium (Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) indeholdende 1x N2 supplement, 0,1% (w / v) bovint serumalbumin ( BSA), 1% (v / v) antibiotika, 20 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og 20 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF)) i adhærente celler.
- Eventuelt dissociere celle sfærer ved forsigtigt at pipettere og centrifugeres cellerne ved 170 x g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml neural progenitor medium i en ny 24-brønds plade overtrukket med matrigel pr instruktion op igen.
- Skift medium hver anden dag indtil cellerne når 60-80% sammenflydende, som regel efter 1 uge.
- Supernatanten fjernes, og tilføje 1 ml neural stamcelle medium (serumfrit medium, NSC SFM). Dissociere cellerne ved hjælp af en celleskraber efterfulgtved meget forsigtig pipettering.
- Fjerne cellerne og frø dem alle i en brønd af en 6-brønds plade. Tilføj anden 1 ml neural stamcelle medium at 2 ml medier til hver brønd. Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator.
- Skift medium hver anden dag.
- Når cellerne nåede 60% konfluens, dissociere og replate cellerne ved 1: 3-forhold følge trinene i 2.3.4 og 2.3.6.
- Frysning af neurale stamceller:
- Forbered neural stamcelle frysemedium ved tilsætning af 20% dimethylsulfoxid (DMSO) i neural stamcelle medium. Hold frysemedium på is.
- Dissociere cellerne i en 6-brønds plade ved anvendelse celleskraber efterfulgt ved forsigtigt at pipettere. Tæl cellerne. Centrifugeres cellerne ved 170 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes.
- Resuspender cellerne i neural stamcelle medium ved 1 x 10 6 / ml. Tilføj det samme volumen af frysning medium til cellerne.
- Tilsæt 1 ml (5 x 10 5 totale celler) af celler i et kryohætteglas. Frys cellerne under anvendelse af en hr Froster frysning beholder efter instruktion.
3. Neural Cell Differentiering
- Neuronale celler differentiering:
- Når neurale stamceller nå 80% konfluens, løsnes de neurale stamceller ved hjælp af en gummi politimand og derefter tage afstand ved forsigtigt at pipettere.
- Tæl celler og justere koncentrationen til 1 x 10 5 / ml i neural stamcelle medium.
- For neuronal differentiering plade celler på poly-D-lysin / laminin coated dækglas i 24-brønds plader ved 1 x 10 5 / brønd. Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator.
- Erstat mediet med neural differentiering medium (DMEM / F12 indeholdende 1x N2 supplement, 1x B27 supplement, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM vitamin C, 10 ng / ml hjerne neurotrofisk faktor (BDNF) og 10 ng / ml glial celle afledt neurotrofisk faktor (GDNF)) AFter 24 timer. Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator.
- Skift neural differentiering medium to gange om ugen i 2 uger.
- Astrogliale differentiering:
- Dissociere neurale stamceller ved pipettering.
- Tæl celler og justere cellekoncentrationen til 5 x 10 4 celler / ml. Seed cellerne på 24-brønds plader. Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator.
- Erstat mediet med DMEM / F12 med 10% føtalt bovint serum (FBS) og inkuber cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator.
- Skift medium to gange om ugen i 2 uger. Hvis cellerne når sammenløb før for 2 uger, replate cellerne følgende trin 3.2.1 og 3.2.2.
- Oligodendrocyt differentiering:
- Dissociere neurale stamceller ved pipettering.
- Tæl celler og såsæd 1 x 10 5 celler på poly-L-ornithin overtrukne plader med 24 brønde i 1 ml oligodendrocyt differentiation medium bestående af DMEM / F12 indeholdende N2 supplement, 10 ng / ml blodpladeafledt vækstfaktor-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml neurotrophin-3 (NT-3), 2 ng / ml af Sonic hedgehog ( Shh) og 3 nM triiodothyronin (T3). Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO 2-inkubator.
- Skift medium to gange om ugen i 2 uger.
- Erstat mediet med DMEM / F12 med 1xN2 supplement og 3 nM af T3 og dyrkning af cellerne i en yderligere uge for myelin basisk protein (MBP) produktion.
4. immunfluorescensfarvning
- Erstat medier med 4% paraformaldehyd (PFA). Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér PFA og vask med PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 (PBS-T) 3 gange, 5 minutter hver gang.
- Permeabilisere cellerne med PBS indeholdende 0,5% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Bloker cellerne med PBS-T indeholdende 4% gedeserum i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuberes cellerne med tilsvarende primære Antibomatricer fortyndet i PBS-T indeholdende 0,1% BSA i 2 timer ved stuetemperatur eller O / N i kølerum.
- Vask cellerne 3 gange med PBS-T, 5 min hver gang. Inkubér cellerne med tilsvarende sekundære antistoffer koblet med et fluorochrom anvendelse af 1: 400 fortynding i PBS-T indeholdende 0,1% BSA i 1 time på et rysteapparat i mørke.
- Vask cellerne med PBS-T indeholdende 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne to gange med PBS-T for 5 min hver ved stuetemperatur.
- Overhold de mærkede celler under anvendelse af et mikroskop og tage billeder (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten af CD34-celler er afgørende for succes i neurale stamceller transduktion. Høj kvalitet CD34-celler formere i de første par dage af kultur og fremstår som ikke klæbende, homogent runde celler, svævende lige over bunden af dyrkningsbeholdere (figur 1A). De vellykkede infektion resulterer i celleaggregater, der udvider sig over tid (figur 1B), mens der kan forekomme uspecifikke celleaggregater under cellekultur, som udvider og foreningerne er løse. Adhærente celler normalt vises omkring tre til fem dage efter transfektion; de er hovedsagelig bipolar og vil proliferere at monolag (figur 1c). Efter et valg med neural progenitorcelle medium fleste af de adhærente celler er nestin og SOX2 positive men OCT4 negative (figur 2). De inducerede neurale stamceller kan yderligere differentieret til neuroner og glia (figur 3).
ent "FO: keep-together.within-side =" altid ">
Kan observeres Figur 1. Morfologiske ændringer af CD34 celler efter Sendai virus transfektion. (A) en væsentlig antal af CD34-celler ved transfektion. (B) Sphere som celleaggregater kan iagttages 24 timer efter Sendai virus transfektion som ekspanderer under tid. (C) Mest bipolære klæbende celler viste sig efter 5 dages transfektion. (D og E) Typiske morfologier af neurale stamceller er vist efter induktion med neural stamcelle medium og ekspansion. Scale bar:. 200 um for (A) og (B), 400 um for de øvrige Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Induceret neurale stamceller udtrykker neural stamcelle markører. Neurale stamceller udtrykker nestin og SOX2 men ikke OCT4. Scale bar:. 200 um Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Neurale stamceller differentiering. De neurale stamceller kan differentieres til celler med neuronal markør (A), astroglial markør GFAP (B), og oligodendrocyt markører O4 (C). Scale bar:. 100 um Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En detaljeret protokol til direkte at generere neurale stamceller fra perifert hæmatopoietiske progenitorceller er tilvejebragt.
Sammenlignet med fibroblastceller, humant perifert blod er mere tilgængelig. Ved hjælp af præsenterede protokol, mere end 1 x 10 5 hæmatopoietiske stamceller eller CD34-positive celler, kan beriges fra 10 ml fuldblod. Selv om forurening med blodplader er normalt ikke forebygges, kan det let reduceret med lavere hastighed centrifugering, og det ikke interfererer med neural generation stamcelle. Kvaliteten og antallet af CD34-celler vil imidlertid afgørende for den endelige produktion af neurale stamceller. Kvaliteten af CD34-celler kan groft bedømmes ud fra deres reaktion på CD34 dyrkningsmedium. Et positivt svar, hvilket betyder hurtig proliferation af CD34-celler i mediet, er kritisk for senere vellykket transformation. Hvis CD34-celler ikke proliferere eller endog undergår signifikant celletab, så TRANSFOrmation bliver vanskelig, hvilket resulterer i mindre proliferative celler. Det er således foreslået at kun starte transformation med god kvalitet CD34-celler. Selv 1 x 10 5 CD34-celler er nok for en erfaren forsker, kan 3 x 10 5 celler anvendes for startere.
Brug af Sendai virus giver en ikke-integration, højeffektive og bekvem måde at introducere transkriptionelle faktorer i målretning celler 14, 15. Oprindeligt brugt til at generere iPSC blev Yamanaka faktorer også med succes bruges til at generere neurale stamceller direkte fra fibroblaster 11. I en tidligere rapport ved hjælp af præsenterede protokol kan Sendai-virus indeholdende Yamanaka faktorer også anvendes til at generere neurale stamceller fra navlestrengsblod eller voksne perifere blodceller hæmatopoietiske. I forhold til at bruge hudbiopsi til dyrkning fibroblaster, blod er nemmere og mere bekvemt at få. Desuden er det rapporteret, at hæmatopoietiskeceller udtrykker også visse neurale specifikke markører 16, hvilket gør det et bedre valg til at generere neurale stamceller. Faktisk, efter Sendai-virus-infektion, de fleste af de vedhæftede monolag celler udtrykte nestin, en neural stamcelle markering, undtagen de mere aggregerede kompakte kolonier, hvoraf nogle kan give anledning til iPSC på et senere tidspunkt. Således vedlagte monolag af celler opsamles og inkuberes yderligere i neural progenitorcelle medium, som har været meget anvendt i primær neural progenitorcelle kultur, for at lette den neurale stamceller skæbne af cellerne.
Der er en hårfin balance at opretholde de neurale stamceller. På den ene side foretrækkes det, at cellerne til at have bedre prolifererende kapacitet og passeres så mange gange som muligt. På den anden side, den lethed at differentiere dem til neuroner er også kritisk. To forskellige medier bruges til at opnå denne balance. Den udbredte neural progenitor medium er valgt til nEURAL stamcelle identitet induktion / udvælgelse, som er kritisk proces i første omgang. Det kan også anvendes ved senere passager styrke neuronal differentiering kapaciteter. Men de neurale stamceller er meget skrøbelige og følsomme, så langvarig udsættelse for neural progenitorcelle medium kan i høj grad hæmme celledeling og resultere i overdreven differentiering. Således neural stamcelle medium bruges til at hjælpe celleindvinding og lette celleekspansion. Den neurale progenitorcelle medium anvendes for neural induktion ved passage 1, hvor cellerne bliver konfluente. Hvis overdreven inhibering af celleproliferation og toksicitet er bemærket, er det nødvendigt at udskifte mediet tidligt med neurale stamceller medium. Imidlertid neural stamcelle medium er mindre effektiv i neural udvælgelse; således over tid, især med over-sammenflydende neurale stamceller eller forsinket passage, kan kontaminering med ikke-neurale celler eller mangel på neural differentiering forekomme. Således cellerne behøver atpasseres regelmæssigt, når mindre end 60% konfluente og mindst en gang om ugen. Neural markering med neural stamcelle medium findes i senere passager at genetablere neurale identitet. En anden faktor, der påvirker stemness af neurale stamceller er belægning af vævskulturpladerne. Coating med Matrigel eller poly-D-lysin kan bidrage til cellebinding først i tilfælde cellerne er vanskelige at fastgøre under genudpladning. Men lang tids påvirkning af coating giver mindre passage numre. Dette skyldes, at belægningen øger celledifferentiering proces og kan resultere i mere skade på cellerne under dissociation.
Som en oversigt, denne protokol, der anvendes Sendaivirus indeholdende Yamanaka faktorer direkte udlede humane neurale stamceller indenfor 3 - 4 uger fra voksne hæmatopoietiske stamceller opnået fra tilgængelige perifere blodprøver. De neurale stamceller kunne være længere differentieret til neuroner og glia. Denne metode omfartsvejede langvarige og komplicerede IPSC generation processer, der aktuelt anvendes, og kan anvendes til in vitro-cellekultur modellering af forskellige neurologiske lidelser, der bedre kan repræsentere de genetiske forskelle i specifikke lidelser, især fra individuelle patientprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte separation medium | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Human serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1x |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1,000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μg/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
