Summary
직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.
Abstract
인간의 질병 특정의 연결을 문화는 인간의 신경 질환에 대한 체외 모델의 생성에 필수적이다. 그러나, 인간 성인 일차 배양 신경에 대한 액세스는 고유의 부족 문제를 제기한다. 유도 만능 줄기 세포의 최근 개발 (IPSC)는 환자의 특정 IPSC을 통해 피부 섬유 아 세포에서 신경 문화를 유도하기 위해 또 다른 방법을 제공하지만,이 과정은 노동 집약적이며, 특별한 전문 지식과 자원의 많은 양을 필요로하고, 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 이것은 신경 질환의 연구에이 기술의 다양한 응용 프로그램을 방지 할 수 있습니다. 이러한 문제들을 극복하기 위해, 우리는 IPSC 도출 과정을 거치지 않고, 직접 사람 성인 말초 혈액으로부터 신경 줄기 세포를 유도하는 방법을 개발 하였다. 성인 인간의 말초 혈액에서 농축 조혈 전구 세포가 시험 관내에서 배양하고 10 월을 전사 요인 SOX2 함유 센다이 바이러스 벡터로 형질3/4, Klf4 및 c-Myc와. 상기 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 인간 신경 전구 매체를 이용하여 선택되는 세포의 형태 학적 변화의 형질 전환 결과. 생성 된 세포는 네 스틴과 같은 SOX2 같은 신경 줄기 세포 마커에 대한 발현을 특징으로한다. 이러한 신경 줄기 세포는 더 뉴런, 아스트로 글 리아 세포가 지정된 차별화 미디어에서 희소 돌기 아교 세포로 분화 될 수있다. 쉽게 접근 인간 말초 혈액 샘플을 사용하여,이 방법은 신경 질환의 체외 모델링 신경 세포로 더욱 분화 신경 줄기 세포를 유도하는데 이용 될 수 있으며, 이들 질환의 병인 및 치료에 관한 시험을 진행할 수있다.
Introduction
시험관 내에서의 연결을 문화는 신경 질환의 연구를위한 기본적인 도구로 사용되어왔다. 일차 동물 (주로 쥐) 신경 배양 1, 2, 또는 다른 신경 교종 종양에서 유래 인간 신경 세포주는 가장 일반적으로 사용되는 등의 연구에있다. 그러나, 설치류 및 인간 세포 사이에 상당한 차이가 있음을 인식하고있다. 설치류에 기초하여 다수의 발견은 인간으로 변환 될 수 없다. 또한, 대량의 게놈 정보 및 비교적 쉽게 유전자 편집 및 총 유전체 분석의 급속한 발전과 함께, 추세는 더욱 기어 몇몇 인간 신경 세포를 만드는 질병 경향 유전자를 검색하고 특정 질환의 기능 및 역할을 서술하는 것 세포주 만 사용을 제한. 이론적으로, 환자 신경계의 샘플에서 파생 된 인간의 기본 신경 문화 최선의 선택을하지만 그들은 얻을 불가능하다; 따라서 다른 메타ODS가 필요합니다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 접근법은 두 가장 구별되는 함께 진행되고있다. 생성 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC)을 사용하여 마우스 및 인간 체세포 기술의 발달에 따라 3, 4는, 신경 세포들을 상기 5-7에서 차이가있을 수있다. 그러나, 생성 및 IPSC을 특성화하는 것은 노동 집약적, 기술, 시간 입력을 요구하고, 때로는 엄청나게. 얼마 후, 또 다른 접근 방식은 직접 체세포 8, 9에서 신경 세포를 변환하기 위해 개발되었다. 생성 된 뉴런 비 증식하는, 그 예의 연구 및 세포 많이 필요 약물 스크리닝에의 응용을 제한한다. 두 가지 기술, 신경 줄기를 직접 유도의 장점을 활용하려면 / 체세포에서 전구 세포는 여전히 IPSC 생성 및 특성화하지만 있습니다 provi의 지루한 과정을 거치지 여러 그룹 10-12에 의해 탐구되었다데 나중에 신경 분화 신경 줄기 세포의 괜찮은 번호. 우리는 이전에 조혈 전구 세포로 야마나카 전사 인자의 도입 다음, 신경 줄기 세포가 직접적으로 매체 (13)를 선택하는 신경 전구 세포를 이용하여 생성 될 수 있음을 보여 주었다. 여기서 우리는 자세히 방법을보고한다.
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Protocol
성인 전혈 1. 농축 조혈 전구 세포
주 : 조혈 전구 세포 또는 CD34 + 세포를 밀도 구배 원심 분리 기반의 방법을 이용하여 제대혈, 백혈구 성분 채집 물질 및 전혈을 다양한 소스로부터 유도 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 정제 될 수있다. 여기에 나열된 방법은 예를 들어 전혈을 사용한다.
- 전체 혈액에서 PBMC를의 분리 :
- 삽입물의 중앙 구멍을 피펫 팅하여 SepMate 튜브에 림프구 분리 매체의 4.5 ML을 추가합니다.
- 2 % 인간 혈청을 함유하는 무균의 DPBS 동량 혈액 시료를 희석 (V / V). 예를 들어, DPBS + 2 % 인간 혈청을 5 ml의 샘플 5 ml의 희석.
- 튜브의 측면을 아래로 피펫 팅에 의해 희석 된 샘플을 추가합니다. 중앙 구멍을 통해 직접 샘플을 부어 않도록주의하십시오.
- 실온에서 10 분 동안 1,200 XG에 원심 분리기.
- 조심스럽게 PMBC 층 위의 상층 액을 제거합니다.
- 새로운 튜브로 PBMC 층 (흐린)를 수집합니다.
- 브레이크 해제와 함께 실온에서 10 분 동안 150 XG에서 2 % 인간의 튜브에 혈청 및 원심 분리기를 포함하는 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 15 ML을 추가합니다.
- 뜨는을 취소하고 2 % 인간 혈청을 포함하는 DPBS 15 ml의 펠렛을 재현 탁. 세포의 수를 계산.
- 실온에서 10 분 동안 690 XG에 원심 분리기. 튜브에서 모든 상층 액을 제거합니다.
- 15 1 % 항생제를 포함 Iscove의 수정 둘 베코의 매체 (IMDM)의 ㎖ (v / v)의 10 % 인간 혈청 당 1 × 10 7 세포에서 재현 탁 세포 (v / v)로.
- CD34 + 세포를 분리하기 전에 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 배양기를 세포 O / N을 품어.
- CD34 MultiSort 키트를 사용하여 한 PBMC에서 CD34 + 세포의 긍정적 인 선택 :
참고 : 빠른 작업 차가운 세포를 만들기 위해 사전 냉각 솔루션을 사용하여 캡을 방지키트 지시에 따라 세포 표면 비특이적 세포의 표지에 대한 항체.- 50 ㎖ 튜브에 모두 모아서 PMBCs 배지에서 총 세포 수를 계산.
- 10 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 완전히 모든 상층 액을 제거합니다.
- 10 8 비드 버퍼 300 μL 당 세포 (DPBS 포함 0.5 % 인간 혈청 (v / v)의 2 mM의 EDTA)까지 재현 탁.
- 의 FcR 차단 시약 100 μl를 추가하고 CD34의 MultiSortMicroBeads 100 μl를 추가합니다.
- 잘 섞어 냉장고에 30 분 동안 배양 (2-8 ° C에서).
- 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 비드 (10) 8 셀 당 버퍼와 원심 분리기 2 ㎖를 첨가하여 세포를 씻으십시오. 완전히 뜨는을 제거합니다.
- 버퍼의 500 μl의 10 8 셀을 재현 탁.
- MACS 분리기의 자기장에 MACS LS 열을 올려 놓고 비드 버퍼의 3 ㎖로 세척하여 열을 준비합니다.
- cente에 세포 현탁액을 적용열의 R. 레이블이없는 세포를 선호하는 경우이를 통해 수집 할 수 흐를 것이다.
- 워시 열 비드 버퍼의 3 ㎖로 3 회.
- 분리기로부터 열을 제거하고 15 ML 튜브에 놓습니다.
- 컬럼 상 비드 완충액 5 mL를 첨가하고, 즉시 컬럼으로 플런저를 밀어 자기 적으로 표지화 된 세포를 세척.
- 세포 현탁액 1 ㎖ 당 MultiSort 출시 시약의 20 μl를 추가합니다. 잘 섞어 냉장고에 10 분 동안 배양 (2-8 ° C에서).
- 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 세포를 10 7 셀 당 구슬 버퍼 2 ㎖ 원심 분리기 - 1을 추가합니다. 완전히 뜨는을 제거합니다.
- 10 7 세포 당 비드 버퍼의 50 μL에 재현 탁 세포.
- 10 7 세포 당 MultiSort 중지 시약의 30 μl를 추가하고 냉장고에 15 분 동안 품어.
- RT에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 비드 완충액 5 mL를 첨가하고 원심 분리기. 상층 액을 제거한다.
CD34 + 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 2. 유도
- CD34 + 세포 배양 :
참고 : 냉장고에 보관하면 갓 준비한 매체는 7 일 이내에 사용되어야한다. 상당한 CD34 세포 손실이 24 시간 후에 관찰 될 수도 있지만, 셀 번호가 연속적으로 감소하거나 전혀 증식이 없으면 세포의 현저한 증식 특히 일 5. 후에 두드러 질 경우, 이는 불량 매체 또는 CD34 세포의 품질과 세포를 의미 다음 단계에 사용되어서는 안된다.- CD34에 재현 탁하고 배양 CD34은 + 세포 (인간 트롬 함유 (StemSpan SFEM 매체 SCF를 (TPO, 100 NG / ㎖), FMS 같은 티로신 키나아제 3 (예를 들어 Flt-3) 리간드 (100 NG / ml) 및 줄기 세포 인자를 배지를 유지 NG 100 / ㎖), 인터루킨 -6 (IL-6, 20 NG / ml) 및 인터루킨 -7 (IL-7, 24- 웰 플레이트에서 20 NG / ㎖)) (최대 3 × 105 / 웰 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 잘 당 중) 1 ㎖.
- AF터 24 시간은 부동 세포를 수집하고 연결된 모든 세포와 세포 파편을 제거하는 RT 110 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 추가로 5 일 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 새로운 24 웰 플레이트 (물론 최대 1 × 10 5 /)에서 신선한 CD34 유지 매체와 씨앗의 1 ml의 세포를 재현 탁.
- CD34 + 세포가 우물 (그림 1A)의 바닥에 떠있는 동안 조심스럽게 상층 액의 위쪽 절반을 흡입하여 매체마다 다른 하루의 절반을 교체합니다.
- 센다이 바이러스 형질 :
- 5 일째, CD34 세포를 수집하고 RT에서 10 분 동안 170 XG에 세포를 원심 분리기. 상층 액을 제거한다.
- 웰의 배지 1 ㎖ 중의 24- 웰 플레이트에 1 × 105 / 신선한 배지에서 세포를 재현 탁.
- 처음 10 초 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브의 바닥을 담금으로써 cytotune - 만능 줄기 센다이 리 프로그래밍 키트를 해동 한 후 완전히 해동t RT. 간단히 튜브를 원심과 얼음에 넣어. 해당 로트의 분석 인증서 (COA)에 나열된 각 바이러스의 권장 볼륨을 혼합하여 센다이 바이러스 혼합물을 준비합니다. MOI (15)을 권장합니다.
- CD34 세포의 각 웰에 센다이 바이러스 믹스를 추가한다. 부드럽게 흔들어 우물을 섞는다. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어.
- 24 시간 후 형질 전환 효율을 관찰한다. 세포 집합체 및 구 형성이 성공적으로 형질 전환 (그림 1B)에 대한 지표는 것을 알 수 있습니다.
- 조심스럽게 다른 매체의 위쪽 절반을 전송 잘하여 매체의 절반을 변경합니다. 새로운 웰 세포 분야가 있다면, 새로운 배지의 동일한 양을 첨가하는 것이 바람직하다.
- 단계 2.2.6를 반복하여 다른 일 매체마다 변경합니다.
- 신경 줄기 세포의 유도 :
주 : 셀 조건에 따라 약 5 칠일 형질 감염 후, 부착 세포 단층 (30)에 도달한다 -50 %의 합류 (그림 1C).- 영양소 혼합물 F-12 1X N2 보충제, 0.1 % (w / v)의 소 혈청 알부민을 함유하는 (DMEM / F12), ((둘 베코 변형 이글 중간 부유 세포 및 구 함유 상층 액을 제거한 후 신경 전구 배지 1 ㎖를 추가 BSA), 1 % (V / V) 항생제, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 20 ng를 / ㎖ (의 bFGF) 및 부착 세포 내로 표피 성장 인자 (EGF)) 20 ng / ml이되게 준비 하였다.
- 임의로, 부드럽게 피펫 팅하여 세포를 해리 분야 및 10 분 동안 170 XG에 세포를 원심 분리. 상층 액을 제거하고 다시 명령 당 리겔로 코팅 된 새로운 24 웰 플레이트에서 신경 전구 배지 1 ㎖의 세포를 재현 탁.
- 80 %의 합류 보통 일주 후, - 세포가 60에 도달 할 때까지 매일 매체를 변경합니다.
- 상층 액을 제거하고 신경 줄기 세포 배지 (무 혈청 배지, NSC SFM) 1 ㎖에 추가 할 수 있습니다. 이어서 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 해리매우 부드러운 피펫으로.
- 세포를 제거하고 6- 웰 플레이트의 한 웰에 그들 모두를 시드. 신경 줄기 세포 매체의 다른 1 ㎖를 각 웰에 대해 2 ml의 용지를 만들기 위해 추가. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어.
- 일전에 매체마다 변경합니다.
- 세포가 60 % 합류에 도착했을 때, 해리와 1의 세포를 replate : 2.3.4과 2.3.6의 단계에 따라 3 비율.
- 신경 줄기 세포의 냉동 :
- 신경 줄기 세포의 배지에 20 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 첨가하여 동결 배지 신경 줄기 세포를 준비한다. 얼음에 동결 매체를 보관하십시오.
- 부드럽게 피펫 팅 하였다 셀 스크레이퍼를 사용하여 6 웰 플레이트에 세포를 해리. 세포를 계산합니다. RT에서 10 분 동안 170 XG에 세포를 원심 분리기. 상층 액을 제거한다.
- 1 × 106 / ㎖에서 신경 줄기 세포 배지에서 세포를 재현 탁. 세포에 매체를 동결 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 1 ㎖ (5 × 1 추가cryovial에 세포의 0 ~ 5 총 세포). 다음 명령어 씨 Froster 냉동 컨테이너를 사용하여 세포를 동결.
3. 신경 세포 분화
- 신경 세포의 분화 :
- 신경 줄기 세포가 80 % 합류에 도달하면 고무 경찰관을 사용 신경 줄기 세포를 분리 한 다음 온화하게 피펫 팅하여 해리.
- 세포를 세어 신경 줄기 세포 배지에서 1 × 105 / ml의 농도로 조정한다.
- 신경 세포의 분화를 들어, 폴리 D 라이신 / 라미닌 코팅 덮개의 세포를 판 잘 1 × 10 5 / 24 웰 플레이트에서 미끄러 져. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어.
- 신경 분화 매체와 매체를 교체 (DMEM 1 배 N2 보충, 1X B27 보충제, 300 NG / ㎖ 캠프, 0.2 mM의 비타민 C, 신경 영양 인자 (BDNF 유도 10 NG / ml의 뇌) 10 NG / ㎖ 아교 세포를 포함 / F12 유도 신경 영양 인자 (GDNF)) AF터 24 시간. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어.
- 2 주간 일주일에 두 번 신경 분화 매체를 변경합니다.
- Astroglial 차별화 :
- 피펫으로 신경 줄기 세포를 해리.
- 세포를 세어 5 × 104 세포 / ml의 세포 농도를 조절한다. 24 웰 플레이트에 세포를 시드. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어.
- 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 DMEM / F12 배지로 교체하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
- 2 주간 일주일에 두 번 매체 변경합니다. 세포가 이주 전에 합류에 도달하면, 단계 3.2.1과 3.2.2 다음 세포를 replate.
- 희소 돌기 아교 세포의 분화 :
- 피펫으로 신경 줄기 세포를 해리.
- 희소 돌기 아교 differenti 1 ml의 세포 및 종자 폴리 -L- 오르니 틴 코팅 된 24 웰 플레이트에 1 × 105 세포 개수, N2 보충제를 함유하는 DMEM / F12 혈소판 유래 성장 인자-AA (PDGF-AA) 10ng의 / ㎖, 뉴로 트로 핀 -3 (NT-3)의 2 ng를 / ㎖, 소닉 헤지 호그의 2 ng를 / ㎖로 이루어진 ATION 매체 ( 쉬) 및 트리 요오 도티 로닌 (T3 3 ㎚). 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어.
- 2 주간 일주일에 두 번 매체 변경합니다.
- DMEM / 1xN2 보충과 F12와 T3의 3 nM의 문화 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 생산을위한 추가 주에 대한 세포 매체를 교체합니다.
4. 면역 형광 염색법
- 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 미디어를 교체합니다. 실온에서 10 분 동안 품어.
- PFA를 버리고 PBS 0.1 % 트리톤 X-100 (PBS-T) 3 회, 5 분마다 포함 씻어.
- PBS는 RT에서 10 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 세포를 Permeabilize 하시려면.
- PBS-T는 RT에서 20 분 동안 4 % 염소 혈청을 함유하는 세포와 차단.
- 해당 차 antibo와 세포를 품어냉장실 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안 0.1 % BSA를 함유하는 PBS-T에 희석 죽는다.
- PBS-T, 5 분마다 3 번 세포를 씻으십시오. 어둠 속에서 진탕 기에서 1 시간 동안 0.1 % BSA를 함유하는 PBS-T에 희석 400 : 1을 사용하는 형광 색소와 결합 이차 항체에 상응하는 세포를 배양한다.
- 실온에서 10 분 동안 4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)를 포함하는 PBS-T와 세포를 씻으십시오.
- RT에서 5 분마다 PBS-T로 세포를 두 번 더 씻는다.
- 현미경을 사용하여 레이블 세포를 관찰하고 걸릴 사진 (그림 3).
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Representative Results
CD34 세포의 품질은 신경 줄기 세포 전달의 성공에 중요하다. 높은 품질의 CD34 세포는 문화의 일의 처음 몇 동안 증식 단지 배양 용기 (그림 1A)의 바닥 위에 떠, 비 점착성, 균일 라운드 세포로 나타납니다. 세포의 확장이 아닌 특정 세포 집계 세포 배양 중에 발생할 수 있지만, 시간 (그림 1B)를 통해 확장 집계 및 협회의 성공적인 감염 결과가 느슨하다. 부착 세포는 일반적으로 형질 전환 후 3-5일 주위에 나타납니다; 그들은 대부분 바이폴라 및 단일 층 (그림 1C)를 만들어 증식한다. 신경 전구 세포 매체와 선택 후 부착 세포의 대부분은 네 스틴 및 SOX2 긍정적 인 Oct4하지만 마이너스 (그림 2)입니다. 유도 된 신경 줄기 세포는 신경 세포와 아교 세포 (그림 3)에 더 차별화 될 수 있습니다.
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도 1 센다이 바이러스 형질 전환 후 CD34 세포의 형태 학적 변화한다. (A) CD34 세포의 형질 감염은 상당한 수의 시간에 관찰 될 수있다. (B) 구가 세포 집합체 같은 시간 동안 확장 센다이 바이러스 형질 전환 후 24 시간을 관찰 할 수있다. (C) 대부분 바이폴라 부착 세포는 형질 5 일 후에 나타났다. (D 및 E) 신경 줄기 세포의 전형적인 형태학 신경 전구 매체와 확장으로 유도 한 후 표시됩니다. 스케일 바 :. (200) (A)에 대한 μm의 (B), 다른 사람에 대한 400 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 유도 된 신경 줄기 세포는 신경 줄기 세포 마커를 발현. 신경 줄기 세포가없는 인 Oct4 스틴 및 SOX2하지만 표현한다. 스케일 바 :. 200 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 신경 줄기 세포의 분화. 신경 줄기 세포는 신경 세포 마커 (A), astroglial 마커 GFAP (B), 및 희소 돌기 아교 세포 마커로 분화 될 수있다 O4 (C). 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
직접 주연 조혈 전구 세포로부터 신경 줄기 세포를 생성하는 상세한 프로토콜이 제공된다.
섬유 아세포에 비교하여, 인간 말초 혈액 더 접근 할 수있다. 제시된 프로토콜 이상 1 × 105 조혈 전구 세포 또는 CD34 양성 세포를 이용하여, 전혈을 10 ㎖에서 농축 될 수있다. 혈소판 오염 보통 예방하지 않지만, 용이하게, 저속 원심 분리에 의해 감소 될 수 있으며 신경 줄기 세포의 생성을 방해하지 않는다. 그러나, CD34 세포의 품질 및 개수는 신경 줄기 세포의 생산을 최종 결정한다. CD34 세포의 품질은 크게 CD34 배지에 대한 반응에 의해 판단 될 수있다. 긍정적 인 응답은 매체에 CD34 세포의 급속한 증식을 의미 이후 성공적인 변환 중요하다. CD34 세포가 상당한 손실 세포 증식, 또는 거치도록 실패한 경우, 변압기의rmation 덜 증식 세포의 결과로 어려워 질 것입니다. 따라서는 좋은 품질의 CD34 세포로 변환을 시작하는 것이 좋습니다. 1 × 105 세포가 CD34 숙련 된 연구자 충분하지만, 3 × 105 세포가 선발을 위해 사용될 수있다.
센다이 바이러스를 사용하여 비 통합, 표적 세포 (14), (15)에 전사 요인을 소개하는 매우 효율적이고 편리한 방법을 제공합니다. 원래 IPSC를 생성하는데 사용 야마나카 인자가 성공적으로 섬유 아세포 (11)로부터 직접적으로 신경 줄기 세포를 생성하기 위해 사용되었다. 제시된 프로토콜을 이용하여 이전 보고서에서 야마나카 인자 함유 센다이 바이러스는 제대혈 조혈 성인 말초 혈액 세포로부터 신경 줄기 세포를 생성하는데 사용될 수있다. 섬유 아세포를 배양을 위해 피부 조직 검사를 이용하여 비교, 피가 더 접근하고 얻을 편리합니다. 게다가, 조혈 전구 것으로 알려졌다세포는 또한 신경 줄기 세포를 생성하기위한 더 나은 선택하게 특정 신경 특이 마커 (16)를 표현한다. 사실, 센다이 바이러스 감염 후에, 부착 단층 세포의 대부분은 이후 시점에서 IPSC를 야기 할 수있다 일부 더 응집 컴팩트 콜로니 제외한 네 스틴, 신경 줄기 세포 마커를 발현. 따라서 세포의 부착은 단층 수집 더욱 널리 세포의 신경 줄기 세포의 운명을 용이하게하기 위해, 기본 신경 전구 세포 배양에 사용 된 신경 전구 세포 배지에서 배양 하였다.
신경 줄기 세포를 유지하는 정교한 균형이있다. 한편, 상기 세포가 잘 증식하는 능력을 갖는 것으로하고 가능한 여러 번 계대되도록하는 것이 바람직하다. 한편, 신경 세포로 분화 용이성도 매우 중요하다. 두 상이한 미디어는이 균형을 달성하기 위해 사용된다. 널리 사용되는 신경 전구 매체 n에 대해 선택된다eural은 첫 번째 장소에서 중요한 과정이다 세포 신원 유도 / 선택을, 줄기. 또한, 신경 세포의 분화 능력을 강화하기 위해 나중에 통로로 사용될 수있다. 신경 전구 세포 배지에 장기간 노출 크게 세포 증식을 억제하고 과도한 분화 될 수 있도록하지만, 신경 줄기 세포는 매우 약하고 민감하다. 따라서 신경 줄기 세포 배지를 세포 회복을 도와 세포 팽창을 용이하게하기 위해 사용된다. 세포가 컨 플루 언트 될 때 신경 전구 매체 통로 1 신경 유도에 사용된다. 세포 증식 및 과도한 독성 억제가 발견되면, 매체 신경줄 기세포로 초기 배지를 교체 할 필요가있다. 그러나, 신경 줄기 세포는 신경 매체 선택에 덜 효과적이며; 따라서, 특히 오버 합류 줄기 세포 또는 지연 계대 신경, 비 신경 세포 또는 신경 분화의 부족과 오염이 발생할 수와 시간 이상. 따라서 세포는 필요정기적으로 계대 할 때 60 % 이하의 합류 및 적어도 일주일에 한번. 나중에 통로는 신경 정체성을 재 확립에 신경 전구 세포 매체와 신경 선택이 가능합니다. 신경줄 기세포의 stemness에 영향을 미치는 또 다른 요인은 조직 배양 플레이트의 코팅이다. 리겔 또는 폴리 D 라이신과 코팅은 세포 replating 동안 부착하기 어려운 첫 번째 경우에 세포 부착을 할 수 있습니다. 그러나 작은 통로 숫자 코팅 결과에 장기 노출. 코팅은 세포 분화 과정을 강화하고, 해리시 세포에 더 손상을 초래할 수 있기 때문이다.
액세스 말초 혈액 샘플로부터 수득 성체 조혈 모세포에서 4 주 - 요약 된 바와 같이,이 프로토콜은 직접 (3) 내의 인간 신경 줄기 세포를 유도 야마나카 인자 함유 센다이 바이러스를 사용 하였다. 신경 줄기 세포는 신경 세포와 신경 교세포에 더 차별화 될 수있다. 이 방법은 무시길고 복잡한 IPSC 생성 프로세스는 현재 사용하고 더 특히 개별 환자 샘플에서, 특정 장애의 유전 적 차이를 나타낼 수있는 각종 신경 질환에 대한 시험관 내 세포 배양 모델에 이용 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte separation medium | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Human serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1x |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1,000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μg/ml |
References
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- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
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