Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

Published: January 28, 2015 doi: 10.3791/52298

Summary

Способ был разработан, чтобы непосредственно получить человека нервные стволовые клетки из гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенных из клеток периферической крови.

Abstract

Человек по конкретным заболеваниям нейронные культуры имеют важное значение для создания в моделях пробирке для неврологических заболеваний человека. Тем не менее, отсутствие доступа к первичной человеческой взрослых нейронных культур вызывает уникальные проблемы. Последние события в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) обеспечивает альтернативный подход для получения нейронных культур из фибробластов кожи через пациента конкретной IPSC, но этот процесс является трудоемким, требует специальных знаний и большого количества ресурсов, и может занять несколько месяцев. Это препятствует широкому применению этой технологии для изучения неврологических заболеваний. Для преодоления некоторых из этих вопросов, мы разработали метод для получения нервные стволовые клетки непосредственно из человеческого взрослых периферической крови, минуя процесс выведения IPSC. Гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенные от взрослого человека периферической крови культивировали в пробирке и трансфицировали вирусных векторов, содержащих Сендай факторы транскрипции Sox2, октябрь3/4, Klf4 и C-Myc. Результаты трансфекции в морфологических изменений в клетках, которые в дальнейшем выбранных с помощью человека среда нейронной предшественников, содержащий основной фактор роста фибробластов (bFGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Полученные клетки характеризуются выражения для нейронных маркеров стволовых клеток, таких как нестина и SOX2. Эти нервные стволовые клетки могут быть в дальнейшем дифференцирована с нейронами, астроглию и олигодендроциты в указанной среде для дифференцировки. Использование легко доступных образцов периферической крови человека, этот способ может быть использован для получения нервные стволовые клетки для дальнейшей дифференциации нервных клеток к для моделирования в пробирке неврологических расстройств и может продвинуть исследования, связанные с патогенезе и лечении этих заболеваний.

Introduction

В пробирке нейронов культуры были использованы в качестве основополагающего инструмента исследований неврологических заболеваний. Первичный животных (в основном грызунов) нейронные культуры 1, 2 и нейронные клеточные линии человека, полученные из глиомы или других опухолей наиболее часто используемый в таких исследованиях. Тем не менее, было признано, что существуют значительные различия между грызунов и клетках человека. Многие выводы, основанные на грызунах не могут быть переведены на людей. Кроме того, с быстрым развитием анализа массы геномной информации и относительно легко редактировать генов и весь секвенирование генома, тенденция становится все более и более ориентированы на обнаружение заболевания, склонные гены и разграничения их функций и роли в конкретных заболеваний, что делает несколько человеческих нейронов клеточные линии ограничивается только использованием. Теоретически, первичные нервные культуры человека, полученные из образцов пациентов нервной системы лучший выбор, но их невозможно получить; следовательно, альтернатива метОРВ необходимо. В последние годы некоторые подходы были использованы, с двумя является наиболее различимы. После развития техники генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью мыши и соматических клеток человека 3, 4, нервные клетки могут быть дополнительно отличается от них 5-7. Тем не менее, генерации и характеризующие IPSC требует интенсивного труда, методы и ввод времени, иногда даже чрезмерно. Вскоре после этого, еще один подход был разработан, чтобы преобразовать непосредственно нервных клеток из соматических клеток 8, 9. Как в результате нейроны непролиферативная, он ограничивает его применение в интенсивных исследований и скрининга лекарственных средств, что требует большого количества клеток. Для того, чтобы преимущества обеих технологий, прямой вывод нервных стволовых клеток / клеток-предшественников из соматических клеток были изучены несколько групп 10-12, который обходит утомительный процесс генерации IPSC и характеристике, но еще предоставледе приличное число нервных стволовых клеток для последующего нервной дифференциации. Ранее мы показали, что после введения транскрипционных факторов Яманака в гемопоэтических клеток-предшественников, нервные стволовые клетки могут быть непосредственно получены с использованием нейронной клетки-предшественника, выбирающий среду 13. Здесь мы сообщаем метод в деталях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Обогащение гемопоэтических клеток-предшественников из взрослых цельной крови

Примечание: гемопоэтических предшественников клетки или клетки CD34 + могут быть очищены от мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных из различных источников, включая пуповинную кровь, лейкафереза ​​материала и цельной крови с помощью методов, основанных центрифугирования в градиенте плотности. Способ перечисленные здесь использует цельную кровь в качестве примера.

  1. Выделение МНПК из цельной крови:
    1. Добавить 4,5 мл разделения лимфоцитов среды в SepMate трубки с помощью пипетки через центральное отверстие пластины.
    2. Развести пробы крови с равным объемом стерильного DPBS, содержащих 2% сыворотки человека (об / об). Например, развести 5 мл образца с 5 мл DPBS + 2% сыворотки крови человека.
    3. Добавить разведенного образца с помощью пипетки вниз сторону трубы. Будьте осторожны, не залейте образец непосредственно через центральное отверстие.
    4. Центрифуга при 1200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Осторожно снимите выше слоя ВКПМ супернатант.
    6. Соберите слой РВМС (Облачно) в новую пробирку.
    7. Добавить 15 мл Дульбекко фосфатно-солевом буфере (DPBS), содержащей 2% сыворотки человека в трубку и центрифуге при 150 х г в течение 10 мин при комнатной температуре с вынул.
    8. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 15 мл DPBS, содержащих 2% сыворотки человека. Подсчитайте количество клеток.
    9. Центрифуга при 690 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить все супернатант из трубки.
    10. Ресуспендируют клеток в 1 х 10 7 клеток на 15 мл Искова модифицированной Дульбекко среды (IMDM), содержащей 1% антибиотиков (об / об) и 10% сыворотки человека (об / об).
    11. Инкубируйте клетки O / N при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора до выделения CD34 + клеток.
  2. Положительный отбор CD34 + клеток от РВМС, используя CD34 Multisort набор:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работать быстро и использовать предварительно охлажденный решения, чтобы сделать клетки холода и предотвратить ограниченного выделенияантител на клеточной поверхности и неспецифической маркировки клеток в инструкции комплекта.
    1. Соберите все PMBCs в 50 мл пробирку и подсчитать общее количество клеток в среде.
    2. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин. Удалить все супернатант полностью.
    3. Ресуспендируют до 10 8 клеток на 300 мкл в буфере борта (DPBS, содержащих 0,5% человеческий сывороточный (объем / объем) и 2 мМ ЭДТА).
    4. Добавить 100 мкл FcR блокирующий реагент и добавить 100 мкл CD34 MultiSortMicroBeads.
    5. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 30 мин в холодильник (2 - 8 ° C).
    6. Промыть клеток путем добавления 2 мл буфера на шарик 10 8 клеток и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант полностью.
    7. Ресуспендируют до 10 8 клеток в 500 мкл буфера.
    8. Поместите колонку MACS LS в магнитном поле MACS Сепаратор и колонки подготовить промывкой 3 мл борта буфера.
    9. Применить клеточной суспензии на центрог колонны. Немеченные клетки будет течь через которые могут быть собраны при желании.
    10. Промыть колонку три раза с 3 мл буфера борта.
    11. Удалить столбец из сепаратора и поместите его на 15 мл трубки.
    12. Добавляют 5 мл буфера борта на колонку и сразу же промыть с магнитным меченых клеток путем нажатия на поршень в колонну.
    13. Добавить 20 мкл Multisort выпуска реагента на 1 мл клеточной суспензии. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 10 мин в холодильник (2 - 8 ° C).
    14. Добавить 1 - 2 мл буфера на шарик 10 7 клеток и центрифуги клетки при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант полностью.
    15. Ресуспендируют клеток в 50 мкл из бисера буфера на 10 7 клеток.
    16. Добавить 30 мкл Multisort Стоп-реагент на 10 7 клеток и инкубировать в течение 15 мин в холодильник.
    17. Добавляют 5 мл буфера борта и центрифуги клетки при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.

2. Вывод индуцированных нейронных стволовых клеток из CD34 + клеток

  1. CD34 + клетки культуры:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеприготовленный среда должна быть использована в течение 7 дней при хранении в холодильнике. Значительные потери CD34 клетки можно было наблюдать через 24 часа, но значительное увеличение числа клеток должен быть заметен, особенно после того, как день 5. Если число клеток непрерывно уменьшается или нет пролиферации, это означает, либо плохое качество среды или CD34 клеток и клеток Не следует использовать на следующей стадии.
    1. Ресуспендируют и культуры CD34 + клетки в CD34, поддерживающие среду (StemSpan SFEM среду, содержащую человеческий тромбопоэтин (TPO, 100 нг / мл), FMS-такие как тирозинкиназы 3 (Flt-3) лиганда (100 нг / мл) и фактор стволовых клеток (SCF, 100 нг / мл), интерлейкин-6 (ИЛ-6, 20 нг / мл) и интерлейкин-7 (IL-7, 20 нг / мл)) в 24-луночный планшет (до 3 × 10 5 / лунку в 1 мл среды на лунку) при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе.
    2. Мтер 24 ч, собирать плавающих клеток и центрифуги клетки при 110 мкг при комнатной температуре, чтобы избавиться от всех присоединенных клеток и клеточных обломков. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл свежей среды CD34 поддержание и семени в новом 24-луночного планшета (до 1 х 10 5 / лунку) при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе в течение 5 дополнительных дней.
    3. Замена половины среде каждый другой день, тщательно аспирации верхнюю половину супернатанта в то время как CD34 + клетки, плавающей на дне лунки (фиг.1А).
  2. Вирус Сендай трансфекции:
    1. На 5-й день, собирают клетки CD34 и центрифуги клетки при 170 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.
    2. Ресуспендируют клеток в свежей среде при 1 × 10 5 / лунку в 24-луночный планшет в 1 мл среды.
    3. Оттепель перепрограммирования комплект cytotune-IPS Сендай, сначала погружения днища труб в водяной бане при 37 ° в течение 10 сек, а затем полностью таятьт RT. Кратко центрифуги трубы и поставить их на лед. Подготовка вируса смесь Сендай путем смешивания Рекомендуемый объем каждого вируса, указанному на сертификате анализа (COA) для соответствующего лота. МВД 15 рекомендуется.
    4. Добавить вируса Сендай смесь в каждую лунку CD34 клеток. Смешайте скважин, осторожно встряхивая. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    5. Обратите внимание на эффективность трансфекции после 24 часов. Обратите внимание, что сотовые заполнители и формирование сфере индикаторы для успешной трансфекции (рис 1б).
    6. Изменить половина среды, тщательно передачи верхнюю половину среды в другую также. Если есть какие-клеточные шарики в новой скважины, добавить такое же количество свежей средой.
    7. Изменить среду каждые другой день, повторяя шаг 2.2.6.
  3. Нервные стволовые клетки индукция:
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от условий клеток, около 5 или 7 дней после трансфекции, однослойные прилипшие клетки достигнет 30 -50% слияния (рис 1С).
    1. Удалить надосадочную жидкость, содержащую плавающие клеток и сфер, а затем добавить 1 мл нейронной среде предшественника (Дульбекко в модификации Дульбекко: питательной смеси F-12 (DMEM / F12), содержащий 1x N2 добавки, 0,1% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина ( БСА), 1% (об / об) антибиотики, 20 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 20 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF)) в адгезивных клеток.
    2. При желании, диссоциируют клеточные сферы, осторожно пипеткой и центрифуги клетки при 170 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл среды нейронной предшественников в новом 24-луночного планшета, покрытого Матригель в инструкции, резервного копирования.
    3. Изменение среды каждый день до клетки достигают 60 - 80% сливной, как правило, после 1 недели.
    4. Удалите супернатант и добавить 1 мл среды нервных стволовых клеток (сыворотка среде, свободной НСК SFM). Диссоциации клеток с помощью скребка клеток с последующимочень осторожно пипеткой.
    5. Удалить клетки и семена все из них в одну лунку 6-луночного планшета с. Добавить еще 1 мл нервных стволовых клеток среды, чтобы сделать 2 мл среды для каждой скважины. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    6. Изменить среду каждые другой день.
    7. Когда клетки достигли 60% слияния, отделить и replate клеток при соотношении 1: 3, следуя инструкциям в разделе 2.3.4 и 2.3.6.
  4. Замораживание стволовых нервных клеток:
    1. Подготовка нервной стволовой клетки замораживания среды путем добавления 20% диметилсульфоксида (ДМСО) в нейронной стволовых клеток среды. Держите морозильной среду на льду.
    2. Диссоциации клеток в 6-луночный планшет с использованием скребка клеток с последующим осторожным пипетированием. Граф клеток. Центрифуга клетки при 170 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.
    3. Ресуспендируют клеток в нервные стволовые клетки среды на 1 х 10 6 / мл. Добавить такой же объем замораживания среды к клеткам.
    4. Добавить 1 мл (5 х 10 5 Всего клетки) клеток в криопробирку. Замораживание клеток с использованием замораживания контейнер Г-н FROSTER следующий инструкции.

3. нервных клеток Дифференциация

  1. Нервных клеток дифференциация:
    1. Когда нервные стволовые клетки достигают 80% слияния, снять нервные стволовые клетки с помощью резинового шпателя, а затем отделить осторожно пипеткой.
    2. Граф клеток и регулировать концентрацию до 1 х 10 5 / мл в нервные стволовые клетки среде.
    3. Для нейрональной дифференцировки, пластины клеток на поли-D-лизином / ламинина покрытием покровные стекла в 24-луночные планшеты при 1 × 10 5 / лунку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    4. Замените среду с нервной дифференциации среды (DMEM / F12, содержащей 1x N2 дополнения, 1x B27 добавки, 300 нг / мл лагеря, 0,2 мм витамин С, 10 нг / мл мозг нейротрофического фактора (BDNF) и 10 нг / мл глиальных клеток происходит нейротрофического фактора (GDNF)) AFтер 24 ч. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    5. Изменить нейронной дифференциации среду дважды в неделю в течение 2 недель.
  2. Астроглиальных дифференциация:
    1. Отделить нейронных стволовых клеток с помощью пипетки.
    2. Количество клеток и регулировать концентрацию клеток до 5 х 10 4 клеток / мл. Семенной клеток на 24-луночных планшетах. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    3. Замена среды с DMEM / F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и клетки инкубируют при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе.
    4. Изменить среднего дважды в неделю в течение 2 недель. Если клетки достигают слияния до 2 недель, replate клетки следующие шаги 3.2.1 и 3.2.2.
  3. Олигодендроцитов дифференциация:
    1. Отделить нейронных стволовых клеток с помощью пипетки.
    2. Подсчитайте клетки и семена 1 х 10 5 клеток на поли-L-орнитин покрытием 24-луночных планшетах в 1 мл олигодендроцитов differentiвания среда, состоящая из DMEM / F12, содержащей N2 добавки, 10 нг / мл тромбоцитарного фактора роста-АА (PDGF-AA), 2 нг / мл нейротрофин-3 (NT-3), 2 нг / мл звуковой ежа ( Тсс), и 3 нМ трийодтиронина (Т3). Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    3. Изменить среднего дважды в неделю в течение 2 недель.
    4. Замените среду с DMEM / F12 с 1xN2 дополнения и 3 нМ T3 и культуры клеток на одну неделю для основного белка миелина (ОБМ) производства.

4. Иммунофлуоресценции Окрашивание

  1. Замена среды с 4% параформальдегида (PFA). Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. Отменить PFA и промывают ЗФР, содержащим 0,1% Тритон Х-100 (PBS-T) 3 раза, 5 мин каждый раз.
  3. Проницаемыми клеток ФБР, содержащим 0,5% Тритон Х-100 в течение 10 мин при комнатной температуре.
  4. Блок клетки с PBS-T, содержащий 4% козьей сыворотки в течение 20 мин при комнатной температуре.
  5. Инкубируйте клетки с соответствующей первичной antiboумирает разводили в PBS-T, содержащем 0,1% БСА в течение 2 часов при комнатной температуре или O / N в холодной комнате.
  6. Промыть клетки 3 раза с PBS-T, 5 мин каждый раз. Инкубируйте клетки с соответствующими вторичными антителами в сочетании с флуорохромом с использованием 1: 400 разбавлени в PBS-T, содержащем 0,1% BSA в течение 1 часа на шейкере в темноте.
  7. Промыть клетки с PBS-T, содержащем 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в течение 10 мин при комнатной температуре.
  8. Промыть клетки еще два раза с PBS-T в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
  9. Соблюдайте меченых клеток с помощью микроскопа и сфотографироваться (Рисунок 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Качество CD34 клеток имеет решающее значение для успеха нервной трансдукции стволовых клеток. Высокое качество CD34 клетки пролиферируют в течение первых двух дней культуры и появляются как не сторонник, равномерно круглых клеток, плавающих чуть выше нижней части сосудов для культивирования (рис 1А). Успешные результаты инфекции в клеточных агрегатов, которые со временем расширятся (рис 1б), в то время как неспецифические клеточные агрегаты могут возникнуть при культивировании клеток, которые расширяют и ассоциациями свободно. Прикрепленные клетки обычно появляются от трех до пяти дней после трансфекции; они в основном биполярного и будет расти, чтобы монослоя (рис 1в). После выбора со средой клетки нервной предшественников большинство прикрепленные клетки нестин и SOX2 положительные, но OCT4 отрицательным (рисунок 2). Индуцированные стволовые нервные клетки могут быть в дальнейшем дифференцирована с нейронами и глии (рисунок 3).

ЛОР "FO: Keep-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 1
Рисунок 1. Морфологические изменения CD34 клеток после трансфекции вирус Сендай. (A) Значительное количество CD34 клеток можно наблюдать во время трансфекции. (В) Сфера как клеточных агрегатов можно наблюдать через 24 часа после трансфекции вирус Сендай, который расширяется во времени. (C) В основном биполярные адгезивные клетки появились после 5 дней трансфекции. (D и Е) Типичные морфологии нервных стволовых клеток, показаны после индукции нейронной среде предшественника и расширения. Масштабная линейка:. 200 мкм (А) и (В), 400 мкм для других Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.


Рисунок 2. Индуцированные стволовые нервные клетки экспрессируют нервные маркеры стволовых клеток. Нервные стволовые клетки выразить нестин и SOX2, но не OCT4. Масштабная линейка:. 200 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. нервных стволовых клеток дифференциации. В нервные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки с нейрональной маркера (A), астроглиального маркера GFAP (B), и олигодендроцитов маркеров О4 (С). Масштабная линейка:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Подробный протокол, чтобы непосредственно генерировать нервные стволовые клетки из периферической гемопоэтических клеток-предшественников обеспечивается.

По сравнению с фибробластов, периферической крови человека является более доступным. Использование подарил протокол, более чем 1 х 10 5 клеток кроветворной предшественников, или CD34-положительных клеток, может быть обогащен с 10 мл цельной крови. Хотя загрязнение тромбоцитов, как правило, не предотвратить, может быть легко уменьшена путем центрифугирования нижнего скорости и не мешает генерации нервных стволовых клеток. Тем не менее, качество и количество CD34 клеток будет определять конечную продукцию нервных стволовых клеток. Качество CD34 клеток может быть примерно судить по их реакции на CD34 культуральной среде. Положительный ответ означает, быстрое распространение CD34 клеток в среде, имеет решающее значение для последующего успешного преобразования. Если CD34 клетки не в пролиферации, или даже пройти значительную потерю клеток, то трансформатораия будет трудно, в результате чего меньше пролиферативных клеток. Таким образом, предлагается только начать преобразование с хорошим качеством CD34 клеток. Хотя 1 × 10 5 клеток CD34 достаточно для опытного исследователя, 3 х 10 5 клеток могут быть использованы для начала.

Использование вирус Сендай обеспечивает отсутствие интеграции, высоко эффективный и удобный способ представить факторов транскрипции в ориентированных на клетках 14, 15. Первоначально используется для генерации IPSC, Яманака факторы также были успешно использованы для создания нейронных стволовых клеток непосредственно из фибробластов 11. В одном из предыдущих сообщений с использованием представленный протокол, вирус Сендай, содержащий Yamanaka факторы также могут быть использованы для создания нервные стволовые клетки из пуповинной крови или периферической взрослых гемопоэтических клеток крови. По сравнению с использованием биопсии кожи для культивирования фибробластов, кровь является более доступным и удобным, чтобы добраться. Кроме того, он сообщил, что гемопоэтических предшественниковклетки также выражают определенные нейронные специфические маркеры 16, что делает его лучшим выбором для создания нейронных стволовых клеток. В самом деле, после того, как вирус Сендай инфекции, большинство из прилагаемых монослойных клеток выражали нестин, нейронную маркер стволовых клеток, за исключением более агрегированных компактных колоний, некоторые из которых могут повлечь за Ipsc в более поздний момент времени. Таким образом, прикреплен монослой клеток собирают и дополнительно инкубировали в нейронной среде клеток-предшественников, которые широко используются в первичной культуре нейронных клеток-предшественников, чтобы облегчить нервных стволовых клеток судьбу клетки.

Существует тонкий баланс в поддержании нервных стволовых клеток. С одной стороны, желательно, чтобы клетки, чтобы иметь возможность лучше пролиферирующую и пассировать столько раз, сколько это возможно. С другой стороны, простота их дифференциации в нейроны также имеет важное значение. Два различных средств массовой информации используются для достижения этого баланса. Широкое применение нейронной среды предшественников выбирают для NЮрал стволовых клеток идентичности индукции / выбор, который является критическим процессом в первую очередь. Он также может быть использован на последующих проходах для усиления способности нейронов дифференциации. Тем не менее, нервные стволовые клетки являются очень хрупкими и чувствительными, так что длительное воздействие нейронной среде клеток-предшественников может значительно ингибируют пролиферацию клеток и привести к чрезмерной дифференцировки. Таким образом, нервные стволовые клетки среда используется, чтобы помочь восстановлению клеток и способствовать расширению клеток. Нейронной среды предшественников используется для нейронной индукции при прохождении 1, когда клетки становятся конфлюэнтными. Если чрезмерное торможение пролиферации клеток и токсичности заметил, что необходимо заменить носитель с раннего нервных стволовых клеток среднего. Тем не менее, нервных стволовых клеток среднего является менее эффективным в нейронной отбора; Таким образом, с течением времени, особенно с более-вырожденная нервные стволовые клетки или задержка пассажи, загрязнение с не-нейронных клеток или отсутствия нервной дифференциации может произойти. Таким образом, клетки должныпассировать регулярно, когда менее чем за 60% сливной и по крайней мере один раз в неделю. Neural выбор с нервной клеток-предшественников среде можно на более поздних проходы, чтобы восстановить нервную личность. Другим фактором, который влияет на стволовости из нервных стволовых клеток является покрытие из тканевой культуры пластин. Покрытие Матригель или поли-D-лизина может помочь прикрепление клеток сначала в случае клетки трудно прикрепить во replating. Но длительное воздействие на результаты нанесения покрытий в менее числа пассажей. Это происходит потому, что покрытие усиливает процесс дифференциации клеток, и может привести к более повреждения клеток при диссоциации.

В целом, этот протокол используется вирус Сендай, содержащий Яманака факторы непосредственно вытекают человеческих нервных стволовых клеток в течение 3 - 4 недель от взрослых гемопоэтических клеток-предшественников, полученных из доступных образцов периферической крови. Нервные стволовые клетки могут быть в дальнейшем дифференцирована с нейронами и глии. Этот метод обходитдлительные и сложные процессы генерации Ipsc в настоящее время используется, и может быть использовано для моделирования в пробирке культуре клеток при различных неврологических расстройств, которые могут лучше представлять генетических различий в конкретных расстройств, особенно из отдельных образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lymphocyte separation medium Lonza 17-829E 1x
SepMate Stemcell Technologies 15415 15 ml
Human serum Invitrogen 34005-100
Antibiotics Gibco 15240-062 1%
CD34 MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-056-701
EDTA Cellgro 46-034-Cl 2 mM
MACS LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
StemSpan SFEM medium Stemcell Technologies 9650 1x
IMDM Quality Biologicals 112-035-101 1x
TPO Peprotech 300-18 100 ng/ml
Flt-3 Peprotech 300-19 100 ng/ml
SCF Peprotech 300-07 100 ng/ml
IL-6 Peprotech 200-06 20 ng/ml
IL-7 Peprotech 200-07 20 ng/ml
IPS Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A1378001
Cell scraper Sarstedt 83.183
DMSO Sigma D2650
CryoTube vials Thermo 368632
Mr. Frosty container Thermo 5100-0001
DMEM/F12 Life Technologies 12400-024 1x
N2 supplement Life Technologies 17502-048 1x
Bovine serum albumin Sigma A2934 0.1% (w/v)
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/ml
EGF Peprotech AF-100-15
B27 supplement Life Technologies 17504-044 1x
NSC serum free medium Life Technologies A1050901 1x
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips BD Bioscences 354087
cAMP Sigma A9501 300 ng/ml
Vitamin C Sigma A0278 0.2 mM
BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml
GDNF Peprotech 450-10 10 ng/ml
Poly-L-ornithine Sigma P4957 1x
PDGF-AA Peprotech 100-13A 10 ng/ml
NT-3 Peprotech 450-03 2 ng/ml
Shh Peprotech 1314-SH/CF 2 ng/ml
T3 Sigma T6397 3 nM
PFA Sigma P6148 4%
PBS Quality Biological 119-069-101 1x
Goat serum Sigma G9023 4%
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin Millipore AB5922 1:1,000 dilution
Anti-SOX2 antibody Applied Stemcell ASA0120 Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody Promega G712A 1:1,000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody Sigma G4546 1:100 dilution
Anti-O4 antibody R&D Systems MAB1326 IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody Life techniologies A11012 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody Life techniologies A11001 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Life techniologies A21042 1:250 dilution
DAPI Sigma D9542 1 μg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Tags

Биология развития выпуск 95 гемопоэтических клеток-предшественников нервные стволовые клетки кровь вирус Сендай нейрон дифференциация
Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C.More

Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C. G., Major, E. O., Medynets, M., Nath, A. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (95), e52298, doi:10.3791/52298 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter