Summary
En metod har utvecklats för att direkt härleda mänskliga neurala stamceller från hematopoetiska progenitorceller anrikade från perifera blodceller.
Abstract
Humant sjukdomsspecifika neuronala kulturer är väsentliga för att generera in vitro-modeller för mänskliga neurologiska sjukdomar. Men bristen på tillgång till primära mänskliga vuxna neurala kulturer väcker unika utmaningar. Den senaste utvecklingen i inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) ger en alternativ metod för att härleda neurala kulturer från hud fibroblaster genom patientens specifika iPSC, men denna process är arbetsintensiv, kräver särskild kompetens och stora resurser, och kan ta flera månader. Detta förhindrar den breda tillämpningen av denna teknik för studiet av neurologiska sjukdomar. För att övervinna några av dessa frågor har vi utvecklat en metod för att härleda neurala stamceller direkt från vuxen människa perifert blod, förbi härledningen processen iPSC. Hematopoetiska progenitorceller anrikade från vuxen människa perifert blod odlades in vitro och transfekterades med Sendai virusvektorer innehållande transkriptionfaktorer Sox2, Oct4/3, Klf4, och c-Myc. Transfektionen resulterar i morfologiska förändringar i cellerna som ytterligare selekteras genom användning av humana neurala progenitorceller medium innehållande basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). De resulterande cellerna kännetecknas av uttrycket för neurala stamcellsmarkörer, såsom nestin och Sox2. Dessa neurala stamceller skulle kunna ytterligare differentieras till neuroner, astroglia och oligodendrocyter i specificerade differentieringsmedia. Använda lättillgängliga humana perifera blodprover, kunde denna metod användas för att härleda neurala stamceller för ytterligare differentiering till neurala celler för in vitro modellering av neurologiska sjukdomar och kan avancera studier relaterade till patogenesen och behandling av dessa sjukdomar.
Introduction
In vitro neuronala kulturer har använts som ett grundläggande verktyg för studier av neurologiska sjukdomar. Primär djur (mestadels gnagare) neurala kulturer 1, 2 och mänskliga neurala cellinjer härledda från gliom eller andra tumörer är den vanligaste i sådana studier. Det har dock varit känt att det finns betydande skillnader mellan gnagare och mänskliga celler. Många fynd baserade på gnagare kan inte översättas till människor. Dessutom med den snabba utvecklingen inom analysera mass genetisk information och relativt lätt genen redigering och hela genomet sekvense är trenden mer och mer inriktad på att upptäcka sjukdomsbenägna gener och avgränsar deras funktioner och roller i specifika sjukdomar, vilket gör de få mänskliga neuronala cellinjer har endast begränsad användning. Teoretiskt humana primära neurala kulturer härledda från prover av patientens nervsystem är det bästa valet, men de är omöjligt att få; därmed alternativa methODS är nödvändiga. Under senare år har vissa metoder bedrivits, med två är det mest urskiljbara. Efter utvecklingen av tekniken med generera inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) med musen och mänskliga somatiska celler 3, 4, kan neurala celler ytterligare differentierad från dem 5-7. Men generera och karaktärisera iPSC kräver intensiv arbetskraft, tekniker, och tidsinmatning, ibland till och med oöverkomligt. Strax efter, en annan metod utvecklats för att direkt omvandla neuronala celler från somatiska celler 8, 9. Eftersom de resulterande neuroner är icke-proliferativa, men det begränsar dess tillämpning i intensiva studier och läkemedelsscreening, vilket kräver en stor mängd celler. För att ta fördelarna av båda teknikerna, direkt härledning av neurala stam / progenitorceller från somatiska celler har undersökts av flera grupper 10-12, vilket kringgår tråkiga processen med iPSC generering och karakterisering men fortfarande bestämdes ett anständigt antal neurala stamceller för senare neurala differentiering. Vi har tidigare visat att efter införandet av de Yamanaka transkriptionsfaktorer in i hematopoetiska progenitorceller, neurala stamceller kan genereras direkt med hjälp av en neural progenitorcell välja mediet 13. Här rapporterar vi metoden i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Anrikning av hematopoetiska progenitorceller från Adult helblod
NOT: hematopoetiska progenitorceller eller CD34 + celler kan renas från perifera mononukleära blodceller (PBMC) härledda från en mängd olika källor inklusive navelsträngsblod, leukaferes material och helblod med användning av densitetsgradientcentrifugering baserade metoder. Den metod som anges här använder helblod som ett exempel.
- Isolering av PBMC från helblod:
- Lägg 4,5 ml lymfocytseparationsmedium till SepMate röret genom att pipettera den genom det centrala hålet i insatsen.
- Späd blodprovet med en lika stor volym av sterilt DPBS innehållande 2% humant serum (v / v). Exempelvis kan utspädda 5 ml av provet med 5 ml DPBS + 2% humant serum.
- Lägg det utspädda provet genom att pipettera den nedåt i sidan av röret. Se till att inte hälla provet direkt genom det centrala hålet.
- Centrifugera vid 1200 xg under 10 min vid RT.
- Ta försiktigt bort supernatanten ovanför PMBC lagret.
- Samla PBMC skiktet (grumlig) till ett nytt rör.
- Lägg 15 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) innehållande 2% humant serum i röret och centrifugera vid 150 xg under 10 min vid RT med bromsen av.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 15 ml DPBS innehållande 2% humant serum. Räkna antalet celler.
- Centrifugera vid 690 xg under 10 min vid RT. Ta bort alla supernatanten från röret.
- Resuspendera cellerna vid en x 10 7 celler per 15 ml av Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) innehållande 1% antibiotika (volym / volym) och 10% humant serum (v / v).
- Inkubera cellerna O / N vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator innan isolera CD34 + celler.
- Positiv Val av CD34 + celler från PBMC använder CD34 Multi Kit:
OBS: Arbeta snabbt och använda färdigkylda lösningar för att göra celler kallt och förhindra takav antikroppar på cellytan och icke-specifik cellmärkning per satsen instruktion.- Samla alla PMBCs i ett 50 ml rör och räkna antalet totala celler i mediet.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min. Ta bort alla supernatanten helt.
- Resuspendera upp till 10 8 celler per 300 | il i vulsten buffert (DPBS innehållande 0,5% humant serum (v / v) och 2 mM EDTA).
- Lägg 100 pl av FcR Blocking Reagent och tillsätt 100 | il av CD34 MultiSortMicroBeads.
- Blanda väl och inkubera under 30 minuter i kylskåp (2-8 ° C).
- Tvätta cellerna genom tillsats av 2 ml av vulsten buffert per 10 8 celler och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid RT. Avlägsna supernatanten helt.
- Resuspendera upp till 10 8 celler i 500 pl buffert.
- Placera MACS LS-kolonn i magnetfältet av en MACS separator och förbereda kolonnen genom att skölja med 3 ml pärla buffert.
- Applicera cellsuspension på center av kolonnen. Omärkta celler kommer att strömma genom vilken kan uppsamlas om så önskas.
- Tvätta kolonnen tre gånger med 3 ml av vulst-buffert.
- Ta kolumnen från separatorn och placera den på en 15 ml tub.
- Tillsätt 5 ml pärla buffert på kolonnen och spola omedelbart ut magnetiskt märkta cellerna genom att trycka in kolven i kolonnen.
- Lägg 20 pl av Multi Release reagens per 1 ml cellsuspension. Blanda väl och inkubera under 10 minuter i kylskåp (2-8 ° C).
- Lägg 1-2 ml pärla buffert per 10 7 celler och centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid RT. Avlägsna supernatanten helt.
- Resuspendera cellerna i 50 | il av vulsten buffert per 10 7 celler.
- Lägg 30 pl av Multistoppreagens per 10 7 celler och inkubera under 15 minuter i kylskåp.
- Tillsätt 5 ml pärla buffert och centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid RT. Kassera supernatanten.
2. Härledning av inducerad neurala stamceller från CD34 + celler
- CD34 + celler kultur:
OBS: Nyberedd medium bör användas inom 7 dagar vid förvaring i kylskåp. Betydande CD34 celler förlust kunde observeras efter 24 timmar, men den betydande ökningen av celler bör märkas, särskilt efter dag 5. Om antalet celler minskar kontinuerligt eller finns det ingen spridning, innebär det antingen dålig kvalitet på medel eller CD34 celler och cellerna bör inte användas för nästa steg.- Resuspendera och kultur CD34 + celler i CD34 bibehållande medium (StemSpan SFEM medium innehållande humant trombopoietin (TPO, 100 ng / ml), fms-liknande tyrosinkinas 3 (Flt-3) ligand (100 ng / ml) och stamcellsfaktor (SCF, 100 ng / ml), interleukin-6 (IL-6, 20 ng / ml) och interleukin-7 (IL-7, 20 ng / ml)) i en 24-brunnars platta (upp till 3 x 10 5 / brunn i 1 ml medium per brunn) vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- After 24 timmar, samla flytande celler och centrifugera cellerna vid 110 xg vid RT för att bli av med alla anslutna celler och cellrester. Kasta bort supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml färskt CD34 upprätthålla medium och frön i en ny 24-brunnar (upp till 1 x 10 5 / brunn) vid 37 ° C under 5% CO2 inkubator under 5 ytterligare dagar.
- Ersätt hälften av mediet var den andra dagen genom att försiktigt aspirera den övre halvan av supernatanten medan CD34 + cellerna flyter på botten av brunnarna (Figur 1A).
- Sendai-virus transfektion:
- På dag 5, samla CD34 celler och centrifugera cellerna vid 170 xg under 10 min vid RT. Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i färskt medium vid 1 x 10 5 / brunn i en 24-brunnars platta i 1 ml medium.
- Tina en cytotune-iPS Sendai omprogrammering kit genom att först nedsänka bottnarna av rören i ett 37 ° C vattenbad i 10 sekunder och sedan helt tina ent RT. Centrifugera korthet rören och sätta dem på is. Förbered Sendaivirus blandningen genom att blanda den rekommenderade volymen för varje virus noterat på Analyscertifikatet (COA) för motsvarande parti. MOI 15 rekommenderas.
- Lägg Sendaivirus mix till varje brunn CD34 celler. Blanda brunnarna genom att försiktigt skaka. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Beakta transfektionseffektiviteten efter 24 tim. Observera att cellaggregat och sfär bildning är indikatorer för framgångsrik transfektion (Figur 1B).
- Ändra hälften av mediet genom att försiktigt föra den övre halvan av medium till ett annat väl. Om det finns cell sfärer i den nya brunnen, lägga till samma mängd färskt medium.
- Ändra medel varje häromdagen genom att upprepa steg 2.2.6.
- Neural stamcell induktion:
OBS: Beroende på cellförhållanden, om 5 eller 7 dagar efter transfektion, kommer monolager vidhäftande cellerna når 30 -50% konfluens (Figur 1C).- Avlägsna supernatanterna innehållande flytande celler och sfärer och sedan lägga en ml neurala progenitor-medium (Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Blandning F-12 (DMEM / F12), innehållande 1 x N2 supplement, 0,1% (vikt / volym) bovint serumalbumin ( BSA), 1% (v / v) antibiotika, 20 ng / ml av basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), och 20 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF)) i de vidhäftande cellerna.
- Eventuellt dissociera cell sfärer genom att försiktigt pipettera och centrifugera cellerna vid 170 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml neurala progenitorceller medium i en ny 24-brunnar belagd med matrigel per instruktion som back up.
- Ändra mediet varannan dag tills cellerna når 60-80% konfluenta, vanligtvis efter en vecka.
- Kasta bort supernatanten och tillsätt 1 ml av neurala stamcellmedium (serumfritt medium, NSC SFM). Dissociera cellerna med hjälp av en cell skrapa följtgenom mycket försiktig pipettering.
- Avlägsna cellerna och utsäde alla av dem i en brunn i en 6-brunnsplatta. Lägg till ytterligare 1 ml neurala stamceller medium för att göra 2 ml media för varje brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Ändra medel varje häromdagen.
- När celler nått 60% sammanflödet, dissociera och förnyad utbredning cellerna vid 1: 3 förhållandet att följa stegen i 2.3.4 och 2.3.6.
- Frysning av neurala stamceller:
- Förbered neural stamcell frysmedium genom tillsats 20% dimetylsulfoxid (DMSO) in i den neurala stamcellmedium. Håll frysmediet på is.
- Dissociera cellerna i en 6-brunnars platta med användning av cellskrapa följt genom att försiktigt pipettera. Räkna celler. Centrifugera cellerna vid 170 xg under 10 min vid RT. Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i neurala stamcellmedium vid en x 10 6 / ml. Tillsätt samma volym frysmedium till cellerna.
- Lägg 1 ml (5 x 10 5 totala celler) av celler i en cryovial. Frys cellerna med hjälp av en Mr Froster frysning container efter instruktion.
3. Neurala Celldifferentiering
- Neuronala celler differentiering:
- När neurala stamceller nå 80% sammanflödet, lossa neurala stamceller med hjälp av en gummiskrapa och sedan dissociera genom att försiktigt pipettera.
- Räkna celler och justera koncentrationen till 1 x 10 5 / ml i neurala stamcellmedium.
- För neuronal differentiering, plattan cellerna på poly-D-lysin / laminin belagda täckglas i 24-brunnars plattor vid 1 x 10 5 / brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Ersätt mediet med neurala differentieringsmedium (DMEM / F12 innehållande 1x N2 supplement, 1x B27 supplement, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM vitamin C, 10 ng / ml hjärna härledd neurotrofisk faktor (BDNF) och 10 ng / ml gliacell härledd neurotrofisk faktor (GDNF)) after 24 h. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Ändra neural differentiering mediet två gånger i veckan i 2 veckor.
- Astrogliala differentiering:
- Dissociera neurala stamceller genom pipettering.
- Räkna celler och justera cellkoncentrationen till 5 x 10 4 celler / ml. Seed cellerna på 24-brunnars plattor. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Ersätt mediet med DMEM / F12 med 10% fetalt bovint serum (FBS) och inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Ändra medel två gånger i veckan i 2 veckor. Om cellerna når sammanflödet före 2 veckor, förnyad utbredning cellerna följande steg 3.2.1 och 3.2.2.
- Oligodendrocyte differentiering:
- Dissociera neurala stamceller genom pipettering.
- Räkna celler och frön 1 x 10 5 celler på poly-L-ornitin belagda 24-brunnars plattor i 1 ml oligodendrocyt differentiation medium bestående av DMEM / F12 innehållande N2 supplement, 10 ng / ml blodplättshärledd tillväxtfaktor-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml neurotrofin-3 (NT-3), 2 ng / ml av sonic hedgehog ( Shh), och 3 nM trijodtyronin (T3). Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Ändra medel två gånger i veckan i 2 veckor.
- Ersätt mediet med DMEM / F12 med 1xN2 tillägg och 3 nM T3 och odla cellerna för ytterligare en vecka för basiskt myelinprotein (MBP) produktion.
4. immunofluorescensfärgning
- Ersätt media med 4% paraformaldehyd (PFA). Inkubera under 10 min vid RT.
- Kassera PFA och tvätta med PBS innehållande 0,1% Triton X-100 (PBS-T) 3 gånger, 5 min varje gång.
- Permeabilisera cellerna med PBS innehållande 0,5% Triton X-100 under 10 min vid RT.
- Blockera cellerna med PBS-T innehållande 4% getserum under 20 min vid RT.
- Inkubera cellerna med motsvarande primära Antibomatriser utspätt i PBS-T innehållande 0,1% BSA under 2 h vid RT eller O / N i kylrummet.
- Tvätta cellerna för tre gånger med PBS-T, 5 min varje gång. Inkubera cellerna med motsvarande sekundära antikroppar kopplade med en fluorokrom med användning 1: 400 spädning i PBS-T innehållande 0,1% BSA under 1 h på en skakanordning i mörker.
- Tvätta cellerna med PBS-T innehållande 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) under 10 min vid RT.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS-T för 5 min vardera vid RT.
- Beakta de märkta cellerna med hjälp av ett mikroskop och ta foton (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på CD34-celler är kritisk för framgången med neural stamcell transduktion. Högkvalitativa CD34 celler föröka under de första dagarna av kultur och visas som icke vidhäftande, homogent runda celler, flyter strax ovanför botten av odlingskärl (Figur 1A). De framgångsrika infektion leder cellaggregat, som expanderar över tid (Figur 1B), medan icke specifika cellaggregat kan förekomma under cellodling, som expanderar och de associationer är lösa. Vidhäftande celler visas vanligtvis runt tre till fem dagar efter transfektion; de är oftast bipolär och kommer föröka göra monolager (Figur 1C). Efter ett urval med neural stamceller mediet flesta vidhäftande cellerna är nestin och Sox2 positiv men Oct4 negativ (Figur 2). De inducerade neurala stamceller kan vara ytterligare differentierad till neuroner och glia (Figur 3).
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1. Morfologiska förändringar av CD34 celler efter Sendaivirus transfektion. (A) Betydande antal CD34 celler kan observeras vid transfektion. (B) Sphere som cellaggregat kan observeras 24 timmar efter Sendaivirus transfektion som expanderar under tiden. (C) Mestadels bipolära vidhäftande celler dök efter 5 dagars transfektion. (D och E) Typiska morfologier neurala stamceller visas efter induktion med neurala progenitor-medium och expansion. Skala bar:. 200 nm för (A) och (B), 400 nm för de andra Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Inducerad neurala stamceller uttrycker neurala stamceller markörer. Neurala stamceller uttrycker nestin och Sox2 men inte Oct4. Skala bar:. 200 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. neurala stamceller differentiering. De neurala stamceller kan differentieras till celler med neuronal markör (A), astrogliala markör GFAP (B), och oligodendrocyt markörer O4 (C). Skala bar:. 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En detaljerad protokoll för att direkt generera neurala stamceller från perifera hematopoetiska progenitorceller tillhandahålls.
Jämfört med fibroblastceller, är mer tillgänglig humant perifert blod. Använda presenterade protokollet, mer än 1 x 10 5 hematopoietiska progenitorceller, eller CD34-positiva celler, kan anrikas från 10 ml helblod. Även förorening med trombocyter är oftast inte förebyggas, kan det vara lätt minskas med lägre hastighet centrifugering och det stör inte neurala stamceller generation. Dock kommer kvaliteten och antalet CD34 celler bestämmer slutproduktion av neurala stamceller. Kvaliteten på CD34-celler kan grovt bedömas efter deras svar på CD34 odlingsmedium. Ett positivt svar, vilket innebär snabba spridningen av CD34-celler i mediet, är kritisk för senare framgångsrik omvandling. Om CD34-celler inte föröka, eller ens genomgå betydande cellförlust, då Transformation blir svår, vilket resulterar i mindre proliferativa celler. Sålunda är det föreslås att endast starta transformation med god kvalitet CD34 celler. Även 1 x 10 5 CD34-celler är tillräckligt för en erfaren forskare får 3 x 10 5 celler används till att börja.
Använda Sendaivirus ger en icke-integration, högeffektiv och bekvämt sätt att introducera transkriptionsfaktorer i inriktnings cellerna 14, 15. Ursprungligen användes för att generera iPSC ades Yamanaka faktorer också framgångsrikt använts för att generera neurala stamceller direkt från fibroblaster 11. I en tidigare rapport med den presenterade protokollet, kunde Sendaivirus innehåller Yamanaka faktorer också användas för att generera neurala stamceller från navelsträngsblod eller vuxna perifera hematopoetiska blodkroppar. Jämfört med att använda hudbiopsi för odling fibroblaster, är mer tillgänglig och bekvämt att få blod. Dessutom rapporteras det att hematopoetisk stamfaderceller uttrycker också vissa neurala specifika markörer 16, vilket gör det till ett bättre val för att generera neurala stamceller. Faktum är att efter Sendaivirus infektion, de flesta av de bifogade enkelskikts celler uttryckte nestin, en neural stamcell markör, förutom de mer aggregerade kompakta kolonier, av vilka några kan ge upphov till iPSC vid en senare tidpunkt. Således den bifogade monolager av celler samlas och ytterligare inkuberas i neurala stamceller medium, som har använts i stor utsträckning vid primär neurala stamceller kultur, för att underlätta den neurala stamceller öde cellerna.
Det är en känslig balans att upprätthålla de neurala stamceller. Å ena sidan, är det föredraget att cellerna att ha bättre prolifererande förmåga och att passe så många gånger som möjligt. Å andra sidan, är också kritisk lättheten att differentiera dem till neuroner. Två olika medier används för att uppnå denna balans. Den flitigt neurala progenitorceller mediet väljs för nEURAL stamcellsidentitets induktion / urval, vilket är den kritiska processen i första hand. Den kan också användas vid senare passager för att förstärka de neuronala differentieringskapacitet. Men de neurala stamceller är mycket bräcklig och känslig så att långvarig exponering för neurala stamceller mediet kan hämma kraftigt celltillväxt och resultera i överdriven differentiering. Neurala stamcellmedium används således för att hjälpa cellåterhämtning och för att underlätta cellexpansion. Den neurala progenitorceller medium används för neural induktion vid passage 1, när cellerna blir konfluenta. Om överdriven hämning av cellproliferation och toxicitet är märkt, är det nödvändigt att ersätta mediet tidigt med neurala stamceller medel. Dock är mindre effektiva i neurala val neurala stamceller medium; sålunda med tiden, särskilt med över-konfluenta neurala stamceller eller fördröjd passaging, kunde kontaminering med icke-neurala celler eller avsaknad av neural differentiering uppträder. Sålunda cellerna behöverpasse regelbundet, när mindre än 60% sammanflytande och minst en gång i veckan. Neural urval med neurala stamceller medium är möjligt vid senare passager för att återupprätta den neurala identitet. En annan faktor som påverkar stemness av de neurala stamceller är beläggning av vävnadsodlingsplattor. Beläggning med Matrigel eller poly-D-lysin kan hjälpa cellvidhäftning vid först i fall cellerna är svåra att fästa under omstryka. Men långvarig exponering för beläggnings ger mindre passagenummer. Detta beror på att beläggningen förbättrar celldifferentieringsprocessen, och kan resultera i mer skada på cellerna under dissociation.
Som en sammanfattning, detta protokoll som används Sendaivirus innehåller Yamanaka faktorer att direkt härleda mänskliga neurala stamceller inom 3 - 4 veckor från vuxna hematopoetiska progenitorceller erhållna från tillgängliga perifera blodprover. De neurala stamceller kan vara ytterligare differentierad till nervceller och glia. Denna metod kringgårde långa och komplicerade IPSC generationens processer som för närvarande används och kan användas för in vitro-cellodling modellering av olika neurologiska sjukdomar, som bättre kan representera de genetiska skillnaderna i särskilda störningar, speciellt från enskilda patientprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte separation medium | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Human serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1x |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1,000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μg/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
