Abstract
Blant andre patofysiologiske endringer, kronisk eksponering for sigarettrøyk fører til betennelse og immunsuppresjon, som har vært knyttet til økt mottakelighet av røykere til mikrobielle infeksjoner og svulstforekomsten. Ex vivo undertrykkelse av reseptor-mediert immunresponser i humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) behandlet med røyk bestanddeler er en attraktiv tilnærming for å studere mekanismer og vurdere sannsynlige langtidseffekter av eksponering for tobakksvarer. Her, vi optimalisert metoder for å utføre ex vivo-tester ved hjelp av PBMC stimulert av bakteriell lipopolysakkarid, en Toll-like receptor-4 ligand. Effektene av hel røyk kondisjonerte medium (WS-CM), ble et brennbart tobakksprodukt forberedelse (TPP), og nikotin undersøkt på cytokinsekresjon og målcellen dreping av PBMC i ex vivo-analyser. Vi viser at utskilte cytokiner IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 og IL-8 og intracellulære cytokiner IFN47 ;, TNF-α, og MIP-1α ble undertrykt i WS-CM-eksponerte PBMC. Den cytolytiske funksjon av effektor PBMC, som bestemt ved en K562 target celledrepende assay ble også redusert ved eksponering for WS-CM; nikotin var minimal effektiv i disse analysene. Som en oppsummering presenterer vi et sett med forbedrede analyser for å evaluere effektene av TPPS i ex vivo-analyser, og disse metoder kan lett tilpasses for testing av andre produkter av interesse.
Introduction
En betydelig mengde kunnskap poeng til negative helseeffekter av kronisk sigarettrøyking, inkludert kardiovaskulær sykdom (CVD), kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) og kreft 1,2. Kronisk sigarettrøyking har vært kjent for å forårsake betennelse og immunsuppresjon, og disse endringene er rapportert å bidra til økt risiko for mikrobiell infeksjon og kreft hos røykere tre. In vitro og ex vivo teknikker er nyttige i å belyse den molekylære grunnlaget for de patofysiologiske effektene av sigarettrøyk 4-9 (tabell 1), og er anerkjent som viktige verktøy for guiding den nye reguleringen av ulike tobakksprodukter 10,11.
For eksempel har vi vist at brenn tobakk produkt preparater (TPPS) som helhet røyk kondisjonerte medium (WS-CM) og partikler (TPM) er langt mer cytotoksiske og skadelig forDNA enn ikke-brennbare TPPS eller nikotin 12,13. Konsistent med det publiserte arbeidet, ble det nylig rapportert at brenn TPPS eller nikotin 12,13. Konsistent med det publiserte arbeidet, vi nylig rapportert at brenn TPPS forårsaket markert immunsuppresjon. Dette ble dokumentert av undertrykkelse av Toll- like receptor (TLR) -ligands, stimulert cytokinsekresjon, og målrettet celle (K562) drept av PBMC i en ex vivo modell 14. Gitt viktigheten av inflammasjon sigarettrøk-induserte sykdomsprosesser, er ytterligere optimalisering av de analysebetingelser for å vurdere immunmodulerende effekter av sigarettrøyk presentert i denne rapport.
Den ex vivo-analyser vanligvis målt intracellulær og utskilt cytokiner, så vel som den cytolytiske funksjon av cytotoksiske T- og NK-celler i K562 celledrepende analysene 14. Analysene involvert pre-inkubering med WS-CM og nikotin og påfølgende stimulering av PBMCs med TLR agonister over en periode på 3 dager; den endelige avlesninger er utført ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og / eller strømningscytometri. Vi benyttet bakteriell lipopolysakkarid (LPS), som binder til TLR-4-reseptorer og stimulerer PBMC som resulterer i produksjonen av intracellulære cytokiner og utskillelse av cytokiner. I tillegg til optimalisering av de forskjellige analysefremgangsmåten for å vurdere immunmodulerende effekter av TPPS vi dessuten foreliggende fremgangsmåter for isolering av PBMC, celledødsanalyser, og IL-8-kvantifisering. Disse metodene kan brukes til å ta opp andre problemstillinger og videreutviklet for å evaluere tobakksvarer i reguleringssammenheng.
Tabell 1. Publisert rapporter om in vitro og ex vivo metoder som brukes for å studere varilus patofysiologiske effekter av tobakk produkt forberedelser CS, sigarettrøyk medium.; CSC, sigarettrøyk kondensat; CSE, sigarettrøyk pakke; ELISA, enzymbundet immunosorbent assay; GADPH, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase; qPCR, kvantitativ polymerasekjedereaksjon; RT, sanntid kvantitativ polymerasekjedereaksjon; TS, tobakksrøyk.
| Forfatter (år av studien) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Celler brukes | Menneskelige bronkial endotel celler (BEAS-2B), menneskelige nøytrofile | Menneskelige alveolære epitelceller (A549) | Menneskelige luftveis glatte muskelceller (HASMC) | Menneskelige premonocyttisk U937 celler, humane monocytter | Alveolære type II epitelceller (ATII) | Menneskelig monocyttiskcellelinje (THP-1), humane lungemakrofager |
| TPP brukt | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Metode brukt | ELISA, qPCR, migrasjon, electro skift | Immunohisto-kjemi, elektroforese, Arrayscan kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforese | Gel-mobilitet skift | Lysmikroskopi, elektronmikroskopi, elektroforese, ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate kit (Sigma), p65 plate analysen (Transam), elektroforese, ulike immunologiske kits |
| Mål | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, migrering | Histone acetyltransferases, histone deacetylases, NF-kB, IL-8, pI kB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin | Varme sjokk / stressproteiner (HSP / Hsp70), HF transkripsjonsfaktor, NF-kB,TNF-α | Overflateaktivt protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK-fosforylering, cJUN: DNA-binding, glutation, p65: DNA-bindende |
| Sluttresultatet | CSE nedregulerer cytokinproduksjon via undertrykkelse av AP-1-aktivering. | H 2 O 2 og CSC forbedre acetylering av histonproteiner, redusere histondeacetylase aktivitet, differensielt regulere proinflammatoriske cytokiner utgivelse. | Sigarettrøyk kan forårsake frigjøring av IL-8 fra HASMC, forsterkes av TNF-α, 20% CSE mindre IL-8-frigjøring, inhibering av eotaksin og RANTES av sigarettrøyk. | TS HF aktivert transkripsjonsfaktor, noe som var forbundet med Hsp70 overekspresjon og hemming av NFkB-bindende aktivitet og TNF-α frigjøring. | Redusert ATII celle-stammer chemokin nivåer kompromiss AlveoLar reparasjon, noe som bidrar til sigarettrøyk-indusert alveolar skade og emfysem. | Data gir mekanistisk forklaring på hvorfor røykere har økt luftveisinfeksjoner. Undertrykkelse av den iboende respons er ledsaget av en økning i IL-8. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: skriftlig informert samtykke til å gjøre denne studien ble innhentet på en lokal klinisk forskning enhet under IRB-godkjennelse, per god klinisk praksis. Prosessering av blod, er isolering av PBMC og andre eksperimenter cellekultur utføres under sterile forhold, ved hjelp av mikrobiologisk sterilt utstyr og reagenser.
1. WS-CM Forberedelse
- Generer WS-CM som tidligere beskrevet 12.
- Forberede WS-CM ved å føre røyk fra fire 3R4F referanse sigaretter gjennom Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium uten fenol rød ved hjelp av følgende røyke diett: 35-60-2, puff volum i ml, puff intervall i sekunder, og puff varighet i sek, henholdsvis. Hvert preparat genererer en 20 ml prøve.
- Etikett tube (s) med dato, klokkeslett fullført, og sigarett navn og nummer. Lagre 500 mL alikvoter ved -80 ° C umiddelbart etter røyking er fullført.
- Analysere prøver av frosne WS-cm Å bestemme nivåer av nikotin, tobakks spesifikke nitrosaminer, og polysykliske aromatiske hydrokarboner, som tidligere beskrevet 12.
2. Isolering av PBMC
- Samle friskt blod fra friske donorer (som er ikke-forbrukere av tobakksvarer) Isoler PBMC fra friskt blod som beskrevet nedenfor under en egen godkjenning fra Wake Forest Baptist Health IRB 15.
- Før ankomsten av blodpose, har en 500 ml flaske, saks, isolasjonsbuffer og Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) (RT) som er ferdig i en biosikkerhet trinn 2 (BSL-2) cellekultur hette. Isolasjon buffer må beskyttes mot lys.
- Hold blodposen opp ned og kutte røret rett under der den har blitt klemt fast forlate minst 3 cm av slangen.
- Fjern hetten fra 500 ml flaske og hold røret over flaskeåpningen. Plukke opp blodposen og snu det slik at blodet å strømme fritt fra posen i tHan flaske inntil posen er tom. Tillate blod å strømme inn på innsiden av veggen av flasken i forhold til rett ned for å unngå å skape bobler.
- Hell isoleringsbuffer inn i flasken ved et 1: 5-forhold på isolasjonsbuffer til blod. Cap flasken godt og forsiktig snu det, end-over-ende, 10 ganger. La flasken i hetten cellekultur inkuberes med lys av, i 1 time ved RT.
- En lett, strå-farget lag vil bygge opp over blod. Fjern dette laget ved hjelp av en 25 ml serologisk pipette til 50 ml koniske rør. De innsamlede beløpet kan variere 50-300 ml, avhengig av motivet som har donert blod.
- Sentrifugere rørene ved 200 xg i 10 min ved RT.
- Aspirer gjennomskinnelig supernatant, slik at den mørke blodfarget pellet. Pelleten vil være løs, men tyktflytende.
- Pipetter 3 ml isolasjon buffer i 15 ml koniske rør.
- Til resuspender pellet, tilsett 20 ml DPBS for hver 50 ml strå-farget væske som samles i sTep 2.1.5. Vortex å bland godt, og konsolidere den resuspendert væske fra flere rør. Denne væsken inneholder suspenderte blodlegemer.
- Med en overføring pipette, overføring 5 ml av de suspenderte blodlegemer inn 3 ml isoleringsbuffer i trinn 2.1.8. Vipp 15 ml konisk rør som inneholder cellesuspensjonen sakte og forsiktig for å opprette to separate lag. Sentrifugere rørene ved 400 xg i 40 min ved RT med minimal akselerasjon og uten brems.
- Bruke en overførings pipette for å fjerne den resulterende uklare midtre lag (buffy coat) inneholdende PBMC i et 50 ml konisk rør. Unngå å trekke andre klare lag under det. Overfør ikke mer enn 25 ml i hver 50 ml konisk rør.
- Legg 25 ml kaldt rennende buffer (eller mer for å fylle hele gjenværende volum av 50 ml konisk rør) for å vaske cellene. Sentrifuger cellene ved 400 x g i 10 min ved 4 ° C.
- Resuspender pelleten med 10 ml buffer. Dette inneholder PBMC. Telle cellene og bruke imbart eller legg på is for frysing.
3. frysing og tining PBMC
- Sentrifuger PBMC som ble innsamlet i trinn 2.1.13 i 10 minutter ved 400 x g.
- Fyll frysing container med isopropylalkohol per produsentens instruksjoner. FORSIKTIG: Isopropanol er brannfarlig og akutt giftig.
- Resuspender pelleten med RPMI 1640-medium (4 ° C) inneholdende 20% føtalt bovint serum (FBS) og 10% dimetylsulfoksid (DMSO). Dette er RPMI 1640-frysemedium. Resuspender pelleten med en mengde av frysemedium som vil resultere i en suspensjon med omtrent 5 x 10 7 celler / ml. Antall celler som er tilgjengelige for frysing vil variere.
- Dispensere 1 ml deler av cellesuspensjonen i 2 ml cryotubes og plassere cryotubes i frysebeholderen. Plasser frysing container med cryotubes i en fryser ved -80 ° C for å lagre O / N og deretter fjerne cryotubes og overføre til å lagre i etkryogenisk fryser mellom -150 ° C til -190 ° C.
- Fjern det kryorør fra kryogen lagring og tine det raskt med forsiktig omrøring i et vannbad ved 37 ° C.
- Umiddelbart overfører de tinte PBMC i kryorør inn i et 15 ml konisk rør med 10 ml RPMI 1640 komplett medium (4 ° C) inneholdende 10% FBS, 1% Pen / Strep og 1% L-glutamin. Innholdet i tint kryorør skal overføres så snart som mulig for å oppnå maksimal cellelevedyktighet 15.
- Sentrifuger PBMCer ved 400 xg i 10 min.
- Resuspender pelleten med 5 ml RPMI 1640 komplett medium og telle cellene.
- Måle cellenes levedyktighet av etablerte metoder slik som trypanblått-eksklusjon metode. Vanligvis cellenes levedyktighet med denne metoden er omtrent 90-95%. PBMC er nå klar til bruk i eksperimenter.
4. Cell Død Fastsettelse
MERK: Fortynninger oppført her er for hensikten med denne study. Fortynningene kan endres tilsvarende.
- Fortynn WS-CM eller nikotin i en 96-brønns plate ved anvendelse av RPMI komplett medium til et totalt volum på 100 ul / brønn, som angitt nedenfor.
- Fortynn WS-CM til de følgende konsentrasjoner: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, og 5 pg / ml med lik nikotin enheter (basert på nikotininnholdet i WS-CM) 12.
- Fortynn nikotin i RPMI-medium til de følgende konsentrasjoner: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 og 3000 pg / ml. FORSIKTIG: Nikotin er akutt giftig og miljøfarlig.
- Tilsett 100 ul av PBMC suspendert i RPMI komplett medium til hver brønn i en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / brønn. Det totale volum av celler pluss WS-CM eller nikotin blir 200 pl / brønn.
- For formålet med denne studien fremstille to sett av plater som ovenfor. Dekk platene og inkuberes en plate i 24 timer, og en plate i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Juster tidspunkter som er nødvendig. Vask cellene ved RT ved sentrifugering ved 300 x g i 3 minutter, aspirering av supernatanten, virvling bunnen av platen med platen dekket og til slutt resuspenderes cellene med 200 ul iskald buffer, og gjenta vasketrinnet en gang til.
- Legg 95 pl rennende buffer, etterfulgt av 5 pl av 7-Aminoactinomycin D (7AAD) til hver brønn for et totalvolum på 100 ul / brønn. Platen inkuberes i mørke ved RT i 15 min.
- Tilsett 100 mL av buffer til klase rør. Overfør hele volumet av cellesuspensjonen fra hver brønn av platen til klynge rør og skaffe prøvene på strømningscytometer.
- Bestemme prosentandelen 7AAD-positive celler ved bruk av strømningscytometri-analyse-programvare.
5. EC 50 Fastsettelse
- De EC 50 verdier av WS-CM og nikotin er bestemt av 7AAD-positiv farging av PBMC.
- EC 50-verdien er definert som den konsentration ved hvilken 50% av cellene ikke lenger var levedyktig i en 24-timers analyse, og verdiene er uttrykt som ug equi-nikotin-enheter / ml.
- Ved anvendelse av denne undersøkelsen ble EC50-verdier bestemt til å være 1,56 ug / ml og 1,650 ug / ml for WS-CM og nikotin, respektivt.
6. Utskilte Cytokiner
MERK: Fortynninger oppført her er for formålet med denne studien. Fortynningene kan justeres tilsvarende.
- Fortynn WS-CM i en 96-brønns plate ved anvendelse av RPMI komplett medium til et totalt volum på 100 ul / brønn i en konsentrasjon på 0,3, 1,56, 3 og 5 ug / ml med lik nikotin enheter.
- Fortynn nikotin til de følgende konsentrasjoner: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 og 3000 mikrogram / ml. FORSIKTIG: Nikotin er akutt giftig og miljøfarlig.
- Tilsett 100 ul av PBMC suspendert i RPMI komplett medium til hver brønn i en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / brønn.Det totale volum av celler pluss WS-CM eller nikotin blir 200 pl / brønn.
- Dekk plate og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask cellene ved RT ved sentrifugering ved 300 x g i 3 minutter, aspirering av supernatanten, virvling bunnen av platen med platen dekkes og endelig susp cellene med 200 ul iskald buffer, og å gjenta vasketrinnet en gang til.
- Tilsett 200 ul av RPMI komplett medium, og gjenta vasketrinnet en gang til.
- Tilsett 200 ul av 10 ug / ml LPS medium til hver brønn.
- Dekk plate og inkuberes i 4 timer, 24 timer, 48 timer eller 72 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Juster inkuberingstider som nødvendig.
- Sentrifuger plate ved 300 x g i 3 min.
- Ta 175 mL av supernatant fra hver brønn og i fryser ved -80 ° C til å utføre analysene i trinn 7 og 8.
7. cytometrisk Bead Array Assay
<ol>8. IL-8 ELISA
- Tine cellesupernatanter fra trinnet 6.10, og anvendelse i IL-8-ELISA. Utfør ELISA-analysen i henhold til produsentens anvisninger.
9. Intracellulær Farging og flowcytometrisystemer
MERK: Fortynninger oppført her er for formålet med denne studien. Fortynningene kan justeres tilsvarende.
- Fortynn WS-CM i en 96-brønns plate ved anvendelse av RPMI komplett medium til et totalt volum på 100 ul / brønn i en konsentrasjon på 0,3, 1,56, 3 og 5 ug / ml med lik nikotin enheter.
- I samme plate, fortynnes nikotin til de følgende konsentrasjoner: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 og 4000 pg / ml. FORSIKTIG: Nikotin er akutt giftig og miljø hazarDous.
- Tilsett 100 ul av PBMC suspendert i RPMI komplett medium i en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / brønn. Det totale volum av celler pluss WS-CM eller nikotin blir 200 pl / brønn.
- Dekker platen og inkuber i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask cellene ved RT ved sentrifugering ved 300 x g i 3 minutter, aspirering av supernatanten, virvling bunnen av platen med platen dekket og til slutt resuspenderes cellene med 200 ul iskald buffer, og gjenta vasketrinnet en gang til.
- Tilsett 200 ul av RPMI komplett medium til platen, og gjenta vasketrinnet en gang til.
- Forberede arbeids konsentrasjoner på 2 ul / ml GolgiPlug og 10 ug / ml LPS ved å bruke RPMI komplett medium og tilsett 200 ul til hver brønn.
- Inkuber platen i 6 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Ved slutten av trinn 9.8, vaskes cellene med rennende buffer (4 ° C), og roterer med 300x g i 3 min ved 4 ° C.
- Tilsett 100 ul av Cytofix til hver brønn og inkuber i 20 min ved 4 ° C.
- Vask cellene tre ganger som beskrevet i trinn 9.9 med 1x Permwash (4 ° C) ved 300 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
- Legg 45 ul av 1 x Cytoperm til hver brønn etterfulgt av 5 pl av hver av en av de følgende antistoffer i hver brønn: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Inkuber ved 4 ° C i 30 min.
- Vask cellene to ganger som beskrevet i trinn 9.9 med 1x Permwash (4 ° C) og en gang med rennende buffer (4 ° C) ved 300 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender cellene med 200 ul av 2% paraformaldehyd (4 ° C). Overfør cellene til 12 × 75 mm rør, og analysere prøvene på flowcytometeret. FORSIKTIG: Paraformaldehyde er etsende, akutt giftig og helseskadelig.
10. K562 Killing analysen
MERK: K562 celler bør dyrkesi kultur ved 37 ° C og 5% CO2 med RPMI komplett medium inntil de når 80% konfluens før analysen.
- Forberede en 5 mM karboksyfluorescens succinimidylester (CFSE) lager løsning ved å legge til 18 mL av DMSO til hetteglasset.
- Fortynn WS-CM eller nikotin i en 96-brønns plate ved anvendelse av RPMI komplett medium til et totalt volum på 100 ul / brønn for å oppnå de ønskede med lik nikotin enheter eller nikotinkonsentrasjoner for hver brønn. FORSIKTIG: Nikotin er akutt giftig og miljøfarlig.
- Tilsett 100 ul av PBMC i RPMI komplett medium i en konsentrasjon på 1,5 x 10 6 celler / brønn. Det totale volumet av cellene med WS-CM eller nikotin blir 200 pl / brønn.
- Dekker platen og inkuber i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask K562-celler ved tilsetning av 10 ml DPBS og sentrifuger ved 400 x g i 8 min ved RT.
- Resuspender cellene med 10 ml DPBS og telle K562-celler.
- Forberede CFSE working løsning ved å tilsette en ul av CFSE stamløsning til 1 ml DPBS.
- Tilsett 1 ml av CFSE arbeidsløsning i 1 ml av K562 cellesuspensjon inneholdende 1 - 2 x 10 7 celler. Vortex og inkuberes nøyaktig i 2 min ved RT.
- Umiddelbart legge 200 mL av FBS. Vortex og inkuberes nøyaktig i 2 min ved RT.
- Tilsett 10 ml RPMI komplett medium, og sentrifuger røret ved 400 x g i 8 min ved RT.
- Fjern det RPMI supernatanten og bryte pelleten og resuspender cellene med 10 ml RPMI komplett medium og telle CFSE-merket K562-celler.
- Vask PBMC ved sentrifugering av platen ved 300 x g i 3 min ved RT. Aspirere supernatanten ved dekantering av væsken. Sett på lokket og virvle bunnen av tallerkenen. Tilsett 200 ul av RPMI komplett medium og gjenta vasketrinnet en gang til.
- Legg CFSE-merket K562-celler i et forhold på 1:15 (100000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) til hver prøve brønn av PBMC plate og videre incubate i 5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask celleblanding ved sentrifugering ved 300 x g i 3 min ved RT. Aspirer supernatanten ved å forkaste væsken. Plassere lokket og virvle i bunnen av platen.
- Tilsett 200 pl rennende buffer og gjenta vasketrinnet som er beskrevet i trinn 10.14 én gang.
- Legg 95 pl rennende buffer, etterfulgt av 5 pl av 7AAD til hver brønn i et totalt volum på 100 ul / brønn. Platen inkuberes i mørke ved RT i 15 min.
- Tilsett 100 ul av buffer til hver brønn og overføre hele volumet av cellesuspensjonen fra hver brønn av platen til klynge rør og skaffe prøvene på strømningscytometer.
- Bestemme prosentandelen 7AAD-positive og CFSE-positive celler ved bruk av strømningscytometri-analyse-programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (fire donorprøver). Den T-test mellom behandlede og ubehandlede kontrollprøver ble utført ved hjelp av Excel programvare samt t-test sammenligninger for alle behandlinger med deres tilsvarende kontroller. Statistisk signifikans ble indikert av: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
For å måle effekten av eksponering for WS-CM og nikotin, ble PBMC ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av WS-CM og nikotin i 3 timer eller 24 timer. Celledød ble målt ved hjelp av robuste og pålitelige 7AAD fargingsmetode, som 7AAD skytes inn i dobbelt-trådede nukleinsyrer og kan trenge gjennom cellemembraner av døende eller døde celler 16. En doseavhengig økning i celle-død ble observert med WS-CM i 24 timer, med en nær 80% celle detekteres ved 4 ug / ml med lik nikotin enheter (figur 1A) død. En tilsvarende grad av celledød varbemerket bare på 3000 ug / ml nikotin (figur 1B). Siden vi utsettes PBMC i 3 timer med WS-CM og nikotin for å vurdere effekten av cytokininduksjon og evne til å drepe målceller, var det nødvendig å bestemme hvorvidt WS-CM forårsaker betydelig cytotoksisitet etter 3 timers behandling. PBMC ble behandlet med 5 pg / ml med lik nikotin enheter av WS-CM opplever ikke signifikant toksisitet (<5%, Figur 1A). Behandling med nikotin i 3 timer forårsaket målbar (8%) celledød bare på 2000 ug / ml (figur 1B). Dermed eksponering for WS-CM eller nikotin på de angitte doser og behandlingsperioder ikke forårsake betydelig cytotoksisitet under eksperimentelle forhold.
For å måle de immunmodulerende effekter, ble PBMC stimulert med LPS for forskjellige tidsperioder, og de utskilte cytokiner ble målt ved CBA-analysen. For å optimalisere LPS stimulering tid, utsettes vi PBMC til LPS stimulering for 4 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer, og utskilte cytokiner ble målt. For eksempel LPS stimulering i 24 timer ga maksimal sekresjon av cytokiner IL-6 og IL-8 (figur 2), og lengre tidsperioder ga ingen ytterligere økning (IL-6) eller en lavere (IL-8) i cytokin sekresjon. Lignende resultater ble oppnådd med andre utskilte cytokiner som IL-10, IL-1β og TNF-α (data ikke vist).
Pilot tidsforløpet eksperimenter antydet at maksimal produksjon av cytokiner i respons til TLR-4 stimulering med LPS skjer ved 24 timer, og dermed ble det utskilte cytokiner målt ved 24 timer i alle etterfølgende eksperimenter. Behandling med WS-CM og nikotin, etterfulgt av stimulering av TLR-4-reseptor med LPS, resulterte i en doseavhengig reduksjon av utskilte cytokiner (figur 3). Behandling med WS-CM resulterte i betydelig reduksjon av IFN-γ (figur 3A), TNF (figur 3B), IL-10 (figur 3C </ Strong>) og IL-6 (figur 3D) ved lave Equi-nikotin enheter (1,56 ug / ml). Undertrykkelse av cytokiner var også tydelig med nikotin. Imidlertid undertrykkelse av cytokiner med nikotin oppstått ved betydelig høyere doser, og graden av undertrykkelse variert mellom individuelle cytokiner. For eksempel IFN-γ syntes å være signifikant undertrykt med nikotin ved 50 ug / ml, mens IL-6 ble undertrykt ved den høyeste konsentrasjon (4 mg / ml) som ble testet (Figurie 3D). Deretter målte vi IL-8 nivåer i de samme prøver ved å bruke en ELISA-analyse. IL-8 sekresjon ble effektivt undertrykt i WS-CM-eksponerte PBMC; mens nikotin s suppressive effektene var signifikant ved 2 mg / ml (figur 4).
De intracellulære nivåer av cytokiner ble kvantifisert i WS-CM- og nikotin-behandlede celler ved stimulering med LPS. Tidligere har vi stimulert PBMC i 3 dager og tilsatt Golgiplug under de siste 6 timer av inkubasjon for å måleintracellulære cytokiner 14. Vi har nå betydelig redusert inkubasjonsperioden ved å kombinere stimulering med LPS og Golgi pluggen til totalt 6 timer og målt intracellulære cytokin-positive celler (figur 5). Figur 5 viser en doseavhengig prosent reduksjon i IFN-γ-positive celler ( Figur 5A), TNF-α-positive celler (Figur 5B) i både nikotin og WS-CM- eksponert PBMC, mens en doseavhengig reduksjon i prosent MIP-1α-positive celler (figur 5C) ble observert i WS-CM -exposed PBMCer. I denne analysen ble det observert en reduksjon i antall intracellulære cytokin-positive celler etter eksponering for WS-CM ved lavere Equi-nikotin enheter (1,56 ug / ml). Både utskilt cytokin og intracellulære cytokin-analyser viste lignende resultater med hensyn til IFN-γ nivåer eller IFN-γ-positive celler.
Som et funksjonelt mål, evne til WS-CM- og nikotinbehandlede PBMC å drepe målet K562 celler ble bestemt. Figur 6A viser representative strømningscytometriske rådata om 7AAD-positiv farging av target (CFSE-merket K562) celle dreping av kontroll, WS-CM-eksponert, og nikotin behandlet PBMC. Tallene i boksen representerer prosent 7AAD-positive CFSE merkede K562 celler. Eksponering til 1,56 ug / ml WS-CM reduserte signifikant dreping evne effektorceller i PBMC sammenlignet med kontroll og de lavere doser. Nikotin behandling ved lave og høye doser ikke interferere med celledreping. Figur 6B viser en doseavhengig reduksjon i prosent K562 celledrepende fra flere givere i et enkelt eksperiment.
Figur 1. Celledød av PBMC etter eksponering for økende konsentrasjoner av med lik nikotin enheter av WS-CM (ug / ml) og nikotin (ug / ml). (A) og med nikotin i 3 timer og 24 timer (B). Celledød ble målt ved 7AAD farging. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SD feilfelt av fire givere fra et representativt eksperiment. Den statistiske signifikans er angitt ved: * P <0,05; ** P <0,005, *** p <0,0005.
Figur 2. Sekresjon av IL-6 og IL-8 av PBMC stimulert med LPS ved ulike tidspunkt. PBMC ble stimulert med LPS i 4 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer. Nivåer av IL-6 og IL-8 cytokiner i cellekultursupernatanter ble fastsatt ved bruk av menneskelige inflammatoriske cytokin Kit (CBA kit) og flowcytometri. Disse data representerer middelverdi ± SD feilfelt fra en av de to uavhengige eksperimenter ved hjelp av PBMC fra tre forskjellige givere. Den statistiske significance er angitt ved: * P <0,05; ** P <0.005.
Figur 3. Reduksjon av cytokin sekresjon av PBMC ble behandlet med økende konsentrasjoner av med lik nikotin enheter av WS-CM (ug / ml) og nikotin (ug / ml) etter LPS-stimulering. PBMC ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av WS-CM og nikotin i 3 timer og stimulert med LPS i 24 timer. Nivåer av IFN-γ (A), ble TNF (B) IL-10 (C), og IL-6 (d) cytokiner i cellekultur-supernatantene bestemmes ved bruk av en Th1 / Th2 CBA-analysen og flowcytometri. Disse data representerer middelverdi ± SD feilfelt fra en av de tre uavhengige eksperimenter ved hjelp av PBMC fra fire forskjellige givere. Den statistiske signifikans er angitt ved: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Høyere con trasjoner av WS-CM var også statistisk signifikant med *** P <0,0005.
Figur 4. Demping av IL-8-sekresjon med PBMC ble behandlet med økende konsentrasjoner av med lik nikotin enheter av WS-CM (ug / ml) og nikotin (ug / ml) etter LPS-stimulering. PBMC ble utsatt for WS-CM og nikotin stimulert med LPS i 24 timer, og utskilt IL-8 ble målt ved hjelp av ELISA. Disse data representerer middelverdi ± SD feilfelt fra en av de tre uavhengige eksperimenter ved hjelp av PBMC fra fire forskjellige givere. Den statistiske signifikans er angitt ved: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Høyere konsentrasjoner av WS-CM var også statistisk signifikant med *** P <0,0005.
.jpg "/>
Figur 5. Reduksjon av intracellulære cytokin-positive celler i PBMC ble behandlet med økende konsentrasjoner av med lik nikotin enheter av WS-CM (ug / ml) og nikotin (ug / ml). PBMC ble utsatt for varierende konsentrasjoner av WS-CM og nikotin i 3 timer og stimulert med LPS og Golgiplug i 6 timer. Bilen kontroll for WS-CM og nikotin var RPMI komplett medium. Intracellulær IFN-γ-positive (A), TNF-α-positive (B), og MIP-1α-positive (C) celler ble kvantifisert ved flowcytometri. Disse data representerer middelverdi ± SD feilfelt fra en av de fire uavhengige eksperimenter ved hjelp av PBMC fra fire forskjellige givere. Den statistiske signifikans er angitt ved: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Høyere konsentrasjoner av WS-CM var også statistisk signifikant med *** P <0,0005.
Figur 6. Reduksjon av PBMC target drepe evne med eksponering for økende konsentrasjoner av med lik nikotin enheter av WS-CM (ug / ml) og nikotin (ug / ml). PBMC ble behandlet med den angitte konsentrasjon av WS-CM og nikotin for tre time, og CFSE-merket K562-celler ble deretter tilsatt som målceller og inkubert i ytterligere 5 timer. Celler ble farget med 7AAD og flowcytometri ble brukt til å måle drepe evne. Figur 6A viser representative flowcytometri resultater med prosent drapet vist i gated bokser. Pilen indikerer redusert prosent drap i 1,56 mikrogram / ml utsatt WS-CM. Figur 6B viser representative gjennomsnitt ± SD feilfelt fra fire uavhengige eksperimenter med PBMC fra fire forskjellige givere. Den statistiske signifikans er angitt ved: ** P <0,005; *** P <0,0005. Høyere konsentrasjoner av WS-CM var også statistisk signifikant with *** P <0,0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi og andre har tidligere vist at behandling av PBMC med TPPS undertrykker flere responser, inkludert ekspresjon og sekresjon av cytokiner og funksjonelle tiltak som target celledrepende 14. De eksperimentelle metodene beskrevet i tidligere arbeid krever lengre inkubasjonsperioder og var beskjeden i størrelse 14. Gitt den potensielle anvendelser av denne attraktive ex vivo modell for grunnforskning og anvendt forskning, undersøkte vi om noen av analyseparametere i disse flertrinns biologiske analyser kunne optimaliseres. Her presenterer vi forenklet metoder for å måle TLR-mediert immunrespons ved bruk av en TPP-behandlet ex vivo PBMC modell.
Isolasjon av levedyktige PBMC-er en viktig forutsetning for disse ex vivo-analyser. Gitt den individuelle variabilitet og fysiologiske status på potensielle donorer, er det enkelt å få tak i PBMC som er responsive. For formålet med denne studien, vi isolered PBMC fra generelt friske voksne personer ved hjelp av en tidligere utgitt metode 15. Videre i denne studien for å redusere variabiliteten blant givere, vi ekskludert de med allergier, infeksjoner, eller som ble tatt noen resepter eller over skranke medisiner som aspirin. Dessuten er isolering av PBMC fra ferskt blod oppsamlet ønskelig, da det sikrer optimal levedyktighet og funksjon av cellene i de påfølgende eksperimenter.
Tidligere metoder benyttes stimulering med TLR agonister for 67-72 timer for å måle intracellulære cytokiner og skilles cytokiner 14. En tids løpet av cytokinsekresjon i TLR-stimulerte celler (under kontroll forhold uten WS-CM eller nikotin) foreslo at maksimal sekresjon skjedde ved 24-timers. Videre kombineres vi inkubasjon med TLR-agonister og Golgiplug, og reduserte tiden for inkubasjon i totalt 6 timer for å måle intracellulære cytokiner. Mens dette kreves en egen analyse for å målecytokin-positive celler, dataene er mer robust i forhold til den forrige metoden 14. Konsistent med tidligere resultater, WS-CM sterkt undertrykt induksjon av intracellulære og utskilt cytokiner. Således er disse modifikasjoner ført til vesentlig redusert analysetider og ga svært lignende resultater som de som er beskrevet i litteraturen. Selv om vi har benyttet strømningscytometri og ELISA-metoder for å evaluere cytokin-nivåer, kan andre teknikker slik som sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) også benyttes som en komplementær teknikk.
Historisk målrette celle dreping av effektor PBMC benyttes radiomerket metoder (f.eks 51 Cr-release assay). Den metode som er beskrevet i denne rapporten eliminerer bruken av radioaktivitet og anvender loading celler med et fluorescerende fargestoff hvis tilstedeværelse kan bli målt ved flowcytometri. En annen fordel med den beskrevne fremgangsmåten heri, er at det er relativt rask og kan være ADAPTEd til high-throughput analyser. Etter inkubasjonstiden for mål- og effektorcellene er 5 timer, kan denne analysen bli gjennomført i 8 timer. Dette i kontrast til andre publiserte fremgangsmåter, som er mer involvert som de krever isolering av undertyper av PBMC og aktivering / stimulering over en periode på flere dager, eller analyse av NK-celle og K562-celle konjugater for å overvåke cytotoksisitet 17,18. En annen fordel med den aktuelle fremgangsmåten er at den bruker cryopreserved PBMC direkte som effektorceller, noe som gir større fleksibilitet.
I sammendrag, beskrev vi flere analyser for å bestemme effekten av TLR-mediert immunrespons hos brenn TPP-behandlede PBMC, som lett kan anvendes for testing av forskjellige forbindelser. Bruken av cryopreserved komponenter tillater betydelig fleksibilitet, og sammen med etablerte teknikker som flowcytometri, CBA-analyser, og ELISA, robuste og stabile resultater kan oppnås hurtig på tvers av forskjellige laboratorieoratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet er finansiert av RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) under et forskningssamarbeid avtale med Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad er en fulltids ansatt i RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
