Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Yetiştirme Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52412
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology and Infection Research, University of Edinburgh, 2Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research

Summary

Heligmosomoides polygyrus yakından yüksek yaygın insan helmint enfeksiyonu benzeyen güçlü bağışıklık yetenekleri ile bir kemirgen nematod olduğunu. Burada H. uzun vadeli bakım için bir protokol tarif polygyrus yaşam döngüsü.

Abstract

Heligmosomoides polygyrus (eski Nematospiroides dubius olarak bilinen ve H. bakeri gibi bazı olarak adlandırılır) yakın farelerde kronik enfeksiyona neden birçok bağışıklık düzenleyici mekanizmalar kullandığı ve bir mide-bağırsak helmint yaygın insan helmint enfeksiyonları karışabilirler. H. polygyrus helmint türevli bağışıklık düzenleme alanında yaygın olarak incelenmiş ve potansiyel olarak (aktif enfeksiyon ve izole salgılanan ürünler ile her ikisi de), alerji ve otoimmün deneysel modeller bastırmak için tespit edilmiştir. Bu yazıda anlatılan protokol H. yönetimini özetliyor kendi boşaltım-salgı ürünleri (HES) tutarlı L3 larva üretimi, yetişkin parazitler kurtarma ve toplama için polygyrus yaşam döngüsü.

Introduction

Heligmosomoides polygyrus yakın yüksek yaygın insan nematod parazit 1 ile ilişkili olan doğal faregiller mide-bağırsak kurtları olup. Örneğin Nippostrongylus brasiliensis, H. gibi diğer nematod modellerinin tersine polygyrus sürekli o ana bağışıklık yanıtı 2 bastırmak için kullandığı çok güçlü bir bağışıklık mekanizmalarının doğrudan bir sonucu olarak farelerde kronik enfeksiyon oluşturur.

H polygyrus doğrudan ömrü vardır: enfeksiyon L3 larva FECO ağız iletimi ile alınan (veya laboratuvar ortamında oral gavaj yoluyla uygulanmıştır) vardır, bunlar bağırsak lümenine geri dönmeden önce duodenum ve kese içine almak ve subserozal katmana göç bunun Yaklaşık sekiz gün ilk enfeksiyondan sonra erişkin solucanlar. Çiftleşme ve yumurta üretimi günde 10 ile gerçekleşir ve dekara gelen boşaltım-salgı ürünlerinin kültür ve toplama için erişkin solucanlar hasat etmek mümkündüry 14 itibaren 3. H. polygyrus da enfekte duyarlı farelerde 4-6, ve H seviyeleri, artmış Laktobasillerin ile ortakçı mikroflora ile, bu etkileşim Lactobacilli 6 farelerin maruz kaldıktan sonra polygyrus enfeksiyonu.

H. Aktif enfeksiyonu polygyrus otoimmünite 7-10 birçok hayvan modellerinde immunopatolojilerinde karşı korumak için gösterilmiştir, 11,12 ve alerji 13-16 kolit. Dolayısıyla bu parazitten Boşaltım-Salgı moleküllerin potansiyel büyük ilgi olmuştur ("HES") in vivo 17,18 patoloji aşağı-modüle. Nitekim, koruyucu etkileri artık 18,20 tespit ediliyor yollar aracılığıyla HES ürünleri 19 ile farelerin tedavisi sonrasında görülür. İşte biz onun salgılanan ürünlerin güvenilir Heligmosomoides polygyrus üretimi ve kurtarma için bir protokol açıklarBu başka fonksiyonel biyokimyasal ve immünolojik araştırmaların bir dizi için kullanılabilir.

Protocol

NOT: Bu protokol tüm işlemler Birleşik Krallık Home Office ve Edinburgh Veteriner Hizmetleri Üniversitesi tarafından belirlenen esaslara uygun olarak yapılır.

Gavaj yoluyla 1. Farelerin enfeksiyonu

  1. Altı aya kadar 4 ° C için damıtılmış su içinde mağazası Heligmosomoides polygyrus L3 larva.
  2. Kullanmadan önce, damıtılmış su içinde L3 larva üç kez yıkayın: santrifüj (fren) 10 dakika boyunca 300 x g'de, tüm su ancak 500 ul çıkarın (rahatsız edici pelet L3 larva önlemek için) ve pelet, her zaman yeniden süspanse edin.
  3. Üçüncü yıkama için, kendi deliği genişletmek için 200 ul ucu kesilmiş tam bir hacimde (tipik olarak 40 mi) ve aspirasyon 20 ul su ilave edilir. (Mobil, ve en iyi bir mikroskop ile 50X büyütme altında inceledi genellikle) 60 mm kültür çanak yüzeyinde iki 20 ul örnekleri yerleştirin ve L3 larva sayısı. Bir concentratio için damıtılmış su içinde nihai pelet yeniden süspanseml başına 2,000 L3 larvaları n.
  4. Yaşam döngüsü üretimi için, 400 H. 8 haftalık F1 (C57BL / 6xCBA) fareleri enfekte oral gavaj yoluyla damıtılmış su, 200 ul polygyrus L3 larvalarına (Boynun ense göre dik olarak fareler sınırlayacağı ve yavaşça mideye ağızdan ve yemek borusundan küt gavaj iğnesi). Çalkalayın, her enfeksiyon (larvalar suda hızlı yerleşmek) ve aspirat 1 ml şırınga 200 ul önce iyice; yuvarlak uçlu özel bir sonda iğne kullanın. Genç farelerde deneysel enfeksiyon (6-8 hafta) veya diğer doğal suşları (örneğin, C57BL / 6 veya Balbc) için, 200 L3 larva ile enfekte fareler.

2. Yayılım ve H. Bakım polygyrus

  1. Büyük bir plastik küvet merkezinde kömür yerleştirin ve soğuk musluk suyu 30 dakika en az üzerinde çalışmasına izin (yıkanmamış aktif kömür L3 larvalarına karşı toksiktir). Küvet suyu boşaltın ve t kömür yerleştirinTamamen kuruyana kadar oda havaya maruz kalacak şekilde, emici kağıt tabakaları, wo.
  2. Yumurta gerekiyorsa (gerekirse ve makas), ilk forseps ile kolonun dışına dışkı kazımak. L3 larva sayıda gerekli ise, bir tel ızgara üzerinde fareler yerleştirin ve bir kaç gün içinde fekal pelet toplar.
  3. Sadece kağıt filtre yapışmak için yeterince nemli bir kıvam elde etmek için, 1: en az bir 1 oranında granüle edilmiş mangal kömürü ile dışkı karıştırın. Bir petri bazı nemli filtre kağıdının ortasına ince bir tabaka smear ve nemli kutuda bu koyun 12-14 gün süreyle karanlıkta (bazı nemli kağıt havlu ve su bir tabak eklemek).
  4. Itibaren günde 7 den L3 larvaları çıkarın ve kağıt atılır önce en az iki vesilelerle onları toplamak. Larvalar filtre kağıdı kenarı etrafında bir halka oluştururlar; petri üzerinden filtre kağıdı kaldırarak ve 50 ml'lik bir tüp içine (bir pipet ve plaka başına steril su 5 ml kullanılarak) levhanın kalan larva yıkayın.
  5. Asansörve filtre kağıdı kapalı kalan larvalar 50 ml tüp içine damıtılmış su ile tabağın sol hasat. 10 dakika için 300 xg'de atık çözüm santrifüjleyin. Damıtılmış su ile larva üç kez yıkayın ve gerekli olana değin daha sonra damıtılmış su içinde 50 ml 4 ° C'de saklayın.
    NOT: Larva canlı kalır ve en az 6 ay süreyle enfektif.

Yetişkin H. 3. Koleksiyonu polygyrus Worms

  1. Şekil 1'de gösterildiği gibi önceden değiştirilmiş Baermann Aparatı hazırlayın.
  2. On dört gün sonra enfeksiyon itlaf fareler.
  3. % 70 etanol ile karın yıkayın. Karın üzerindeki deriyi kesin ve karın ön duvarı ortaya çıkarmak için geri çekin. Periton boşluğuna girmek için orta hat kesi olun.
  4. (Distal rektum proksimal duodenum itibaren) tüm küçük ve büyük bağırsak çıkarın. Kuru Petri kabı içine yerleştirin.
  5. Onun bütün uzunluğu boyunca gut Düzelt; dışkı içeren kolon tüketim; Daha sonra yumurta hazırlıkları için ayrı bir çanak içine bu yerleştirin.
  6. Nedeniyle içi lümen solucanlar duodenum ve genellikle kırmızı görünüm nispeten kalın bir duvar ile -identified erişkin solucanlar içeren ince bağırsağın proksimal 20 cm eksize edin. Hanks çözeltisi, 5 ml ile (100 mm'lik çap) Petri kabı içine yerleştirin, 37 ° C (tabak başına iki örnek) ısıtıldı.
  7. Makas (yuvarlak uçlu makas bunun için en iyi) ile uzunlamasına solucan dolu proksimal bağırsak bölümünü açın ve solucanları kaldırmak için iki cam slaytlar ile astar bağırsak içinde aşağı kazımak. Sonra temiz bağırsak duvarını atın.
  8. Küçük müsli çanta içine ucu solucanlar, zımba kapalı ve cam huni (Şekil 1) kenarında Ataç ile sabitleyin.
  9. Hanks 'Çözüm ile huni doldurun ve her huni içine solucanlar yaklaşık 4 Petri kapları ekleyin.
  10. 1-2 saat boyunca 37 ° C inkübatör içinde bir yer cihaz, hafifçe yarı yoldan ajite çıkarmak içinmuslin filtresi occlude bağırsak hazırlık enkaz. Muslin çanta dışında enkaz dökülmesini önlemek için özen - bu son HES hazırlık kontaminasyona neden olur. Yetişkin solucanlar yavaş yavaş muslin kumaş ile göç ve cam test tüpünün dibinde yerleşmiş olmalıdır. Dikkatle (bu noktada solucanlar kaybetmemek için dikkat) lavabonun üzerinde bağlantı kauçuk hortum test tüpü ayırın.
  11. Bir plastik pipet kullanarak, bir 50 ml tüp içine solucanlar aktarmak ve yıkama altı kez Hanks ile 'Çözüm (solucanlar bir stripette ile medya, yerçekimi ile yerleşmek kaldırmak için izin eklemek Hanks 40 ml' Çözüm ve beş kez tekrarlayın).
    Not: solucan kültürü Bu noktadan itibaren, steril tutulmalıdır.
    1. Bir laminar akış çeker taşı ve 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin, in vitro kültür için hazır ile takviye edilmiş steril Hanks çözeltisi içinde altı defa yıkanır.
  12. Saymakonun açıklığı genişletmek için sarı ucu kesilmiş alınmış 20 ul iki numune alarak kurtarıldı erişkin solucanlar; aşılanmış larva miktarı yaklaşık% 50 bekliyoruz.

Orta Hazırlanması, Yetişkin Worms Yıkama: 4. HES için Kültürleri Kurma

  1. RPMI yaklaşık 10 ml 3.11 solucanlar emmek solucanlar tamamen kapalı sağlamak için bir açıyla boru dinlenme bırakarak, 20 dakika boyunca% 10 Gentamisin ile takviye edilmiştir.
  2. Bir laminar akış başlığı içinde bu yapın: Hanks çözeltisi ile altı kez yıkama (5 U ile takviye / ml penisilin ve 5 ug / ml streptomisin).
  3. H. hazırlayın polygrus ortam.
  4. , 11.1 mi,% 45 glükoz (nihai konsantrasyon RPMI-1640,% 0.2 glukoz içeren 1.2%), 100 x Peniclllin-Streptomisin (nihai konsantrasyon, 5 U / ml penisilin, 5 ml ilave edin, 500 RPMI1640 ml, bir laminar akış başlığı içinde steriliteyi korumaya 5 ug / ml streptomisin), L-glutamin, 5 ml (nihai konsantrasyon 2 nM), veGentamisin 5 ml (nihai konsantrasyon% 1). FCS katmayın.
  5. Bacalı T25 şişeler içine kısım solucanlar, yakl. 15 mi H. 1000 solucanlar polygyrus şişe başına ortam, ve 37 ° C inkübatör (% 5 CO2) 3 hafta boyunca dik bir yer.

HES 5. hazırlanması

  1. Kültür 24 saat sonra ilk koleksiyonunu bir kenara bırakarak, haftada iki kez daha daha uzun aralıklarla kültürlerinden kültür ortamı HES içeren toplayın (LPS nedeniyle kirlenme ve ev sahibi proteinlerin yüksek düzeyde - ayrı ayrı işlenir veya atılabilir). Ayrı ve açıkça tarih ve seri numarası ile etiketlenmiş her koleksiyonu tutun. H. eşit hacimde yerine Her vesileyle polygyrus medya.
  2. Santrifüj 5 dakika boyunca 400 x g 'daki ortamı HES-ihtiva etmektedir. Daha sonra 50 ml tüpler içinde 0.2 mikron düşük-protein bağlayıcı filtre ile sterilize filtre edin. -20 ° C derin dondurucuda saklayın açıkça HES c solucan hasat tarihi ve tarih ile etiketlenmişollection.
  3. Kültürden HES toplama 21 gün sonra, solucanlar atın.
  4. (Genellikle dondurulmuş stoktan ve ilk 24 saat toplama dahil olmak üzere) ve azot basıncı altında, ultrafiltrasyon cihazında 3000 MWCO filtre üzerinde konsantre HES yüzer Havuz 500-1000 mi.
    NOT: Filtre çalışma kuruması için çok dikkatli olun.
    1. Filtre cihazı kurmak ilk karıştırma iken 3 x 20 dakika boyunca distile su ile 1 litrelik beher aşağı 3 kDa membran parlak tarafı yıkamak için. Filtre membran parlak tarafı yukarı üreticinin talimatlarına göre ultrafiltrasyon cihazı monte edin. 4 ° C 'de kabin içinde yeri ve bir araya toplanmış HES konsantre başlamadan önce damıtılmış su, 50 ml geçmektedir.
    2. Hacmi 2-5 ml'ye kadar konsantre edildi kadar (gün başına 100-140 mL) gerektiği gibi süzme cihazına HES her tüp ekleyin.
  5. PYR 50 ml HES-ihtiva eden kültür ortamından kirleri çıkarmak eklemek içinve PBS filtrasyon cihazına ve ogen-özgür sonra yaklaşık 2 ml kadar konsantre. İki kez bu adımı (toplam PBS 150 mi) tekrar edin. Bir laminar akış başlığı içinde bir 15 ml tüp (0.2 um filtre ile) filtre ile steril olarak HES aktarın ve bir spektrofotometre (= 10 e 280) ya da Bradford tahlili ile kullanılarak protein konsantrasyonları ölçülür.
  6. Kısım, -80 ° C'de parti numarası ve tarih, ve dondurma ile etiket.
  7. Kullanımdan önce HES her parti üzerine, üreticinin protokollerine uygun olarak, bir kromojenik olan LAL değerlendirmesinin kullanılması yapın. LPS seviyelerinin 1 ug protein başına 1 u, LPS daha büyük ise, in vivo deneyler için ya da in vitro kültürlerde bu serisi ile düşünün.
  8. Ayrı ayrı, aynı şekilde 24 saat sonra toplanan HES Proses; uygun olmayan fonksiyonel deneyler için, bu monoklonal antikor, afinite temizliği yolu ile izole edilebilir tek tek moleküllerin bir yararlı bir kaynak olduğunu da bunun, LPS ve bir ev sahibi proteinleri ihtiva edecektir.

Representative Results

H. ile enfeksiyona Duyarlılık polygyrus fare türüne (Tablo 1) 'deki genetik arka tarafından daha büyük bir dereceye kadar kontrol edilir; C57BL / 6 ve FMA fareler 21,22 derece hassastır. Parazitin yaşam döngüsünün bakımı için, bu iki suşları arasındaki F1 hibrit ya ebeveyn zorlanma göre morbidite (aşırı bağırsak epitel hasar olmadan) çok daha yüksek solucan yükünü dayanma kabiliyeti için seçilmiştir. 400 L3 larva oral gavaj genellikle homozigot kendilenmiş suşları deneyler (örneğin, C57BL / 6 için kullanılan 200 L3 larva bir doz iken, (Şekil 2'de gösterilen, yetişkin kurt yükü ile sonuçlanan) F1 farelerde ömrünü korumak için kullanılır veya Balbc). Ancak, bu dozaj, bağırsak florasında varyasyonları gibi hayvan olanakları arasında farklılık çevresel ko-faktörlere bağlı olarak azaltılabilir gerekebilir.

HES Partiler tekrarlanabilir effi kanıtlanmıştırfonksiyonel deneylerde ve protein bileşimi içinde etkinlik gösterir; Kültür her bir ardışık hafta süpernatanlar 4 haftalık toplam kadar, analiz edildiğinde, ayrıca, söz konusu protein profilleri (Şekil 3) Hes konsantrasyonu Bradford tahlili ile ölçüldüğünde. (5.5) çok benzer olduğu tespit edildi, toplam Protein, genellikle yaklaşık olarak 1 mg / ml idi (Şekil 4).

HES konsantre alternatif bir yöntem, numunelerin, tampon tuzlar ve düşük molekül ağırlıklı bileşenlerin çıkarılması, dışarı salınan bir rotor santrifüj içinde 4000 g hızında döndürüldü edildiği bir santrifüjlü yoğunlaştırıcı (örneğin, Vivaspin 3 kDa kesme zarı), ile. Santrifüj konsantrasyonu en küçük işlem hacimleri (1-10 mi) için uygun olan ve yaklaşık 30x maksimum konsantrasyon faktörü ile sınırlıdır.

HES toplarken, kirlenmesinin önlenmesi önemlidir. Ev sahibi molekülleri ile kirlenmesini önlemek için, biz HES-cont atmakFare bağırsak yetişkin solucan hasattan sonra ilk 24 saat kültür ortamı, geri kalan. Ayrıca, bir Kromojenik LAL deneyi (5.7) ile HES her parti LPS kirlenme seviyesini ölçmek. LPS 1 U ~ 100 pg LPS eşittir ve bu aşağıda seviyeleri 23 önemsiz kabul edilir. Bizim ellerde, HES çoğu toplu bu sınırın altına önemli ölçüde, 0.23 U / mg olarak HES LPS ortalama konsantrasyonu (Şekil 5) vardır. patoloji in vivo modellerde LPS etkileri (örneğin, astım yanıtların baskılanması) LPS 23, en az 10 ng gerektirir. Bu nedenle 100 ug LPS / ug Hes bir partiden 5 ug HES vivo uygulama içinde 500 ug LPS, çok altında LPS bir sorun haline gelir etkili konsantrasyonu içerir.

Şekil 1,
Şekil 1: Baermann Aparatı BaerYetişkin H. toplanması için mann Aparatı kurulum polygyrus (bölüm 2'de tarif edildiği gibi).

Şekil 2,
Şekil 2: 14 Gün 400 L3 Larva Ortalama solucanı Enfeksiyon sonra ortalama Worm Yükü 14 gün 400 L3 larvaları ile enfeksiyondan sonra attırır. Gösterilen veri noktaları C57BL / 6xCBA farelerin enfeksiyon 19 ayrı mermi vardır. ± SEM gösterilir idi.

Şekil 3,
Şekil 3: kültürün birbirini hafta toplanan HES proteinlerinin Kültür SDS-PAGE profilinde Ardışık Hafta itibaren HES Protein Profilleri.

Şekil 4,
Şekil 4: 500 ml ES-İçeren kültür yüzer yaklaşık 500 ml türetilen 11 farklı partilerden HES proteinin Medya Verim gelen HES Final Miktarı. ± SEM gösterilir idi.

Şekil 5,
Şekil 5: Limulus ameobocyte deneyi ile ölçülen HES 41 toplu LPS kirlenme HES Düzeylerinin LPS kirlenmesi. Medyan LPS konsantrasyonu = HES 86 U başına mg.

Şekil 6,
Şekil 6: H. Hareketli şematik HES izolasyonuna larva ve erişkin solucanlar kurtarma yoluyla L3 larva oral sonda, anahtar yaşam döngüsü aşamaları polygyrus Yaşam Döngüsü Özeti.


Şekil 7: HES ve İşlevleri HES içinde bulunan çözünebilir aracıların ve eksozom Anahtar bağışıklık etkileri Animasyon şematik.

Genotip (ve arka plan suşu) Birincil Enfeksiyon Fenotip Referans
Doğuştan suşlar
A / J, FMA, C3H Son derece duyarlı 22,29
C57BL / 6 ve C57BL / 10 Duyarlı 22,30
BALB / c, DBA / 2, 129 / J Orta 22,31
NIH, SJL, SWR Düşük duyarlılık 22,32
Sitokinler veya sitokin reseptörleri için transgenik
IL-1β - / - Daha duyarlı 33
İL-1 R - / - Daha az duyarlı (a) '; Hiçbir duyarlılıkta bir değişiklik ancak artan granülomlar (b) (A) 33
(B) 34
IL-2Rβ transjenik (C57BL / 6) Dayanıklı 35
IL-4, - / - Yüksek doğurganlık 36
IL-4R - / - (C57BL / 6 ya da Balb / c) Son derece duyarlı 22
IL-6, - / - (BALB / c ya da C57BL / 6) Son derece dayanıklı 37
, IL-9 Transjenik(FVB) Dayanıklı 38
IL-21R - / - (C57BL / 6) Eksik Th2 granülom gormation azalma 39,40
IL-25 - / - (BALB / c) Daha duyarlı 33
IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) Duyarlılıkta değişiklik yok 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) Yüksek Th1, artan hassasiyet 41,42
T hücre markörleri için transgenik
CD28 - / - (BALB / c) Marjinal yüksek doğurganlık 43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) Yüksek doğurganlık 44
OX40L - / - (BALB / c) Yüksek doğurganlık &# 160; 45
Doğuştan gelen bağışıklık lokusların transgenik
Tip 1 interferon reseptörü (IFNAR), - / - (C57BL / 6) Yüksek doğurganlık, daha fazla granülomlar 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) Daha dayanıklı, daha granülomlar 34
Cı-KitW / WV (WBB6) Daha duyarlı 46,47

Tablo 1: H. primer enfeksiyonlar genetik olarak farklı ve gen hedeflenen fare soylarında polygyrus.

Discussion

H. yaşam döngüsü güvenilir bir şekilde tutarlı bir şekilde polygyrus ilerler. Doğal sindirim ya da günde 0 L3 larva oral gavaj sonra, kist 10. günden bağırsak lümenine solucanların ortaya çıkan daha sonra larva moults kadar ilerleyen ve 5. günde, duodenal zarı altına oluşmaya başlar, yumurta dışkıların görülebilir 14. günde ve 21. günde granülomlar, yukarıda tarif edilen (ve Şekil 6'da özetlenmektedir) protokolü duodenumunda serozasında görebilir H., yüksek verimli üretimi için izin verir Gelecekteki deneysel ve yaşam döngüsü enfeksiyonları için canlı L3 larva güvenilir kurtarma ek polygyrus boşaltım-salgı ürünleri (HES),.

H. polygyrus enfeksiyonu OVA veya Der p 1 (Ev tozu akarı alerjen) 14 bağlıdır, astım modellerinde koruyucu olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, hava yolu inflamasyonu baskılama CD4 + CD25 + ile transfer edilebilir 14 veya CD19 + CD23 hi düzenleyici B hücreleri 24, H., sigara duyarlı polygyrus fareler ile enfekte. Otoimmünite, H. modellerinde polygyrus enfeksiyonu multipl skleroz 9 deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modeli baskılayıcı olduğu gösterilmiştir, ve bastırma enfekte olmuş fareler, 24 CD4 + T hücreleri veya CD19 + B hücreleri ya ile aktarılabilir.

Stimülasyondan 25 dendritik hücre tepkisinin) inhibisyonu CD4 b) indüksiyonu: Heligmosomoides polygyrus boşaltım salgılama ürünleri (HES), dahil olmak üzere, bağışıklık tepkisini modüle eden ve (Şekil 7 'de tarif edilmektedir) bir dizi mekanizma ile Th2 aracılı inflamasyonun baskılanması + Foxp3 + düzenleyici T hücreleri 18. c) IL-33 üretiminin 20 engellenebilir. Bir tatbik edildiğinde HES koruyucu olduğu gösterilmiştirt hassaslaşması ya da meydan astım 19 OVA-şap modelinde ve ayrıca erken IL-33 salınımının baskılanması yoluyla, Alternaria özü alerjen 20 ile burundan verildiğinde. HES LPS kirlenmesinin önlenmesi genellikle gelecekteki immünolojik deneyler başarısı için çok önemlidir. Burada özetlenen protokolde, bu ulaşmada kritik adımlar (2.10) ve kültürünün ilk 24 saat kenara ES çözümü ayarlamak için nihai HES hazırlık girmiyor Baermann Aparatı müsli çanta içinde bulunan o enkaz sağlamak için vardır (5.1 bakınız).

Son yıllarda, HES iyice 26,27 belirlenen 370 üzerinde farklı proteinler ile proteomik düzeyde karakterize edilmiştir. Buna ek olarak, 4 larva ES proteomik analizi 28 tabi tutulmuştur. Yürütülen çalışma 3 güçlü bir immünojenik olduğu bilinen HES ana glıkan bileşenleri karakterize içerir ve mikro-RN salgılananBu 50-100 nm veziküller veya eksozom (Buck ve diğ., Yayımlanmak üzere gönderilen) olarak kapsüllü gibidir. Bu son derece bağışıklık parazitten ve HES moleküler bileşenleri tanımlayan geniş proteomik verileri ile ES toplanması için tekrarlanabilir protokollerin kurulması ile, sahne artık kimlik ve H. bireysel moleküllerin tedavi test için ayarlanır konukçu bağışıklık sistemi üzerinde önemli etkilere aracılık edebilen polygyrus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon concentrator Millipore 5112 Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solution Sigma H9394 500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin Invitrogen 15070-063 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal Merck 1.09624.0500 18-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution Sigma G8769 100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes Sarstedt 62.547.254 50 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks Sigma CLS430639  25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay Lonza 50-647U QCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin Gibco 15710-049 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco 11875093 500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monroy, F. G., Enriquez, F. J. Heligmosomoides polygyrus : a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today. 8, 49-54 (1992).
  2. Maizels, R. M., et al. Immune modulation and modulators in Heligmosomoides polygyrus infection. Exp. Parasitol. 132, 76-89 (2012).
  3. Hewitson, J. P., et al. Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed at restricted glycan and peptide epitopes. J Immunol. 187, 4764-4777 (2011).
  4. Walk, S. T., Blum, A. M., Ewing, S. A., Weinstock, J. V., Young, V. B. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16, 1841-1849 (2010).
  5. Rausch, S., et al. Small intestinal nematode infection of mice Is associated with increased enterobacterial loads alongside the intestinal tract. PLoS ONE. 8, e74026 (2013).
  6. Reynolds, L. A., et al. Commensal-pathogen interactions in the intestinal tract: Lactobacilli promote infection with, and are promoted by, helminth parasites. Gut Microbes. 5, 10-19 (2014).
  7. Saunders, K. A., Raine, T., Cooke, A., Lawrence, C. E. Inhibition of autoimmune type 1 diabetes by gastrointestinal helminth infection. Infect Immun. 75, 397-407 (2007).
  8. Liu, Q., et al. Helminth infection can reduce insulitis and type 1 diabetes through CD25- and IL-10-independent mechanisms. Infect Immun. 77, 5347-5358 (2009).
  9. Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., Doligalska, M. Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp Parasitol. 132, 243-248 (2012).
  10. Mishra, P. K., Patel, N., Wu, W., Bleich, D., Gause, W. C. Prevention of type 1 diabetes through infection with an intestinal nematode parasite requires IL-10 in the absence of a Th2-type response. Mucosal Immunol. 6, 297-308 (2013).
  11. Sutton, T. L., et al. Anti-Inflammatory mechanisms of enteric Heligmosomoides polygyrus infection against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in a murine model. Infect Immun. 76, 4772-4782 (2008).
  12. Hang, L., et al. Heligmosomoides polygyrus bakeri infection activates colonic Foxp3+ T cells enhancing their capacity to prevent colitis. J Immunol. 191, 1927-1934 (2013).
  13. Bashir, M. E., Andersen, P., Fuss, I. J., Shi, H. N., Nagler-Anderson, C. An enteric helminth infection protects against an allergic response to dietary antigen. J Immunol. 169, 3284-3292 (2002).
  14. Wilson, M. S., et al. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J. Exp. Med. 202, 1199-1212 (2005).
  15. Kitagaki, K., et al. Intestinal helminths protect in a murine model of asthma. J Immunol. 177, 1628-1635 (2006).
  16. Hartmann, S., et al. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis. Clin Exp Allergy. 39, 1585-1596 (2009).
  17. Pritchard, D. I., Lawrence, C. E., Appleby, P., Gibb, I. A., Glover, K. Immunosuppressive proteins secreted by the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. Int. J. Parasitol. 24, 495-500 (1994).
  18. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-β pathway. J Exp Med. 207, 2331-2341 (2010).
  19. McSorley, H. J., et al. Suppression of type 2 immunity and allergic airway inflammation by secreted products of the helminth Heligmosomoides polygyrus. Eur. J. Immunol. 42, 2667-2682 (2012).
  20. McSorley, H. J., Blair, N. F., Smith, K. A., McKenzie, A. N. J., Maizels, R. M. Blockade of IL-33 release and suppression of type 2 innate lymphoid cell responses by helminth secreted products in airway allergy. Mucosal Immunol. 7, 1068-1078 (2014).
  21. Behnke, J. M., Menge, D. M., Noyes, H. Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of restance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology. 136, 1565-1580 (2009).
  22. Filbey, K. J., et al. Innate and adaptive type 2 immune cell responses in genetically controlled resistance to intestinal helminth infection. Immunology and Cell Biology. 92, 436-448 (2014).
  23. Bortolatto, J., et al. Toll-like receptor 4 agonists adsorbed to aluminium hydroxide adjuvant attenuate ovalbumin-specific allergic airway disease: role of MyD88 adaptor molecule and interleukin-12/interferon-gamma axis. Clin Exp Allergy. 38, 1668-1679 (2008).
  24. Wilson, M. S., et al. Helminth-induced CD19+CD23hi B cells modulate experimental allergic and autoimmune inflammation. Eur J Immunol. 40, 1682-1696 (2010).
  25. Segura, M., Su, Z., Piccirillo, C., Stevenson, M. M. Impairment of dendritic cell function by excretory-secretory products: A potential mechanism for nematode-induced immunosuppression. Eur J Immunol. 37, 1887-1904 (2007).
  26. Hewitson, J. P., et al. Proteomic analysis of secretory products from the model gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus reveals dominance of Venom Allergen-Like (VAL) proteins. J Proteomics. 74, 1573-1594 (2011).
  27. Moreno, Y., et al. Proteomic analysis of excretory-secretory products of Heligmosomoides polygyrus assessed with next-generation sequencing transcriptomic information. PLoS Negl Trop Dis. 5, e1370 (2011).
  28. Hewitson, J. P., et al. Secretion of protective antigens by tissue-stage nematode larvae revealed by proteomic analysis and vaccination-induced sterile immunity. PLOS Pathogens. 9, e1003492 (2013).
  29. Prowse, S. J., Mitchell, G. F. On the choice of mice for dissection of strain variations in the development of resistance to infection with Nematospiroides dubius. Austral J Exp Biol Med. 58, 603-605 (1980).
  30. Behnke, J. M., Robinson, M. Genetic control of immunity to Nematospiroides dubius: a 9-day anthelmintic abbreviated immunizing regime which separates weak and strong responder strains of mice. Parasite Immunol. 7, 235-253 (1985).
  31. Zhong, S., Dobson, C. Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122-131 (1996).
  32. Behnke, J. M., et al. Genetic variation in resistance to repeated infections with Heligmosomoides polygyrus bakeri, in inbred mouse strains selected for the mouse genome project. Parasite Immunol. 28, 85-94 (2006).
  33. Zaiss, M. M., et al. IL-1β suppresses innate IL-25 and IL-33 production and maintains helminth chronicity. PLoS Pathog. 9, e1003531 (2013).
  34. Reynolds, L. A., et al. MyD88 signaling inhibits protective immunity to the gastrointestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. J Immunol. , (2014).
  35. Morimoto, M., Utsumiya, K. Enhanced protection against Heligmosomoides polygyrus in IL-2 receptor β-chain overexpressed transgenic mice with intestinal mastocytosis. J Vet Med Sci. 73, 849-851 (2011).
  36. Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E., Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5513-5517 (1991).
  37. Smith, K. A., Maizels, R. M. IL-6 controls susceptibility to helminth infection by impeding Th2 responsiveness and altering the Treg phenotype in vivo. Eur J Immunol. 44, 150-161 (2014).
  38. Hayes, K. S., Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Immune-mediated regulation of chronic intestinal nematode infection. Immunol Rev. 201, 75-88 (2004).
  39. Fröhlich, A., et al. IL-21 receptor signaling is integral to the development of Th2 effector responses in vivo. Blood. 109, 2023-2031 (2007).
  40. King, I. L., Mohrs, K., Mohrs, M. A nonredundant role for IL-21 receptor signaling in plasma cell differentiation and protective type 2 immunity against gastrointestinal helminth infection. J Immunol. 185, 6138-6145 (2010).
  41. Ince, M. N., et al. Role of T cell TGF-β signaling in intestinal cytokine responses and helminthic immune modulation. Eur J Immunol. 39, 1870-1878 (2009).
  42. Reynolds, L. A., Maizels, R. M. Cutting Edge: In the absence of TGF-β signaling in T cells, fewer CD103+ regulatory T cells develop, but exuberant IFN-γ production renders mice more susceptible to helminth infection. J Immunol. 189, 1113-1117 (2012).
  43. Ekkens, M. J., et al. Memory Th2 effector cells can develop in the absence of B7-1/B7-2, CD28 interactions, and effector Th cells after priming with an intestinal nematode parasite. J Immunol. 168, 6344-6351 (2002).
  44. Greenwald, R. J., et al. B7-2 is required for the progression but not the initiation of the type 2 immune response to a gastrointestinal nematode parasite. J. Immunol. 162, 4133-4139 (1999).
  45. Ekkens, M. J., et al. The role of OX40 ligand interactions in the development of the Th2 response to the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. J. Immunol. 170, 384-393 (2003).
  46. Hashimoto, K., et al. Immunity-mediated regulation of fecundity in the nematode Heligmosomoides polygyrus--the potential role of mast cells. Parasitology. 137, 881-887 (2010).
  47. Hepworth, M. R., et al. Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6644-6649 (2012).

Tags

Immunology Sayı 98, Helmint Yaşam Döngüsü türemiş-Salgı Ürünleri İmmünoloji Enfeksiyon Fare
Yetiştirme<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Bir immunsupresif Nematodu Parazit ve Salgılanmış Ürünleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnston, C. J. C., Robertson, E.,… More

Johnston, C. J. C., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter