Summary
A continuación, presentamos un protocolo para cuantificar de forma continua adhesión celular y de-adhesión procesos con alta resolución temporal de una manera no invasiva por impedancia célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques revelan la dinámica de los procesos de adhesión celular / DE-adhesión desencadenados por modificación de la matriz y su relación temporal de los eventos de señalización de adhesión dependiente.
Abstract
La adhesión célula-matriz desempeña un papel clave en el control de la morfología celular y la señalización. Los estímulos que interrumpen la adhesión célula-matriz (por ejemplo, mieloperoxidasa y otros oxidantes matriz modificar / enzimas liberadas durante la inflamación) están implicados en el desencadenamiento de cambios patológicos en la función celular, el fenotipo y la viabilidad en un número de enfermedades. Aquí se describe cómo impedancia de la célula-sustrato y enfoques imágenes de células vivas se pueden emplear fácilmente para cuantificar con precisión los cambios en tiempo real en la adhesión celular y de-la adhesión inducida por la modificación de la matriz (utilizando células endoteliales y la mieloperoxidasa como un estímulo matriz de modificadores de fisiopatológico) con alta resolución temporal y de una manera no invasiva. El sistema de impedancia de la célula-sustrato xCELLigence cuantifica de forma continua el área de la adhesión célula-matriz mediante la medición de la impedancia eléctrica en la interfase célula-sustrato en las células cultivadas sobre matrices de microelectrodos de oro. Análisis de imágenes de time-lapse diferencial películas de contraste de interferencia cuantifica los cambios en el área proyectada de las células individuales en el tiempo, que representa los cambios en el área de contacto célula-matriz. Ambas técnicas cuantificar con precisión los cambios rápidos en los procesos de adhesión celular y de-adhesión. Impedancia de la célula-sustrato sobre biochips microelectrodos proporciona una plataforma para mediciones robusto, de alto rendimiento. Imágenes de células vivas analiza proporcionar detalles adicionales con respecto a la naturaleza y la dinámica de los cambios morfológicos cuantificados mediante mediciones de impedancia célula-sustrato. Estos enfoques complementarios proporcionan valiosos nuevos conocimientos sobre cómo la modificación oxidativa catalizada por mieloperoxidasa de los componentes de la matriz extracelular subcelulares provoca cambios rápidos en la adhesión celular, la morfología y señalización en las células endoteliales. Estos enfoques son también aplicables para el estudio de la dinámica de adhesión celular en respuesta a otros estímulos matriz modificar y en células adherentes relacionados (por ejemplo, células epiteliales).
Introduction
Se requieren contactos adhesivas estable entre las células y su matriz extracelular circundante para el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Por ejemplo, la adhesión celular endotelial a la matriz subendotelial en los vasos sanguíneos desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la integridad de la capa endotelial y su función homeostática como una barrera vascular reguladora, semi-permeable 1. El citoesqueleto de actina está acoplado mecánicamente al adhesivo moléculas de la matriz en los sitios de adhesión célula-matriz y los contactos de adhesivo en la interfase célula-matriz desempeñar un papel importante en la determinación de la posición de la membrana celular mediante la resistencia a fuerzas de tracción de actomiosina centralmente dirigidas. Estímulos extracelulares que alteran la adhesión célula-matriz alterar necesariamente el equilibrio de fuerzas en la interfase célula-matriz, un evento que es rápidamente "sintieron" por proteínas de señalización mecano-sensible, lo que resulta en la transducción de "afuera hacia adentro de señalización". Esta apuesta cruzada hablarween células y su matriz extracelular circundante juegan un papel clave en el control de la forma celular, la motilidad, la función, la proliferación y la supervivencia 2.
Procesos fisiopatológicos diversos (desarrollo embrionario, la inflamación, la reparación de heridas y la metástasis del cáncer) se caracterizan por la remodelación dinámica de sustratos de matriz adhesiva por oxidantes y / o enzimas que degradan la matriz 3,4. Por ejemplo, adhesivo de proteínas de la matriz subendotelial en los vasos sanguíneos (por ejemplo, fibronectina) están implicados como los principales objetivos para la modificación o degradación en las enfermedades inflamatorias humanos debido a la producción localizada de oxidantes reactivos (por ejemplo, ácido hipocloroso, HOCl) por la enzima derivadas de leucocitos mieloperoxidasa (MPO), que se acumula dentro de la subendotelio vascular durante la enfermedad inflamatoria (Figura 1) 5-9. Los cambios en la adhesión célula-matriz inducidos por oxidantes derivados de MPO y otros estímulos de matriz modificadores son likEly jugar un papel importante en la alteración de la homeostasis vascular durante una variedad de procesos patológicos, por ejemplo, mediante la alteración de la señalización celular endotelial, morfología y viabilidad, que a su vez perturba la función endotelial y la integridad de la barrera. Sin embargo, las respuestas de señalización morfológicos y celulares de las células adherentes a las modificaciones de la matriz extracelular sólo están empezando a ser entendido.
Para entender cómo las modificaciones de la matriz coche cambios en la dinámica de adhesión celular y vías de señalización celular de adhesión dependiente, se requieren técnicas que cuantificar con precisión los cambios en la adhesión célula-matriz en tiempo real, con alta resolución temporal. A continuación, describimos impedancia de la célula-sustrato complementaria y técnicas de imágenes de células vivas que cumplen estos criterios y proporcionar una plataforma para cuantificar la adhesión celular y los procesos de-adhesión de una manera no invasiva.
Mostramos cómo éstos impedancia célula-sustrato y en directo apro imágenes de célulasdolores se pueden emplear fácilmente para (i) controlar la dinámica de la unión celular y la propagación (es decir, de novo de adhesión celular) sobre sustratos de matriz nativos y modificados y (ii) para medir la dinámica de desprendimiento de las células de la matriz (es decir, de-adhesión ) por las células adherentes expuestos a estímulos matriz modificadores. El sistema xCELLigence célula-sustrato impedancia de biosensor proporciona una medición continua de la zona de contacto célula-matriz mediante la cuantificación de impedancia eléctrica en la superficie de 96 pocillos arrays de microelectrodos de oro y expresa estas mediciones de impedancia eléctrica como "índice de célula, un valor adimensional que es en gran parte proporcional al área de contacto célula-sustrato 10 (Figura 2), mientras que también es sensible a los cambios en la distancia media entre la (aislante) membrana celular y la superficie del electrodo 11. También se consigue un aumento adicional de los valores del índice de células en la formación de apretado contactos célula-célula del that restringir los flujos actuales paracelulares, 11 condiciones que no prevalecen dentro de los experimentos descritos en este estudio. Medición del área proyectada de las células individuales en el tiempo por análisis de imágenes de contraste de interferencia diferencial de lapso de tiempo (DIC) películas proporciona una medida complementaria de los cambios en el área de contacto célula-sustrato y proporciona información adicional con respecto a la naturaleza exacta y la dinámica de la cambios morfológicos cuantificados por el enfoque de impedancia de la célula-sustrato.
Específicamente, se describe la aplicación de estos enfoques para supervisar cómo oxidación de proteínas de la matriz subendotelial adhesivas (por ejemplo, fibronectina) (i) mediada por MPO reduce la adhesión de novo de las células endoteliales en suspensión en fibronectina purificada y (ii) desencadena célula-matriz de -adhesion en las células endoteliales con la adhesión establecido en la fibronectina. Mediante la realización de la señalización celular paralelo analiza en el tiempo utilizando biochem relevanteensayos de cos (por ejemplo, transferencia de Western), las relaciones temporales y causales entre los procesos de adhesión / DE-adhesión y los cambios asociados en los eventos de señalización celular de adhesión dependiente se puede determinar.
Estos enfoques han usado recientemente para demostrar que la oxidación de la matriz extracelular catalizada por depósitos subendoteliales de MPO activa una rápida pérdida en la adhesión célula-matriz de las células endoteliales que es impulsado por las fuerzas de pre-existentes contráctiles actomyosin 9. Es importante destacar que, al permitir que la relación temporal entre cambios tanto en la adhesión celular y la adhesión celular dependiente de señalización que se determine, estos enfoques identificados que modificación de la matriz inducida por MPO y celular de-adhesión desencadena cambios en importantes vías de señalización celular de adhesión dependiente incluyendo Src quinasa fosforilación paxilina -dependiente y cadena ligera de miosina II fosforilación (Figura 1) 9. Este modo de señalización redox dependientes, involving la activación de los eventos de señalización intracelular por reacciones oxidativas extracelulares que romper la adhesión célula-matriz, representa un nuevo modo de señalización celular denomina "fuera-en la señalización redox" (Figura 1) 9.
En general, estos complementaria biosensor impedancia de la célula-sustrato y enfoques imágenes de células vivas deben ser valiosa para revelar cómo los diferentes estímulos o agentes modificadores de la matriz coche cambios en la dinámica de adhesión celular, la morfología y la señalización dentro de diferentes tipos de células adherentes sujetos a una amplia variedad de parámetros experimentales.
El siguiente protocolo describe cómo cuantificar el impacto de la oxidación matriz mediada por MPO de novo adhesión de células endoteliales (Experimento 1) y la célula procesos de adhesión endotelial (2 Experimento). MPO se une ávidamente a la fibronectina y otras proteínas de la matriz extracelular subendotelial adhesivas y nosotroses peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para convertir los iones de cloruro (Cl -) para el oxidante de cloración ácido hipocloroso altamente reactivo (HOCl), que reacciona localmente con estas proteínas de la matriz y altera sus propiedades adhesivas celular (Figura 1) 8,9, 12.
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Protocol
1. Generalidades de células endoteliales Cultura
- Células endoteliales aórticas bovinas Cultura (pasajes 4-9) en matraces de cultivo de tejido recubiertos de gelatina (capa de superficie de cultivo de tejidos con 0,1% w / v de gelatina en PBS a temperatura ambiente durante 15 min) en EGM-2 medios de comunicación (con la bala EGM-2 kit que contiene suero bovino fetal al 5%, factores de crecimiento y todos los suplementos proporcionadas por el fabricante, a excepción de hidrocortisona).
- Cuando las células son casi confluente (ca. 3 días después de la siembra después de un 1: split 4), las células de la cosecha mediante el tratamiento con 0,05% w / v de tripsina / 0,02% w / v EDTA en PBS a 37 ° C. Después de la mayoría de las células se han desprendido, añadir completas EGM-2 medios para inactivar la tripsina y después de centrifugación (100 xg, 5 min).
- Preparar las células para estudios sobre la adherencia de novo de las células endoteliales a la fibronectina (Experimento 1: Sección 2) y la posterior de-adhesión de las células endoteliales con la adhesión establecido en este sustrato (Experimento 2: Sección 3).
- Lave cosechadocélulas una vez con medio libre de suero que contiene 199 1% w / v de albúmina de suero bovino (BSA) y volver a centrifugar (100 xg, 5 min).
- Vuelva a suspender las células en medio libre de suero 199 conteniendo 1% w / v de BSA en 2,5 x 10 5 células / ml (mediciones de impedancia célula-sustrato) o 5 x 10 5 células / ml (análisis de imágenes de células vivas) y mantener a 37 ° C antes de su uso.
NOTA: Las respuestas adhesión de las células son muy sensibles a las diferencias de temperatura (por ejemplo, debido a efectos de convección) para todos los equipos y soluciones utilizados para manejar y tratar las células durante los siguientes protocolos deben mantenerse a una temperatura constante de 37 ° C.
2. Experimento 1: Cuantificación De Novo adhesión endoteliales celular en nativo y oxidado-MPO fibronectina (Impedancia de la célula-sustrato)
NOTA: Experimento 1 examina el grado en el que la oxidación mediada por MPO de la fibronectina perjudica su capacidad para soportar de novo
- Fibronectina Escudo en 96 pocillos de células-sustrato arrays de microelectrodos impedancia de oro. Añadir 80 l / pocillo de fibronectina bovina purificada a 5 g / ml en PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C y remover la solución.
- Incubar las superficies recubiertas de fibronectina con MPO para permitir la unión de MPO a la fibronectina unida a la superficie. Añadir 80 l / pocillo de purificado MPO de neutrófilos humanos a 20 nM en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y se incuban durante 0,5 horas a 37 ° C.
- Lave las superficies dos veces con HBSS para eliminar cualquier MPO no unido.
- Añadir H 2 O 2 (0-10 mM concentración final) a los pocillos de la placa de matriz de microelectrodos que contiene 80 l / pocillo HBSS para iniciar MPO catalizada, la oxidación dependiente de fibronectina HOCl y se incuba durante otras 0,5 horas a 37 ° C.
- Para examinar el efecto de los inhibidores o moduladores de reacciones catalizadas-MPO pertinentes (por ejemplo, la enzima alternativa MPOsustratos, inhibidores de la enzima o antioxidantes; ver 9 para más detalles), añadirlos a la HBSS inmediatamente antes de H 2 O 2 adición.
- Después de 0,5 horas, el tratamiento de superficies con metionina para saciar las especies oxidantes residuales de la superficie de éste; es decir, las cloraminas unidos a proteínas reactivas, que pueden ejercer las actividades celulares de confusión. Añadir metionina 10 mM en 80 l HBSS por pocillo e incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
- Bloquear las superficies con BSA. Añadir 80 l / pocillo de BSA al 0,2% w / v en PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C y remover la solución.
NOTA: regiones de la superficie sin recubrimiento residual apoyar la adhesión celular y el bloqueo de estos con una proteína no adhesivo (es decir, BSA) asegura que las respuestas de adhesión celular dependen estrictamente de la célula-matriz adhesiva purificado empleado, en este caso fibronectina. - Lave las superficies dos veces con HBSS.
NOTA: Ninguno de los tratamientos de superficie precedentes afecta apreciablemente readin célula-sustratogs. - Semilla células endoteliales en suspensión (añadir 200 l / pocillo a aproximadamente 2,5 x 10 5 células / ml, preparado en medio libre de suero 199 que contiene 1% de BSA; ver 1.3) sobre las superficies de fibronectina recubierto nativos u oxidadas-MPO.
- Inmediatamente después de la siembra de células (es decir, antes de cualquier fijación de las células y la difusión), montar la placa matriz de microelectrodos en el puerto de incubadora (alojado en una incubadora a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2).
- Usando el software del instrumento tomar inmediatamente una "en blanco" para normalizar la lectura de impedancia de la célula-sustrato posterior ("índice de teléfono ') valores a los valores de fondo iniciales obtenidos en ausencia de adhesión celular.
- Iniciar adquisición de datos de índice de células continuas (mínimo de una celda índice de lectura / min).
- Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2 horas, un período de tiempo durante el cual la unión de células máxima y la difusión que se consigue; esto se refleja porun estancamiento de los valores del índice de células (ver Figura 3A).
NOTA: El experimento anterior (Experimento 1) examina cómo oxidación inicial mediada por MPO de la fibronectina limita la capacidad de las células endoteliales para establecer la adhesión celular en este sustrato. El siguiente experimento (Experimento 2) examina la forma en la oxidación mediada por la fibronectina MPO promueve disminuciones en la adhesión célula-matriz (es decir, de-adhesión) en las células endoteliales con la adhesión establecido en este sustrato. Los tratamientos en estos dos experimentos son esencialmente idénticos, salvo en el momento de la oxidación mediada por MPO fibronectina (es decir, antes de la adhesión celular - Experimento 1; después de la adhesión celular - Experimento 2).
3. Experimento 2: Cuantificación de células endoteliales De-adhesión de fibronectina en respuesta a mediada MPO fibronectina Oxidación (Impedancia de la célula-sustrato y imágenes de células vivas)
- Fibronectina Escudo en 96 pozos de microelectrodos de oro unrrays para mediciones de impedancia célula-sustrato (añadir 80 l / pocillo de fibronectina a 5 g / ml en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ° C) o 35 mm placas de cultivo celular con fondo de cristal para análisis de imágenes de células vivas (añadir 2 ml / plato de la fibronectina a 5 g / ml en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ° C).
- Bloquear las superficies con BSA. Añadir BSA al 0,2% w / v en PBS a los volúmenes indicados en el punto 3.1 y se incuba durante 2 horas a 37 ° C.
- Incubar las superficies con MPO para permitir la unión de MPO a la fibronectina. Añadir 20 nM purificado MPO humana en HBSS a los volúmenes indicados en el punto 3.1 y se incuba durante 0,5 horas a 37 ° C.
- Lave las superficies dos veces con HBSS para eliminar cualquier MPO no unido.
- Semilla células endoteliales en suspensión (preparados en medio libre de suero que contiene 199 1% w / v BSA; véase 1.3) sobre las superficies recubiertas de fibronectina nativas o portadoras de MPO.
- Añadir 200 l / pocillo en 2,5 x 10 5 células / ml a 96 así célula-sustrato arrays de microelectrodos impedancia. <li> Añadir 2 ml / placa en 5 x 10 5 células / ml a 35 mm con fondo de cristal placas de cultivo celular.
- Monte 96 y placas de matriz de microelectrodos en el puerto incubadora impedancia célula-sustrato (guardadas en una incubadora a 37ºC en presencia de CO2 al 5%) y tomar las lecturas "en blanco" para iniciar la adquisición continua de datos de índice de células (véase la Sección 2.10 ).
- Transferencia de 35 mm con fondo de cristal placas de cultivo celular a una incubadora a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2.
NOTA: HBSS se emplea cuando se estudia MPO catalizada por reacciones oxidativas en lugar de medio de cultivo completo ya que éste contiene especies oxidables que interfieren con las reacciones de oxidación.
NOTA: Después de equilibrio de 0,5 horas en HBSS, los valores del índice de células se estabilizan en valores ligeramente inferiores; cuando las células pre-incubación con sustratos de enzimas, enzimas e inhibidores de señalización celular o antioxidantes, asegurarse primero de que tstos no afectan significativamente los valores obtenidos después del equilibrio.
- Para los estudios de impedancia de células usando 96 y placas de matriz de microelectrodos:
- Retire la placa matriz de microelectrodos de la incubadora y la pausa mediciones del índice de célula.
- Añadir H 2 O 2 (concentración final de 0-10 mM) a la HBSS y mezclar suavemente con la pipeta repetido.
- Inmediatamente, vuelva a montar la matriz de microelectrodos de nuevo en el puerto C incubadora a 37 ° y volver a iniciar la adquisición de lecturas del índice celular.
- Para los estudios de imágenes de células vivas utilizando 35 mm plato con fondo de cristal de cultivo celular:
- Retire la placa de cultivo de la incubadora y su montaje en una etapa C calentada de un microscopio confocal invertido equipado con una lente de objetivo 63X agua con óptica DIC adecuados para la grabación de películas de células vivas 37 °.
- Centrarse en las células yoptimizar DIC óptica (iluminación Köhler, retraso sesgo y el desplazamiento de la cámara / ganancia; para más detalles, véase 13).
- Iniciar película CID y registrar las lecturas iniciales de las células no tratadas durante 1 min.
- Añadir H 2 O 2 (concentración final de 0-10 mM) y mezclar suavemente con la pipeta repetido. Re-enfocar el microscopio (si es necesario) y continuar la grabación de películas DIC de las células tratadas durante el periodo de tiempo requerido.
4. Análisis de Datos y Presentación
- Datos de impedancia de la célula-sustrato
- Exportar datos en bruto (índice frente al tiempo de células) en una hoja de cálculo.
- Para los estudios de células de-adhesión (Experimento 2: Sección 3), normalizar los datos mediante el establecimiento de valores registrados inmediatamente antes de la iniciación de la oxidación fibronectina mediada MPO en un valor de 1 (es decir, inmediatamente antes de la adición de H 2 O 2 en 3.11 .1.1).
NOTA: Esto asegura que relativalos cambios en los valores del índice de células producidas por la oxidación fibronectina mediada MPO no están enmascarados por pequeñas diferencias iniciales en los valores del índice de células absolutas entre pozos.- Los datos se presentan como diagramas de índice normalizado de células (eje y) frente al tiempo (eje x).
- Datos de imágenes de células vivas (estudios de células de-adhesión en el Experimento 2: Sección 3)
- Abra DIC en vivo de imágenes de células películas grabadas inmediatamente antes y después de la iniciación de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un programa de análisis de imagen estándar (por ejemplo, software ImageJ).
- En al menos dos películas separadas DIC seleccionar aleatoriamente varias celdas y medir su área proyectada en fotogramas secuenciales (por ejemplo, a intervalos de 1 min) trazando manualmente su borde de la membrana y cuantificar el número de píxeles cerrados.
- Exportar datos en bruto (área celular proyectado en función del tiempo) a una hoja de cálculo Excel y normalizar los datos del área de células mediante el establecimiento de los valores registrados inmediatamente antesla iniciación de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un valor de 1 (es decir, inmediatamente antes de la adición de H 2 O 2 en 3.11.2.3).
- Los datos actuales como una parcela de área normalizada de células (eje y) frente al tiempo (eje x).
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Representative Results
La cuantificación en tiempo real de células endoteliales de adhesión de fibronectina en respuesta a la oxidación mediada por la fibronectina MPO (Experimento 2). La siembra de las suspensiones de células endoteliales en nativo (MPO libre) de fibronectina o MPO-cojinete resultados de fibronectina en la unión celular máxima y la difusión dentro de 2 h, según se juzga por un estancamiento de valores de índice celular en las mediciones de impedancia sustrato de células (Figura 3A). Esta fase inicial de la unión celular y la difusión se reduce notablemente cuando la oxidación fibronectina mediada por MPO se inicia antes de la siembra de células en experimentos realizados de acuerdo con el protocolo detallado en el Experimento 1 (datos no mostrados; Para más detalles ver 9). Una vez que la adhesión celular máxima se establece sobre la fibronectina nativa o MPO-cojinete, dirigido oxidación fibronectina mediada por HOCl catalizada por MPO (iniciado por la adición de co-sustrato de MPO H 2 O 2) provoca una disminución rápida en el surárea de la cara de contacto célula-matriz medida por impedancia de la célula-sustrato (Figura 3A, B) y por imágenes de células vivas (Figura 3C; para un representante de película DIC, ver la película 1; índice de célula o área de la celda pérdidas después de H 2 O 2 Además son mínimos en ausencia de MPO 9). Mientras que el índice de células y de área celular inducida por los cambios durante MPO de-adhesión fueron muy similares, las disminuciones relativamente lentas en los valores del índice de células pueden reflejar los efectos aislantes de materiales de membrana de células presentes en las regiones 'libres de células' en la periferia de la célula durante el de- adhesión, que no se cuantifica en las mediciones de área celular proyectadas. La rápida celular de-adhesión aparente en las células endoteliales unidas a fibronectina MPO-cojinete en respuesta a H 2 O 2 de tratamiento está ausente en las células tratadas con H 2 O 2 solo (es decir, células que no contienen MPO) (Figura 3A) y se bloquea binhibidores de la enzima y MPO o carroñeros HOCl (datos no mostrados; ver 9 para más detalles), la identificación de que este proceso depende de la producción catalizada-MPO de HOCl (ver Figura 1). La inhibición de la función motora miosina II con blebbistatin inhibe la tasa de células endoteliales de adhesión medido por la impedancia célula-sustrato (Figura 3B) y por imágenes de células vivas (Figura 3C, Película 2), identificando que celular de-adhesión y contracción en respuesta a catalizada por MPO oxidación matriz subcelular es impulsado por las fuerzas de tracción actomyosin 9.
Figura 1. mediada por MPO oxidación matriz subcelular desencadena célula-matriz de-adhesión y la señalización celular. MPO desencadena respuestas rápidas de-adhesión y cambios en la señalización de adhesión dependiente de por mediación o dirigidoxidation de proteínas de la matriz subendotelial adhesivas, que implican los siguientes eventos 9: (A) MPO se une ávidamente a la matriz subendotelial y utiliza H 2 O 2 para generar el oxidante altamente reactivo HOCl que reacciona localmente con proteínas de la matriz (por ejemplo, fibronectina) y altera su celular propiedades adhesivas. (B) Este daño interrumpe contactos adhesivas en la interfase célula-matriz, lo que lleva a la retracción (C) membrana impulsado por la tensión sin oposición en el citoesqueleto de actina y la alteración de las vías de señalización celular de adhesión dependiente (Reproducido con permiso de Rees et al. 9 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figure 2. Trabajo de flujo y principio de la impedancia de la célula-sustrato análisis para cuantificar las células endoteliales de adhesión de fibronectina en respuesta a la oxidación fibronectina mediada MPO (Experimento 2). Los valores de índice de células medidas por el sistema de células-sustrato microarrays impedancia biosensor reflejan la capacidad de la membrana celular para limitar las corrientes de iones de campo magnético en la superficie del electrodo y son proporcionales al área de contacto célula-sustrato 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. cuantificación en tiempo real de células endoteliales de adhesión de fibronectina en respuesta a la oxidación mediada por la fibronectina MPO (Experimento 2). Suspensiones de células endoteliales (en medio libre de suero que contiene 199 1%BSA) Se sembró en fibronectina nativa o MPO-cojinete (fibronectina recubierto en 5 g / ml, a continuación se incubaron en ausencia o presencia de 20 nM MPO) en 96 arrays de microelectrodos (así mediciones de impedancia célula-sustrato) o 35 mm de vidrio de fondo placas de cultivo celular (análisis de imágenes de células vivas). Las células se incubaron a continuación a 37 ° C durante 2 horas para permitir la unión celular máxima y la difusión antes de equilibrar las células con HBSS y el inicio de la oxidación mediada por la fibronectina MPO mediante la adición de H 2 O 2 (10 mM) (tiempo de H 2 O 2 Además fijado en t = 0 min). (A) completa el curso temporal de las mediciones de impedancia de células sustrato antes y después del tratamiento con H 2 O 2 en presencia (+ MPO) y ausencia (-MPO) de MPO. (B) las mediciones de impedancia de la célula-sustrato y (C) Área de células mediciones de imágenes de células vivas análisis, después de un tratamiento de MPO que contienen células con H 2 O 2 en presencia (Blebbistatin +) y ausencia (-blebbistatin) de la blebbistatin inhibidor de la miosina II (40 mM). Los valores del índice de la célula y de área celular se normalizan a valores inmediatamente antes de la hora de H 2 O 2, además, que se les dio un valor de 1. Los datos del índice de la célula representa la media ± SEM, n = 6 mediciones repetidas de un experimento representativo. Los valores de área celular representan la media ± SEM, n = 10 células (2 películas repetidas, 5 células seleccionadas al azar por película: ver Películas 1 y 2). (Figura 3B, la figura 3C, Película 1 Película 2 y se reproducen con permiso de Rees et al. 9). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1 . Time lapse DIC micropelícula scopy de células endoteliales adheridas en fibronectina MPO-rodamiento sobre 0 - 15 min después de la exposición al H 2 O 2 (10 M); 1 seg = 3 min.
Movie 2 . Tiempo película lapso DIC microscopía de células endoteliales adheridas en fibronectina MPO-rodamiento sobre 0 - 15 min tras la exposición a H 2 O 2 (10 mM) en presencia de blebbistatin (40 mM); 1 seg = 3 min.
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Discussion
La adhesión célula-matriz y los procesos de-adhesión pueden cuantificarse con precisión en tiempo real con alta resolución temporal utilizando impedancia de la célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques en tiempo real proporcionan una gran ventaja sobre los análisis de punto final de la adhesión celular, que proporcionan una pobre resolución temporal. Al cuantificar con precisión rápidas respuestas de-adhesión con alta resolución temporal, estos análisis pueden proporcionar información decisiva sobre la forma morfológica respuestas a las modificaciones de la matriz están regulados y cómo afectan a los procesos de señalización celular de adhesión dependiente, medida en que utilizan ensayos bioquímicos pertinentes paralelos (por ejemplo, Western Blot).
En estudios recientes, se utilizaron estos enfoques para revelar un nuevo papel para la oxidación mediada por MPO de la matriz subendotelial en el desencadenamiento de la de-adhesión de las células endoteliales y mostraron: (i) que la tasa de de-adhesión fue críticamente dependiente de pre actomyosin existentela contractilidad (cf. figuras 3B y 3C) y (ii) que la pérdida de la adhesión célula-matriz condujo cambios en importantes vías de señalización celular de adhesión dependiente de la fosforilación de paxillin incluyendo Src-dependiente y la miosina de cadena ligera II fosforilación 9 (véase la Figura 1). Estos datos tienen importantes implicaciones para la comprensión de la función endotelial y la integridad de la barrera durante las respuestas inflamatorias, donde la matriz extracelular subendotelial está implicado como un objetivo clave para los oxidantes producidos por los depósitos subendoteliales de MPO unido a la matriz u otras fuentes de oxidantes reactivos 3,5-9, 14.
El uso de un sistema de biosensor impedancia célula-sustrato a base de microarrays-proporciona una plataforma para, mediciones de adhesión celular de alto rendimiento robustos. Cada pocillo de las así célula-sustrato arrays de microelectrodos de impedancia 96 tiene el potencial de analizar simultáneamente 32 diferentes condiciones experimentales (es decir, 3 pozos PEcondición r). Sin embargo, al comparar los pequeños cambios en la adhesión celular, al menos 4 o más pozos deben utilizarse por condición experimental. Durante la siembra de células y tratamientos con células posteriores, se debe tener cuidado de mantener todas las soluciones a 37 ° C y reducir al mínimo el tiempo necesario para el tratamiento de células fuera del entorno C incubadora a 37 ° (esto evita posibles diferencias de temperatura a través de la matriz de microelectrodos que pueden afectar a las respuestas de adhesión ). En particular, la corriente eléctrica en la interfase célula-sustrato es sensible a la fuerza iónica del sobrenadante celular 10: en consecuencia, las células deben dejaron equilibrar después de la adición de nuevos tampones / medios de comunicación para obtener una respuesta de células índice constante antes de monitorizar el efecto del estímulo de interés (ver 3.10 y la Figura 3A). Las disminuciones en el índice de células no sólo puede reflejar una disminución en el área media de contacto célula-matriz sino que también puede reflejar una disminución en el número de células unidas. Para discriminarentre estas posibilidades, los cambios en el número de células unidas sobre matrices de microelectrodos pueden cuantificarse inmediatamente después de las mediciones de impedancia célula-sustrato mediante tinción con violeta cristal este enfoque se ha utilizado para confirmar que la oxidación fibronectina mediada por MPO activa una rápida disminución en el área media de contacto célula-matriz, pero no promueve el desprendimiento de células (para más detalles, véase 9).
Una limitación de la técnica de impedancia de la célula-sustrato es que proporciona una medida promedio de los cambios de adhesión más de todas las células presentes en la superficie de microelectrodos y no da información acerca de la naturaleza precisa de adhesión o cambios morfológicos a nivel de células individuales. Para hacer frente a esta limitación, células vivas DIC microscopía y análisis de imágenes proporciona una medida complementaria de los cambios de adherencia y revela los cambios morfológicos de las células individuales. Por lo tanto, disminuye en el índice de célula en respuesta a mediada por MPO mea oxidación fibronectinaSured por la impedancia célula-sustrato (Figura 3A) se correlacionan bien con las disminuciones en el área proyectada de las células medidos mediante análisis de imágenes de células vivas de las películas DIC (Figura 3B). Es importante destacar que, películas DIC revelan que, en las células individuales, MPO-inducida de-adhesión implica la rápida retracción de la membrana celular periférica del sustrato y las células adyacentes y en última instancia resulta en células que asumen una morfología compacta 'redondeado-up', pero sin resultante en el desprendimiento de células (Movie 1). Al igual que con las mediciones de impedancia célula-sustrato, para garantizar respuestas celulares reproducibles, se debe tener cuidado de mantener las soluciones a 37 ° C antes de su uso en las células y una platina del microscopio climatizada (o dispositivo de control de temperatura equivalente) deben ser empleadas durante la imágenes de células vivas grabaciones.
Los protocolos descritos aquí pueden modificarse fácilmente mediante la sustitución de la fibronectina con otros sustratos de matriz purificada (
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones para hacer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
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