Abstract
RNA eller DNA vikas på stabila tredimensionella vikning är intressanta mål i utvecklingen av antitumör eller antivirala läkemedel. I fallet med HIV-1, virala proteiner involverade i regleringen av virusaktivitet erkänner flera nukleinsyror. Nukleokapsidproteinet NCp7 (NC) är ett nyckelprotein som reglerar flera processer under virusreplikation. NC är i själva verket ett förkläde destabilisera de sekundära strukturer RNA och DNA och underlätta deras glödgning. Inaktiveringen av NC är en ny metod och ett intressant mål för anti-HIV-terapi. Den N ucleocapsid En nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAMN) analys utvecklades för att identifiera molekyler med förmåga att inhibera smältning och glödgning av RNA och DNA viks i termodynamiskt stabila tredimensionella konformationer, såsom hårnålsstrukturer av tjära och cTAR delar av HIV, genom nukleokapsidproteinet av HIV-1. Den nya analysen utnyttjar antingen recombinant eller det syntetiska proteinet och oligonukleotider utan behov av deras tidigare märkningen. Analysen av resultaten uppnås genom standard polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) följt av konventionell nukleinsyra färgning. Protokollet redovisas i detta arbete beskrivs hur du utför NAME analysen med fullängdsprotein eller dess stympade versionen saknar den grundläggande N-terminal domän, både kompetent nukleinsyror chaperones, och hur man bedömer hämningen av NC förkläde aktivitet genom en threading interkalator. Dessutom kan NAME utföras i två olika lägen, nyttigt att få indikationer på den förmodade verkningsmekanismen för de identifierade NC-hämmare.
Introduction
Nukleokapsidproteinet NCp7 (NC) av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) är en liten, grundläggande protein som är tätt förknippad med iskt RNA i mogna smittsamt virus, spelar en central roll i virusreplika som en kofaktor under omvänd transkription , genomet erkännande, agerar och förpackning. 1-3 NC som en nukleinsyra förkläde katalyserar destabilisering av stabila nukleinsyrastrukturer och glödgning av komplementära sekvenser. Dess nukleinsyra aggregerande aktiviteten ligger primärt i de 11 aminosyrorna N-terminala domänen medan duplex destabiliserande aktivitet har kartlagts till dess zinkfingerstrukturer (12-55 peptid). 4 Den positivt laddade proteinet sänker elektro barriären av glödgning reaktionen och ökar hastigheten med vilken två separata komplementära sekvenser möts.
Nukleinsyror vikta i stabila konforma kräver de eskortering verksamhet NC till facilitate deras glödgning 5 Detta är särskilt viktigt i omvänd transkription, där NC är kritisk i strängöverföring händelser:. i minussträngöverföring, minussträngen stopp DNA, precis retrotranscribed, måste överföras och hybridiseras till en komplementär sekvens i R-regionen vid 3'-änden av RNA-genomet mallen. 6 Även termodynamiskt gynnade, denna reaktion inte förekommer i stor utsträckning i frånvaro av NC på grund av närvaron av den stabila strukturen hos det transaktiverings responsiv regionen (TAR) RNA i R-regionerna, som måste associeras till dess DNA-kopia (cTAR DNA). 7 cTAR och TAR är i själva verket mycket strukturerade regioner med en karakteristisk stam-loop konforma. NC-proteinet denaturerar dessa hårnålar, och främjar minus-sträng överföring genom att öka graden av intermolekylära glödgning mellan komplementära nukleinsyrasträngar. Mekanismen för NC glödgning av tjära och cTAR har undersökts grundligt och debeskrivs som TAR glödgning analys i flera forskningsrapporter och den föreslagna ordningen är avbildad i utmärkta recensioner. 8-11 sammanfatta, NC destabiliserar sekundärstruktur stabilt RNA såsom TAR-RNA, destabiliserar den sekundära strukturen hos dess komplementära sekvens, cTAR-DNA och främjar glödgning reaktion av RNA / DNA som leder till TAR / cTAR heteroduplexbildning. 10,11 Som ett resultat, är det strängöverföringssteg under HIV-replikation gynnas. 12
NC är ett attraktivt mål för utvecklingen av nya antivirala medel, eftersom den potentiella störningar induceras av små molekyler mot NC skulle resultera i en minskning av omvänd transkription av det virala genomet som en följd av en komprometterad NC aktivitet. 2,13 Detta tillvägagångssätt skulle slutligen leda till utveckling av framgångsrika anti-HIV-medel. Under loppet av en screening för NC-hämmare 14 vi utvecklat en analys att förlita sig på de välkända egenskapernaav nukleokapsid att effektivt destabilisera och härdnings komplementära oligonukleotider. 10,11 Vi kallade det N ucleocapsid En nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) analys. NAMN analys använder NC att medla glödgningen mellan stabilt strukturerade kopior av komplementära nukleinsyror, i vårt fall av oligonukleotiden som motsvarar den apikala delen av en TAR-RNA-sekvens med dess komplementära DNA-sekvensen (cTAR) för att ge hybrid TAR / cTAR heteroduplexet . Analysen av TAR / cTAR glödgning reaktion i närvaro av NC kan undersökas med nativ polyakrylamidgelelektrofores (PAGE).
Detta protokoll visar hur man utför NAME analys för att snabbt härda vid rumstemperatur oligonukleotider vikta i stabila hårnålsstrukturer, hur man analyserar resultatet av reaktion och felsökning av experimentet. Radioaktiv märkning av nukleinsyran inte begärs, och detectipå av oligonukleotid banden kan utföras genom konventionella färgningsmetoder. Analysen, som sysselsätter antingen det rekombinanta fullängdsproteinet eller en trunkerad syntetisk version av NC, möjliggör identifiering av gäng interkalatorer inhiberar NC, en aktivitet visats korrelera med stark bindning till RNA och DNA. 14
Protocol
1. Framställning av väsentlig, nukleinsyror och proteiner
- Nucleic Acids
- Autoklav de 1,5 ml rör och lagra dem i en steril behållare. Utför varje steg använder sterila filterspetsar för att eliminera förorenande ämnen dvs nukleaser från laboratorie förbrukningsvaror.
- Förbered Tris-HCl 10 mM buffert pH 7,5 i DEPC-behandlat vatten och filtrera lösningen med ett 0,22 ^ m porstorlek filter.
- OBS: Oligonukleotiden kallas "TAR" motsvarar det korta (29-mer) RNA-sekvensen 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 medan cTAR är dess DNA komplementär sekvens 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'.
- Lösa både TAR och cTAR i Trisbuffert ovannämnda (1.1.2.) För att göra 100 iM stamlösningar. Store cTAR stamlösning vid -20 ° C (alikvoter kan lagras i flera månader under dessa förhållanden). För långtidslagring av RNA, gör 20 il alikvoter av TARförrådslösning, torka varje alikvot med användning av en vakuumkoncentrator centrifug och lagra dem vid -80 ° C. Färskt före användning, återsuspendera varje TAR alikvot i 20 | il DEPC-behandlat vatten.
OBS: Arbets TAR alikvoter kan lagras vid -20 ° C under två veckor.
- Lösa både TAR och cTAR i Trisbuffert ovannämnda (1.1.2.) För att göra 100 iM stamlösningar. Store cTAR stamlösning vid -20 ° C (alikvoter kan lagras i flera månader under dessa förhållanden). För långtidslagring av RNA, gör 20 il alikvoter av TARförrådslösning, torka varje alikvot med användning av en vakuumkoncentrator centrifug och lagra dem vid -80 ° C. Färskt före användning, återsuspendera varje TAR alikvot i 20 | il DEPC-behandlat vatten.
- NC protein och (12-55) NC-peptid
- Förbered fullängds rekombinant NC-protein som rapporterats. 16 Förvara stamlösning i alikvoter vid -20 ° C. Bestäm exakta proteinkoncentrationen med en UV-Vis spektrofotometer med användning av en extinktionskoefficient vid 280 nm av 6410 M -1 cm -1.
- Resuspendera syntetiska (12-55) NC peptid i Tris-HCl 10 mM pH 7,5 och lagra stamlösning i alikvoter vid -20 ° C. Bestäm de korrekta peptidkoncentration på en UV-VIS-spektrofotometer med användning av en extinktionskoefficient vid 280 nm av 5700 M -1 cm -1.
OBS: (12-55) NC-peptid erhölls HPLC renad och lyophilized ut ur en lösning innehållande två ekvivalenter av zinkklorid.
- Förening 1
- Väg ca 1 mg av den lyofiliserade föreningen 1 med användning av en analytisk balans och lös den i 100 ul av 100% DMSO, som lämpligen vägdes, för att erhålla en hög koncentration (≈10 mM) förrådslösning. Bestäm exakt föreningen koncentrationen på en UV-Vis spektrofotometer använda dess extinktionskoefficient (vid 354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Förvara stamlösning i mörker vid -20 ° C före användning.
2. Inrättande av Gel Apparater och Gjutning av Gel
- För att ställa in gelen, skölj två plattor (en lång och en kortare) med 70% etanol, låt dem torka och sedan placera två 1 mm distanser längs långsidorna i längre plattan; täck den med den korta plattan, och se till att anpassa de två plattorna i botten.
- Att gjuta gelen, följ instruktionerna från supplier (olika leverantörer använder något annorlunda apparater; smörgås klämmor och travar tillhandahålls av varje gjutapparat). I samtliga fall vara säker på att klämmor, stackar och packningar är rena, och avlägsna spår av akrylamid kvar av tidigare användare.
- Placera den monterade gelsandwich i gjutnings stå och följa specifika instruktioner av leverantören.
OBS: Vanligtvis en ren silikon packning i botten av gjutnings slitsen säkerställer en god tätning och bidrar till att undvika läckage när häller gelén. - Att leta efter läckor, häll destillerat vatten med en pipett mellan glasplattorna. Tillsätt vatten för att fylla upp smörgåsen och vänta några minuter för att se till att inga läckor förekommer. Om sandwich är korrekt monterad, ta bort vattnet och sätt i ett filterpapper mellan de två glasen torka glasen. Ta bort papperet och nu sandwich är klar för gelgjutning.
- Häll gelen i rumstemperatur (RT, 25 ° C). Eftersom polyakrylamid är mycket neurotoxiskt, handskar. Osse kontinuerlig 12% polyakrylamidgeler i icke-denatureringen (native) villkor för att utföra NAME analys.
- Bered gellösning 12%: Blanda 12 ml av 40% akrylamid / bisakrylamid (19/1) lösning, 4 ml TBE 10x buffert (10x: Tris-HCl 890 mM, Borat 890 mM, EDTA 20 mM) och 24 ml MilliQ vatten . Lägg 400 pl APS och 50 pl TEMED omedelbart före användning. Blanda lösningen och snabbt använder en pipett för att hälla lösningen ned mellan glasskivorna. Introducera kammen mellan glasskivorna, för att undvika bubblor. Lägg gel lösning för att fylla smörgås helt.
- Låt gelén polymerisera under 45 min till 1 h. Omedelbart före prov lastning, ta bort kammen långsamt och skölj brunnar noggrant med destillerat vatten.
- Efter polymerisationsbetingelserna och brunnar sköljsteg, följ särskilda instruktioner från leverantören att släppa gelsandwicharrangemanget i apparaten för vertikal gelelektrofores. Om ett kylsystem är närvarande, se till att placera gelsystemet i correkt position kylnings kärnan.
- Om systemet är utformat för att hantera mer än en gel, men endast en gel måste köras, bifoga en gelsandwich som buffert damm till kylnings kärnan på den andra sidan för att bilda den kompletta övre buffertkammaren.
OBS: Om dammen inte är placerad på rätt sätt, kommer den övre buffert läcka eventuellt stoppa gelen springa. - Bered 2,5 L av TBE rinnande buffert (1x: Tris-HCl 89 mM, borat 89 mM, EDTA 2 mM) i avjoniserat vatten. Ställ isär ca 500 ml TBE buffert för den övre buffertkammaren och häll resten i den undre buffertkammaren. Häll resterande 500 ml TBE-buffert i den övre buffertkammaren.
- Placera locket på toppen av den undre buffertkammaren, så att anoden och katoden är i lämpligt läge.
- Anslut kylnings kärnan, om närvarande, till en vattenkran använder slangar. Fyll kärnan med kranvatten, vilket kommer att fungera som en värmesänka under elektrofores, och låt kranvatten cirkulera genom kärnan under utvaldarophoresis.
3. nukleokapsiden Annealing-medierad elektrofores (NAME) analys
- Framställning av buffertar
- Bered TNMG buffert (1x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (CIO4) 2 1 mM, pH 7,5) i DEPC-behandlat vatten och filtrera lösningen med ett 0,22 ^ m porstorlek filter.
OBS: TNMG buffert kan lagras vid 4 ° C upp till 7 dagar. För bästa fällbara och glödgning resultat rekommenderar vi användning av nybakade buffertar. - Förbered gelladdningsbuffert innehållande SDS (GLB SDS: Tris-HCl 100 mM, EDTA 4 mM, 50% vikt / volym glycerol, 2% vikt / volym SDS, 0,05% vikt / volym bromfenolblått) i DEPC-behandlat vatten.
OBS: GLB hjälper till att spåra hur långt oligonukleotider proverna körs in i gelsystemet och tillåter att sjunka proverna in i gelén. Tillsats av SDS till GLB är ett kritiskt steg för optimal framgång NAME analys. Om detta steg inte följs, är det inte möjligt att särskilja nukleinsyror bandet i GEl systemet (figur 2).
- Bered TNMG buffert (1x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (CIO4) 2 1 mM, pH 7,5) i DEPC-behandlat vatten och filtrera lösningen med ett 0,22 ^ m porstorlek filter.
- Reglage beredning
- Späd seriellt de oligonukleotider stamlösningar och använda nybakade 10 iM lösningar för att förbereda 10 pl av en 1 ^ M lösning av TAR. Framställes på samma sätt, var för sig, 10 | il av en 1 | iM cTAR i TNMG 1x buffert. Värm varje rör till 95 ° C under 5 min och låt sedan svalna till RT för att tjära och cTAR att ta sitt stam-bula-slingstrukturer.
- Bered 1 iM lösning av hybrid TAR / cTAR som kontroll. Blanda 1 pl av 10 pM TAR med en pl av 10 pM cTAR i TNMG 1x, i en total volym av 10 | il. Denaturera oligonukleotiderna genom upphettning av röret till 95 ° C under 5 min och låt den långsamt svalna till RT för att TAR att para till dess komplementära sekvens cTAR och bilda den dubbelsträngade hybrid TAR / cTAR.
- När lösningarna kyls till RT, utföra en kort centrifugecentrifugering. Lägg 3 pl GLB SDS, pipett each lösning inuti röret 3 gånger och sätta röret på is. Håll kontrollproverna stadigt på is tills lastningssteget.
- Prover förberedelser för att analysera NC protein och (12-55) NC-peptid aktivitet
- Använd 2,5 pl nybakade 4 iM oligonukleotidlösningen för varje prov. Förbereda alltid lite överskotts mängd av varje lösning för att förhindra pipetteringsfel. Vik 32.5 pl 4 iM lösning av tjära och, separat, för cTAR i TNMG 1x buffert som rapporterats för beredningen kontroller ovannämnda (steg 3.2.1.).
- Späd stamlösningen av både NC protein och (12-55) NC-peptid till 80 ^ M-lösning med MilliQ vatten.
- När TAR och cTAR lösningar kyls till RT, utföra en kort spin centrifugering av båda rören och börja förberedelserna av proverna rören.
- Förbered 12 tomma 0,5 ml autoklaveras rör. Placera 3 rader med 4 rör i rack för labbprover. Varje rad visar respektive proverna att analysera the fullängds NC-protein, proverna utan protein och proverna att analysera (12-55) NC-peptid aktivitet.
- Byt alltid tips när en annan reagens används.
- Lägg i varje rör 2.5 pl vikta TAR och 2.5 pl vikta cTAR. Lägg 4 l DEPC-behandlat vatten till proverna för analys av NC och (12-55) NC. Lägg 5 il DEPC-behandlat vatten till de andra proven.
- Tillsätt 1 pl 80 iM NC eller 1 pl av 80 ^ M (12-55) NC till proven för respektive NC eller (12-55) NC-analys.
- Lägg omedelbart 3 pl GLB SDS till tid 0 min prover (redovisas som 0 "i figur 1), pipet lösningen inuti varje rör 3 gånger, och till slut satte röret på is. Upprepa detta steg för alla prover och kontroller. Förvara proven stadigt på is tills lastningssteget.
- Efter 15 min, 30 min och 1 h inkubation vid RT, tillsätt 3 | il GLB SDS, pipettera lösningen inuti each röret 3 gånger och sätta röret på is. Upprepa detta steg för alla prover och kontroller, respektive, och hålla på is tills laddningssteget.
- Avlägsna locket på gelapparat. Belastning 13 pl av varje prov i brunnarna bildas såsom tidigare beskrivits genom att gjuta gelén med en väl bildande kammen. Ladda proverna i den ordning rapporteras i figur 1.
- Sätt tillbaka locket av gelén apparaten. Fäst kablar till gelapparat till strömförsörjningen. Kontrollera att elektroderna är ansluten till rätt spår i strömförsörjningen.
- Slå på strömmen och kör gelén för 2 h och 30 min vid en konstant spänning av 200 V, tills färgen har migrerat till 1,5 cm ovanför botten av gelén.
- Provberedning för analys antrakinon aktivitet på NC och (12-55) NC
- Späd föreningen en förrådslösning. Förbered 10 ìl av 500 iM, 250 iM, 50 ^ M, 5 iM utspädning av förening <strong> 1 i MilliQ vatten.
- Förbered kontrollprover som redovisas ovan (punkt 3.2.).
- Använd 2,5 pl nybakade 4 iM oligonukleotidlösningen för varje prov. Förbereda alltid lite överskotts mängd av varje lösning för att förhindra pipetteringsfel. Vik 27,5 pl 4 iM lösning av tjära och, separat, för cTAR i TNMG 1x buffert som ovan nämnts (steg 3.2.1.).
- Späd stamlösningen av både NC protein och (12-55) NC-peptid till 80 ^ M lösning i vatten.
- När TAR och cTAR lösningar kyls till RT, utföra en kort spin centrifugering av båda rören och börja förberedelserna av proverna.
- Förbered 20 tomma 0,5 ml autoklaveras rör. Placera två rader med 10 tuber vardera i rack för labbprover.
- Byt alltid tips när en annan reagens används.
- Lägg varje rör i första raden med 2,5 pl vikta TAR. Lägg varje tub av den andra raden med 2,5 pl vikta cTAR.
- Efter 15 min inkubation, blanda cTAR prover (rör av andra raden) med korrespondent TAR prover (rör av första raden).
- Tillsätt 1 pl 80 iM NC eller 1 pl av 80 ^ M (12-55) NC till proverna för NC eller (12-55) NC-analys, respektive.
- Efter 15 min inkubation, tillsätt 3 | il GLB SDS, pipettera varje rör 3 gånger och placera sedan röret på is. Upprepa detta steg, respektive, med hjälp av prover för NC och (12-55) NC-analys. Förvara proven stadigt på is tills lastningssteget.
- Avlägsna locket på gelapparat. Ladda 13 | il av varje prov i brunnarna. Ladda proverna i den ordning rapporterats i figure 3B.
- Sätt tillbaka locket av gelén apparaten. Fäst kablar till gelapparat till strömförsörjningen. Kontrollera att elektroderna är ansluten till rätt spår i strömförsörjningen.
- Slå på strömmen och kör gelén för 2 h och 30 min vid en konstant spänning av 200 V, tills färgen har migrerat till 1,5 cm ovanför botten av gelén.
- Späd föreningen En stamlösning. Förbered 10 pl av de 500 iM, 250 iM, 50 ^ M, iM utspädning av förening 1 i MilliQ vatten 5.
- Förbered kontrollprover som redovisas ovan (punkt 3.2.).
- Använd 2,5 pl av 4 pM oligonukleotid lösning för varje prov. Förbereda alltid lite överskotts mängd av varje lösning för att förhindra pipetteringsfel. Vik 27,5 pl 4 iM lösning av tjära och, separat, för cTAR i TNMG 1x buffert som ovan nämnts (steg 3,20,1.).
- Späd stamlösningen av både NC protein och (12-55) NC-peptid till 80 ^ M lösning i vatten.
- När TAR och cTAR lösningar kyls till RT, utföra en kort spin centrifugering av båda rören och börja förberedelserna av proverna.
- Byt alltid tips varje gång reagenser ändras eller om någon annan vätska eller lösning som finns i reaktionsröret vidrörs.
- Från detta steg på se till att tydligt märka och separera proverna för de två olika förinkubation förfaranden.
- Oligo-förinkubering läge
- Förbered 10 tomma 0,5 ml autoklaveras rör. Placera två rader med fem tuber i rack för labbprover.
- Lägg i varje rör i den första raden 2,5 pl vikta TAR. Lägg i varje rör i den andra raden 2,5 pl vikta cTAR.
- Lägg 2 pl av den lämpliga föreningen 1 utspädning (ökande koncentration från 5 um till 500 um utspädning) till TAR och till cTAR.Byt förening med vatten i proverna för analys av NC i frånvaro av föreningen. Inkubera proverna i 15 min vid RT.
- Efter 15 min inkubation, ta cTAR prover (andra raden) och lägg dem med de korrespondent TAR proverna (varv).
- Lägg ett pl av 80 pM NC till varje prov och inkubera proverna under 15 min vid RT.
- Efter 15 min inkubation, tillsätt 3 | il GLB SDS, pipettera varje rör 3 gånger och placera sedan röret på is. Förvara proven stadigt på is tills lastningssteget.
- NC-preinkubation läge
- Förbered 5 tomma 0,5 ml autoklaveras rör och placera dem i rack för labbprover.
- Lägg i varje rör 4 pl av lämplig förening 1 utspädning (ökande koncentration från 5 um till 500 um utspädning). Byt förening med vatten i proverna för analys av NC i frånvaro av föreningen.
- Lägg i varje rör 1 yl 80 μ; M NC och inkubera proverna under 15 min vid RT.
- Blanda 15 pl av vikta TAR med 15 ul av vikta cTAR i ett rör och använda denna TAR + cTAR lösning i nästa steg.
- Efter 15 min inkubation, lägg till varje prov 5 ^ il av TAR + cTAR Blanda lösning och inkubera proverna under 15 min vid RT.
- Efter 15 min inkubation, tillsätt 3 | il GLB SDS, pipettera varje rör 3 gånger och placera sedan röret på is. Förvara proven stadigt på is tills lastningssteget.
OBS: Från steg 3.5.8 på, kan analysen utföras med alla prover (CV från 3.5.7).
- Oligo-förinkubering läge
- Avlägsna locket på gelapparat. Ladda 13 | il av varje prov i brunnarna. Ladda proverna i den ordning som anges i fig 4.
- Sätt tillbaka locket av gelén apparaten. Fäst kablar till gelapparat till strömförsörjningen. Kontrollera att elektroderna är ansluten till rätt spår i kraft supply.
- Slå på strömmen och kör gelén för 2 h och 30 min vid en konstant spänning av 200 V, tills färgen har migrerat till 1,5 cm ovanför botten av gelén.
4. Ta bort Gel och Gel färgning
- Efter elektrofores, stäng av strömmen och koppla bort de elektriska ledningarna. Stäng av vattenkranen i kylsystemet och koppla slangarna från kärnan.
- Ta bort locket, och, om systemet kyldes, avlägsna kylnings kärnan och häll bort bufferten från båda kamrarna.
- Isär försiktigt gelsandwichen från apparaten och ta bort alla klämmor från glasplattorna. För att ta bort gelen från plattorna, skjuta en av distanserna ut till sidan av plattorna och vrid den försiktigt för att dra upp och bort den övre glasskivan. Fatta två hörn av gel och lyft av den försiktigt för att ta bort den från glaset.
- Placera gelén i en lämplig behållare med den önskade nukleinsyror färgningslösning för30-45 min med omröring.
- Efter färgning, satte gelen på ett genomlysningsbildsystem för att upptäcka nukleinsyror fluorescenssignal i gelsystemet.
Representative Results
Figur 1 visar ett representativt resultat av nukleokapsiden Glödgning Mediated Elektrofores (NAMN) analys, som utförs i) med fullängds-rekombinant protein, ii) utan proteinet, dvs blandning cTAR + TAR och inkubation upp till en timme vid RT, och iii ) samma analys utfördes med (12-55) NC, en syntetisk peptid som saknar de 11 aminosyrorna i N-terminala domänen. Den färdigvikta TAR och cTAR blandades och bildandet av glödgat hetero TAR / cTAR övervakades i närvaro av den fullängds rekombinant NC (vänster körfält i figur 1), i frånvaro av protein (centrala körfält i figur 1 ), och i närvaro av de trunkerade (12-55) NC peptid (höger körfält i figur 1). Kontrollerna är: vikta cTAR, vikta TAR, och glödgade hybrid (TAR / cTAR), som erhållits genom termisk denaturering av stabilt vikta strukturer TAR till cTAR följt av deras långsamma annealing. 14
Förmågan hos NC att denaturera två stabila nukleinsyrasekvenser i den förlängda heteroduplexen helixen är uppenbar: fullängds NC-proteinet leder omedelbart till bildning av TAR / cTAR hybrid: 0 'indikerar den minimala tid som passerar mellan tillsats av NC till proverna och tillsats av gelladdningsbuffert, som stoppar reaktionen; fullständig bildning redan uppnås efter 15 'inkubationstid. Ökningen av intensiteten hos den glödgade heteroduplexen paralleller minskningen i intensiteten för de vikta cTAR och TAR-oligonukleotider. Den heteroduplexbildning uppnås också i närvaro av den stympade formen, det vill säga den (12-55) NC, vilket bekräftar den biologiska aktiviteten hos den syntetiska peptiden. I frånvaro av proteinet eller av peptiden den heteroduplexbildning observeras inte, och tjära och cTAR oligonukleotider kommer inte glödga vid rumstemperatur in i heteroduplex (fig 1). Ialla experiment, den snabba bildandet av instabila intermediärer ("mellan komplex" i figur 1) som minskar med tiden observeras, konsekvent med det föreslagna av strängutbyte genom hårnålar i cTAR och TAR tills rätt nukleinsyror fällbara mekanismen. 17
En möjlig felsökning av experimentet är bristen på SDS i gelladdningsbuffert. I frånvaro av SDS i GLB resultatet av reaktionen visas i figur 2 och i förhållande till resultatet med GLB + SDS. Den förvikta TAR och cTAR blandades och inkuberades under 3 h vid RT för för 3 h vid 37 ° C med det rekombinanta fullängds NC-proteinet. Efter inkubering proven delades i två: till en halv gelladdningsbuffert utan SDS (GLB) sattes, medan till den andra halvan GLB var med SDS (GLB SDS). Prover laddades på gelén, och positionen av nukleinsyrorna banden visualiserades efter gelén som drivs avfärgämne färgning. När NC var närvarande men proverna var lastade med GLB, alla nukleinsyror band flyttas upp: detta förväntas och indikerar en stark bindning mellan proteinet och nukleinsyror. Resultaten med GLB SDS visas i den längst till höger på gelén: tillsatsen av SDS denaturerar proteinet och frisätter de nukleinsyror från den stabilt komplex med proteinet, vilket gör att jämförelser med kontrollerna.
Den NAMN analys används för att bedöma förmågan hos gäng interkalatorer att stabilisera dynamiska nukleinsyrastrukturer och inhiberar NC chaperon-aktivitet. 14 Gäng interkalatorer är plana aromatiska molekyler substituerade med skrymmande sidokedjor är belägna vid de motsatta platser i ringsystemet, såsom antrakinon visas i figur 3A. 18 Dessa interkalatorer kan trä igenom dubbelhelixen av nukleinsyror, slutligen hitta deras sidokedjor i varje spår av den dubblahelixen. 19,20
Figur 3B visar resultatet av NAME analysen i närvaro av förening 1, en känd gäng interkalator, 18 i närvaro av fullängds NC eller den stympade peptid. I båda fallen är bildandet av TAR / cTAR hybrid av NC minskas genom att öka koncentrationen av interkala, medan, samtidigt, mängden fritt TAR och cTAR ökar. Den trunkerade formen av proteinet som saknar den N-terminala svansen (12-55NC) är mer känslig för hämning av dess aktivitet: denna skillnad verifierades med alla testade hittills föreningar.
Den NAMN analys kan utföras på två sätt, antingen genom förinkubering av testföreningen med NC, följt av tillsats av de vikta oligonukleotider (NC-förinkubering mode), eller genom förinkubering av testföreningen under 15 min med de vikta nukleinsyrasubstrat , följt av tillsats av NC och en ytterligare inkubation under 15 min (oligo-preincubation läge). Även om den totala inkubationstiden är densamma i de två olika lägen, den förinkubation med de vikta oligonukleotiderna före tillsats av NC ger mer tid för gängning av de interkalatorer i den vikta nukleinsyran. Detta resulterar i en starkare stabilisering av deras dynamiska strukturer och in i en enklare hämning av NC eskorte aktiviteter. Analysen av NAME-analysen i de två lägena förbättrar därför skillnader i verkningsmekanismen för NC-hämmare, som visas i figur 4: När förening 1 analyserades med namn i oligo-förodling läge (Figur 4, köer vid vänster) det visar potent hämning av NC-medierad glödgning, medan mycket lägre hämning i NC-förodling läge (Figur 4, körfält vid rätt). Observera att för bestämning av hämmande koncentrationer medan screening uppsättningar besläktade föreningar med denna analys och i dessa villkor, var experining måste utföras i minst tre exemplar med hjälp tätt placerade koncentrationer (särskilt runt IC 50 värde). 14
Figur 1:. NAME analys med full längd NC och med trunke (12-55) NC Vikta TAR och cTAR, vardera 1 iM, inkuberades med rekombinant NC eller med (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) för 0 min, 15 min, 30 min och 1 h. TAR och cTAR inkuberades i frånvaro av protein (0 min, 15 min, 30 min och 1 timme) användes som negativ kontroll. Vikta TAR, vikta cTAR och hybrid TJÄRA / cTAR erhålls efter termisk denaturering, följt av in vitro-glödgningen användes som kontroller. Reaktionerna sedan slutat använda GLB SDS. Prover upplöstes på en 12% polyakrylamidgel i TBE 1x; efter elektrofores nukleinsyror på gelén färgades och upptäcks på en transilluminator.
Figur 2:. Effekt av SDS i gelladdningsbuffert (GLB) vid analys TAR / cTAR glödgning vid NC TAR och cTAR, förvikt i TNMG 1x, inkuberades med full längd rekombinanta NC (oligos / NC = 1/8) för 3 h vid rumstemperatur eller vid 37 ° C. GLB eller GLB SDS sattes sedan till proverna inkuberade med NC. Kontroller: TAR, cTAR och glödgade hybrid TAR / cTAR (vardera 1 M). Elektrofores utfördes med användning av en 12% polyakrylamidgel i TBE 1x; efter elektrofores nukleinsyror på gelén färgades och upptäcks på en transilluminator. Denna siffra har modifierats Figur S4 av:. Sosic, A. et al design, syntes och biologisk utvärdering av tjära och cTAR bindemedel som HIV-1 nukleokapsidproteiner hämmare MedChemComm 4, 1388-1393, doi:. 10,1039 / c3md00212h (2013) .
Figur 3: (A) Kemisk struktur för framförings interkalator 1. (B) Effekt av gäng interkalator en bedömas genom NAME-analys. Vikta TAR och cTAR, vardera 1 iM, inkuberades i närvaro av de angivna koncentrationerna av föreningen 1 med full längd NC eller med (12-55) NC, varje 8 iM. Vikta TAR, vikta cTAR och förlängt hetero TAR / cTAR användes som kontroller. Reaktionerna sedan slutat använda GLB SDS. Prover upplöstes på en 12% polyakrylamidgel i TBE 1x; efter elektrofores nukleinsyror på gelén färgades och upptäcks på en transilluminator.
Figur 4: Oligo-preinkubering kontra NC-preinkubationsmetoder lägen: effekter på NAME analys Oligo-preinkubation mod.e: vikta TAR och vikta cTAR, vardera 1 iM, förinkuberades med de angivna koncentrationerna av gäng interkalator 1 för 15 minuter, och sedan ytterligare 15 minuter i närvaro av full längd NC (8 M) NC-preinkubation. läge: de angivna koncentrationerna av gänginterkalatorn en förinkuberades med fullängds-NC (8 fiM) under 15 min, och därefter under ytterligare 15 min i närvaro av vikta TAR och vikta cTAR, vardera 1 | iM. Vikta TAR, vikta cTAR och förlängt hetero TAR / cTAR användes som kontroller. Alla reaktioner äntligen slutat använda GLB SDS. Prover upplöstes på en 12% polyakrylamidgel i TBE 1x; efter elektrofores nukleinsyror på gelén färgades och upptäcks på en transilluminator.
Discussion
NAME är en analys som gör det möjligt att snabbt bedöma inhibitionen av kaperonet aktiviteten för nukleokapsidproteinet från HIV-1, ett intressant mål i sökandet efter nya anti-HIV-läkemedel. NC annelerar snabb och vid rumstemperatur nukleinsyror vilkas stabil vikning annars skulle kräva termisk denaturering vid hög temperatur följt av försiktig glödgning. Analysen kan utföras med antingen fullängds NC eller med trunke (12-55) NC: i båda fallen de två nukleinsyror (RNA och dess komplementära DNA-kopia) glödgas snabbt. Detta överensstämmer med litteratur observation med den stympade NC peptid: glödgning initieras genom effektiv smältning av stammen av cTAR följt av interaktion av dess komplementära apikala loop, som är en svag NC-bindningsställe, med den komplementära sekvensen av tjära apikala slinga, hamna genom flera instabila intermediärer till förlängt glödgade hybrid. 21
NC är en mycket stabil protein och få problem när de utför NAME kunde inträffa. Det är mycket viktigt men att lägga nybakade SDS i gelladdningsbuffert används för att stoppa reaktionen: Om detta inte uppnås, kommer gelen inte visa nukleinsyra banden på rätt positioner. I själva verket är NC ett nukleinsyrabindande protein, så att för att korrekt visualisera TAR / cTAR heteroduplexet genom gelelektrofores SDS måste vara närvarande i gelladdningsbuffert att denaturera proteinet och frigöra den från dess snäva komplex med nukleinsyrorna. Detta är också en möjlig felsökning av experimentet, dvs bildandet av skiftade band under gelén körningen. Denna effekt är särskilt tydligt när det fullängds NC anställdes, som i figur 2, och är kopplad till förekomsten av den mycket grundläggande N-terminal svans, som har en stark aggregerande effekt på nukleinsyror.
Närvaron av den terminala grund svansen gör glödgning reaktionen svårare att inhiberas, eftersom shown i figur 3 med hjälp förening 1, en representativ gäng interkalator, dvs en interkalator särskilt effektiva på att stabilisera stammen-loop strukturer TAR och i cTAR. I själva verket är denna typ av interaktion med nukleinsyror gynnas när utbuktningar och loopar avbryta dubbelhelixen kontinuitet, vilket möjliggör en enklare gängning av de skrymmande substituenterna i basparen. Stabilisering av tjära och cTAR av dessa nukleinsyra-bindemedel har tidigare analyserades genom bestämning av ökningen av smälttemperaturen för de två oligonukleotiderna. 14 Dessutom, korrelerar med hämning av glödgning katalyserad av HIV-1 NC ökningen i smälttemperatur, leder till minskad bildning av hetero TAR / cTAR och indikerar att gäng interkalatorer är en intressant klass av bindemedel för dynamiska strukturer av RNA som TAR elementet. 14
Verkningsmekanismen åberopas för dessa kompoFONDERNA kan valideras ytterligare genom att utföra NAMN analysen i olika alternativa format, såsom visas i figur 4: i fallet med interkalatorer inhibitionen av glödgat heteroduplexen förstärks när läkemedlet inkuberas med de två vikta oligos. Föreningar som verkar med annan verkningsmekanism, såsom direkta bindemedel i NC-proteinet, skulle påverkas mindre av de olika förinkubationen läget. NAME analys utförs i de två metoderna därför kan användas för att screena bibliotek av föreningar för identifiering av NC-hämmare, och även för att bedöma den förmodade verkningsmekanismen för de positiva träffar samtidigt söka efter anti-HIV-läkemedel riktade till NC. Det är uppenbart att användningen av dessa tekniker ensamma när de ansöker om en specifik verkningsmekanism av identifierade NC-hämmare inte är tillräcklig, och andra lämpliga biokemiska analyser behövs för att upprätthålla arbetshypotesen. 14
Slutligen måste det understrykas att NAME använder mycketrenade enzymer, antingen rekombinanta eller syntetiska, som ger värdefull information om den "in vitro" inhibering av NC av de testade föreningarna. Detta är den "styrkan och svagheten" i analysen: NAME kan väl komplettera virtuell screening och molekylär modellering i de preliminära stegen av läkemedelsforskning program, som gör det möjligt att snabbt bygga och analysera struktur-aktivitetssamband och så småningom omdirigera syntes och läkemedelsdesign. Men som andra biokemiska analyser används i läkemedelsprojekt i hiv, NAME kommer inte att ge information om effekterna av förmodade inhibitorer i virusinfekterade celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock solution at -20 °C | |
| TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock aliquot at -80 °C | |
| (12-55)NC peptide | EspiKem srl | Store the stock solution at -20 °C | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | Autoclave before use |
| 0.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 121 023 | Autoclave before use |
| Biosphere Filter Tips 0.1-10 µl | Sarstedt | 701,130,210 | |
| Biosphere Filter Tips 2-20 µl | Sarstedt | 70,760,213 | |
| Biosphere Filter Tips 200 µl | Sarstedt | 70,760,213 | |
| Syringe Filter 0.22 µm | Biosigma srl | 51,798 | |
| Ethanol | Carlo Erba | 414631 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | 71725-50G | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-1L | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71376-1KG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252-2.5KG | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Magnesium Perchlorate | Sigma-Aldrich | 222283-100G | Store the 1 M solution at -20 °C |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49770-1L | |
| Bromophenol Blue | GE Healthcare Life Sciences | 17-1329-01 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-100ML | |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A7460-500G | Prepare the 10% solution freshly before use |
| Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) | Merck Millipore | 1006401000 | Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting |
| Tris ultrapure | Applichem | A1086,1000 | |
| DEPC-treated water | Ambion | AM9922 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 22,621,408 | |
| NanoDrop 1000 spectrometer | Thermo Scientific | ||
| UV-VIS spectrometer Lambda 20 | Perkin Elmer | ||
| Protean II xi Cell | Bio-Rad | 165-1803 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| SybrGreen II RNA Gel Staining | Lonza | 50523 | Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4 °C for two weeks. |
| Geliance 600 Imaging System | Perkin Elmer |
References
- Druillennec, S., et al. A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).
- Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus. Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).
- Thomas, J. A., Gorelick, R. J. Nucleocapsid protein function in early infection processes. Virus Res. 134, 39-63 (2008).
- Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function. RNA Biol. 7, 724-734 (2010).
- Zeng, Y., et al. Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).
- Basu, V. P., et al. Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription. Virus Res. 134, 19-38 (2008).
- Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA. J Virol. 71, 5178-5188 (1997).
- Godet, J., Mely, Y. Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein. RNA Biol. 7, 687-699 (2010).
- Darlix, J. L., et al. Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).
- Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1. Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).
- Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).
- Beltz, H., et al. Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).
- Mori, M., et al. Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1. Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.
- Sosic, A., et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).
- Tabarrini, O., et al. Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives. Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).
- Hagan, N., Fabris, D. Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element. Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).
- Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease. Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).
- Zagotto, G., et al. Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates. Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).
- Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution. Chem Biol. 10, 663-672 (2003).
- Gooch, B. D., Beal, P. A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides. J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).
- Kanevsky, I., et al. Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).
