Summary
Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder.
Abstract
Direk Hücreler (MC) oluşan önceden ve yeni sentezlenmiş, alerjik iltihap ve bağışıklık mediatörler salgılayarak kendi fizyolojik ve patolojik fonksiyonlarını yerine bağışıklık sisteminin salgı hücreleri bulunmaktadır. MCnin arabulucular alerjik ve bağışıklık yanıtları sonuçlanan birden dokuları ve organları etkiler. MC aracıların sentezi, depolama ve serbest derece düzenlenir. Önceden oluşturulmuş arabulucular plazma zarı ile kaynaştırmak ve düzenlenmiş ekzositoz kendi içeriğini serbest sitoplazmik salgı granülleri (SG) paketlenir. SGS hedeflenen endojen SG aracıların yanında düzenlenmiş bir şekilde serbest bırakılan bir raportör gen ile ilgi konusu bir genin ortak ifadesine dayalı bir protokol, mevcut. protokol MC SG- analizleri ve tetiklenen ekzositoz için biyogeneze kendi zaman çizelgesini takip yüksek çözünürlüklü dört boyutlu konfokal sağlar. Böylece, inter genleri taranması için bu protokolü kullanarakkendi fenotipik ve fonksiyonel etki için est MC SG- ve biyogenezi ve ekzositoz düzenleyen moleküler mekanizmaları deşifre ve ilgili düzenleyici belirlenmesi sağlar. Böylece, sağlık ve hastalık MCs işlevi hesap hücresel mekanizmaları içine daha fazla anlayışlar sağlanmalıdır.
Introduction
Direk Hücreler (MC), en iyi, artrit, astım, eozinofilik özofajit, kronik dermatit ve koroner arter hastalığı 3,5 ve anafilaktik şok 1,2 yanı sıra diğer patolojiler gibi alerjik ve iltihabik reaksiyonlarda katılımı için bilinen bağışıklık hücreleri Kanser 3,4. Buna ek olarak, MH'si allogreft toleransı 5,6 uyaran örneğin, bakteri ve parazitlere karşı konak savunmasında ve bağışıklık tepkilerinin bastırılması hem doğuştan ve edinilmiş bağışıklık önemli rol oynamaktadır.
AN + / CD117 + pluripotent progenitör hücrelerin CD34 7 gelişen, kemik iliğinden köken. Taahhüt kemik iliği MC ataları kana salınan ve bağ doku ve epitel yüzeylere 8 içinde ağırlıklı olarak lokalize periferik dokulara göç vardır. Olgunlaşma ve terminal farklılaşma sonunda etkisi o altında elde edilirÇevredeki ortam 8,9 içinde f sitokinler.
AN olan karşılaşma immunglobulin E (IgE) üretimi sonuçlandı antikorlar yazın bir alerjene (antijen, Ag) tarafından aktive edilebilir. Aynı Ag yeniden maruz kaldıktan sonra IgE bağlı hücre çapraz bağlanması, ardından MC'nin FcεRI reseptörlerine IgE bağlanması, FcεRI birikmesi ve hücre degranülasyonu sonuçlanan bir sinyal akışının başlamasında sonuçları [10,11 gözden] . AN da nöropeptidler 5,12 ile, bağımsız olarak IgE, aktive edilmiş 13, bakteriyel ve viral antijenlerin 14,15, toplu olarak, temel salgı bağışıklık hücreleri ve sitokinler 5,13,12,16 olarak adlandırılır, pozitif yüklü bir dizi peptit toksinlerdir , 17. AN ayrıca inflamatuar yanıtı yükseltmek, kendi serbest aracıların, birçok kişi tarafından aktive edilir.
AN immuno ihtiva salgı granülleri (SGS) ile paketlenirBu tür kimaz ve triptaz, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve çeşitli sitokinler ve kemokinlerin 8,9 gibi histamin ve (kemirgenlerde) serotonin vazoaktif aminler, proteoglikanlar, proteazlar da dahil olmak üzere düzenleyici aracılar. Bu aracılar "gitmeye hazır" ve MH'si uygun bir uyaran ile aktive kez, bu arabulucuların dakika 18,19 saniye bir konuda düzenlenen Ekzositoz (degranülasyona) hücrelerden salınır. Bu ilk etkinlik arakidonik asit metabolitlerinin, çoklu sitokinler ve kemokinlerin 20,21,22 de dahil olmak üzere, biyolojik olarak etkili maddeler, geniş bir dizi de novo sentezi ve serbest izlemektedir. Yeni sentezlenen ürünlerin Yayın bağımsız SG sürümü oluşur. Toplu olarak, bu aracılar, erken ve geç faz enflamatuar ve alerjik cevap başlar. Bu nedenle, MC aktivasyonu ve degranülasyonu muhasebe mekanizmalarının anlaşılması teorik ve klinik imp hemortance.
genetik birincil ve kültürlü MCs işlemek için zorluk zayıf çözülmesi kaldı MC degranülasyonu yatan mekanizmaları, aydınlatmak için girişimlerini engellemiştir. Ilgi konusu bir gen ile bu sorunun üstesinden gelmek için, biz eş zamanlı olarak transfekte mukozal mast hücre çizgisi, fare bazofilik lösemi bir raportör göre bir deney geliştirildi (RBL) -2H3 (burada RBL olarak anılacaktır) ya da kemik iliğinden elde edilen AN (BMMC'ler), 30 ve nöropeptid Y (NPY), bir SG muhabir olarak, monomerik RFP (MRFP) erimiş.
NPY önce diğer sistemlerde endojen SG belirteçleri davranışını özetlemek gösterilmiştir. MRFP floresan duyarsız pH ifadesi çünkü Ayrıca, NPY-MRFP 96 oyuklu plakalar bir floresan plaka okuyucu kullanarak asidik SG- görselleştirilmesi gibi ekzositozu kantitatif bir değerlendirmesini sağlamaktadır. O NPY-MRFP RBL hücrelerinde ve BMMC'ler asidik SG- teslim olduğunu göstermiştir ve hücreler salınırendojen SG kargo (yani, β-heksosaminidaz ve serotonin) 30, 32 yanında düzenlenmiş moda. Bu protokol kendi fenotipik ve RBL hücrelerinde 32 SG özellikleri ve degranülasyonunun fonksiyonel etkisi ilgi tarama genleri izin veren bir yüksek-çözünürlüklü görüntüleme bazlı bir metodoloji sağlar. Özellikle, bu protokol gerçek zamanlı MC SG- izleme ve kendi alanında veya hacim büyüklüğü, sayısı, montaj kinetik, hücre hücre iskeletinin boyunca onların hareket ve farklı koşullar altında plazma zarı ile nihai füzyon kantifizasyonunu. Örneğin, DNP spesifik IgE ile hücrelerin duyarlılaştırılması farklı düzensizlikler altında bir çok-Ag (DNP konjuge serum albümini) ile hücrelerin tetiklenmesi (yani, ağırlık veya mutant gen ekspresyonuna ya da farmakolojik manipülasyonlara fazla ilgi genlerinin yok etme) ve kontrol hücreleri ile mukayese etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RBL hücre kültür ortamının hazırlanması 1.
- (Bu durum, örneğin% 1 PEST) yapar (bu% 10 FBS yapar) cenin sığır serumu, 56 ml düşük glikoz Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM), 500 ml karıştırın ve penisilin streptomisin 5.5 mi ekleyin.
- 4 ° C'de 0.22 mikron gözenek büyüklüğüne ve mağaza ile 500-1000 ml Şişe-Üst Vakum Filtreler kullanarak ortamı Filtre.
RBL hücrelerinde 2. Kültür
- Ya da plakalar veya şişeler içinde, 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, RBL hücreleri büyütün. 10 cm plakalar içinde büyüyen RBL hücreleri 10 ml ortam ile takviye edilmiş ve ~ 10 7 hücre / levha konfluent tek tabaka oluşturmak gerekmektedir.
- Hücre tabakası birleştiği yaklaşan zaman, daha düşük bir yoğunlukta kültür Replate.
- Vakum bağlı steril pastör pipet kullanılarak plaka / şişeden kültür ortamı çıkarın.
- (37 prewarmed hücre tek tabaka durulayınTüm tek tabaka (hacim kültürü plakası / şişenin büyüklüğüne bağlıdır kapsayan ° C),% 0.25 tripsin / EDTA, 10 cm plaka 2 ml) eklenmiştir. Bu hücreleri ayırmak olacaktır.
- Alternatif olarak, fosfat hücre tek tabaka serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden durulama PBS kaldırmak ve / EDTA önceden ısıtılmış (37 ° C), tripsin ekleyin. Bu adım hızlı hücreleri ayırır.
- 37 ° C'de (en fazla 10 dakika) bir kuluçka makinesi içinde tabaka / içine yerleştirilir.
- Onlar müstakil varsa kontrol etmek için optik mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler 10 dakika sonra ayırmak olmadıysa, yavaşça plaka / balona dokunun.
- Hücrelerin süspansiyonu kültürü plakası / şişeye ortamı ilave edin (ortamının hacmi, en azından bir tripsin çözeltisinin hacmi daha büyük 2 misli olmalıdır).
- 25 ° C'de, 200 g, 3 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri.
- Orta hücrelerin tekrar. 01:10 hücreleri sulandırmak ve yeni bir kültür çanak tohum. Onlar reac kadar, 48-72 saat inkübe hücrelerih, yaklaşık% 90 birleşir.
- 3 aya kadar (30 pasajlar) için aynı prosedürü (bölüm 2.2.1-2.2.8) tekrarlayın.
Transfeksiyon Medya 3. hazırlanması.
- K-Borular, pH 7, Ca 2 + asetat, 1 mM çözeltisi ve Mg2 + asetat, 100 mM çözelti bir 100 mM çözelti hazırlayın.
- DMEM ortamı kullanılarak 20 mM içine K-Borular, pH 7, 100 mM'lik çözelti ile seyreltilir, 2 arasında nihai bir konsantrasyona kadar 10 uM ve Mg2 + asetat, 100 mM çözeltinin nihai bir konsantrasyona kadar Ca2 + asetat, 1 mM çözeltisi ekleyin mM.
- Potasyum glutamat tartılır ve 128 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için çözeltiye eklenir, iyice karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C'de tutun. -20 ° C'de kalan çözümleri (yani., K-Borular, Ca 2+ asetat, Mg 2+ asetat) tutun.
RBL hücrelerinde 4. transfeksiyonu
- Bir kullanarak plakası / şişesi kültür ortamı çıkarınvakum bağlı steril pastör pipet.
- Tüm tek tabaka kapsamalıdır önceden ısıtılmış (37 ° C) tripsin / EDTA ile hücre mono tabakasının durulayın. 37 ° C'de (en fazla 10 dakika) bir kuluçka makinesi içinde tabaka / içine yerleştirilir. Hücreler, optik mikroskop kullanılarak müstakil varsa kontrol edin.
- Hücrelerin süspansiyonu kültürü plakası / şişeye ortamı ilave edin (ortam hacmi tripsin çözeltisinin hacmine göre en az 2 daha fazla olmalıdır).
- Hemasitometre kullanarak hücre sayısını sayın.
- 25 ° C'de 200 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj ile 1.5 x 10 7 hücre Pelet. Süpernatantlar atın ve transfeksiyon orta 280 ul ekleyin. 4 mm'lik küvetin içine Reaksiyon karışımı aktarın.
- Ekle NPY-MRFP plazmid 20 ug ve boş kontrol plasmidi ya da bir test plazmid ya da 30 ug. Reaksiyon karışımı nihai hacim 300 ul olmalıdır.
- Hemen 10 dakika süreyle buz üzerine yerleştirin. Kalıntı su ve p gelen küvet silin9 ms 300 V elektroporasyon roceed.
- Ekzositozu ölçümleri için, 300 ul ortam ihtiva eden 24 oyuklu doku kültür tabaklarında hücrelerin hemen Replate. Her bir reaksiyon karışımı (4 x 10 5 hücre) 8 ul ekleyin. Kontrolü için ek oyuklara 4 x 10 5 olmayan transfekte edilmiş hücrelerin ekleyin. En azından her transfeksiyon için her tedavi için kuyu çoğaltmak olması için yeterli kuyuları hazırlayın.
- Zaman atlamalı mikroskopi için, 80 ul ortamı içeren bir 8-iyi odasının borosilikat coverglass sistemi hemen hücreleri Replate. Her bölme için, reaksiyon karışımı (7.5 x 10 4 hücreleri), 1.5 ul ekleyin. (Coverglass merkezinde odaları görüntü kolay coverglass kenarında odaları kullanmaktan kaçınmak için deneyin).
NOT: Önemlisi, tüm hücreleri bir tetikleyici cevabını değildir ve bazen time-lapse mikroskopi sayesinde 8-iyi odasının borosi odak kaybı ve sürüklenme bindiğilicate coverglass sistemi. Bu nedenle, her bir transfeksiyon için her bir işlem için en az 8 bölmeleri hazırlar. - FcεRI aracılı aktivasyonu için hücrelerin duyarlılaştırılması için, ortam (en az 2 saat süreyle IgE ile hücrelerin inkübe) fare DNP'ye özel monoklonal IgE 1 ug / ml ekleyin.
- 18-24 saat sonra hücreler plazmidler ifade onaylamak için bir floresan mikroskop kullanın. MRFP floresan eksitasyon ve emisyon dalga boyları: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP SG- karşılık veziküler yapılar görünmelidir. İlgi ikinci gen, bir floresan etiketi kaynaşır ise aynı hücreler, her iki plasmidin birlikte-sentezlenmesini teyit etmek üzere bir floresan mikroskop kullanılır. Test edilen gen GFP'ye birleştirilmiş Örneğin, GFP floresan eksitasyon ve emisyon dalga boyları: λEx 488, λEm 507 nm. GFP etiketli protein NPY-MRFP ifade eden aynı hücrelerde görünmelidir.
- Ekzositoz ölçümleri için t devamo adım 5 ve zaman atlamalı mikroskopi için, 6. adıma geçin.
5. NPY-MRFP Ekzositoz Ölçme
- Tyrode tampon hazırlanması:
- 54 mM KCI, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl ve DDW içinde 8 mM NaH 2 PO 4 içinde bir çözeltisi hazırlandı. İyice karıştırın ve 4 ° C'de saklayın. Bu aşama, 20x Tyrode tamponu ile hazırlanır.
- 20 mM Hepes çözeltisi, pH 7, 1.8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, 5.6 mM glukoz ve DDW içinde Tyrode 20x arasında 1-20 seyreltme hazırlayın ve iyice karıştırın. Bu adım, 1x Tyrode tamponu ile hazırlanır.
- -20 ° C'de 1x Tyrode tamponu ve mağaza alikosu. Tekrarlanan donma ve çözülme kaçının.
- 24 plaka kültür ortamının çıkarın ve Tyrode tamponu ile 3 kez yıka. Kontrol kuyularına, 200 ul Tyrode tamponu ilave edilerek uyarılmamış hücreler hazırlayın.
- / Oyuk 20X 10 ul reaktif [(örneğin, 1000 ng / ml DNP-BSA ya da DNP aktive konsantre edildi hazırlanması-HSA (Ag), 200 uM Ca 2 + iyonoforu (örneğin, A23187) ve 20 uM Ca 2 + iyonofor ve 1000 nM 12-O- tetradekanoilforbol-13-asetat (TPA)] bir kombinasyonu. Reaktifler DMSO içinde saklanır ise,% 1 DMSO içeren Tyrode tamponu içinde 20x konsantrasyonu reaktifler sulandırmak. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- Bir 96 çukurlu levhaya iyi dikkatle her süpernatantlar kaldır buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kaçının. (Yüzer hücrelerinden salıverildi kimerik peptid NPY-MRFP içerir).
- Her kuyuya% 0.5 Triton X-100 ihtiva eden 200 ul Tyrode tamponu ilave edin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. (Bu adım hücrelerinden salınan değildi NPY-MRFP kalan içeren hücre lizatları hazırlanması için önemlidir). Hücre lisatlan toplayın ve bir 96 çukurlu levhaya transfer buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kaçının.
- Bir fluoresc kullanılarak hücre süpernatanları ve hücre lizatlarının floresan ölçümüence plaka okuyucu, bir 590-, 20 nm bant genişliği uyarma filtresi ve 635-, 35 nm bant genişliği emisyon filtre kullanarak.
- Serbest NPY-MRFP yüzdesini hesaplayın:
NOT: floresan okuyucu önlem keyfi floresan üniteleri (AFU). AFU değerleri makine ve duyarlılık ve transfeksiyon verimliliğine bağlıdır.- Boş olarak transfekte RBL hücreleri otofloresans ayarlayın. Toplam floresan her süpernatant AFU (süpernatanlarında ilgili lizatın + AFU ve AFU) bölün ve 100 ile çarpın.
Ekzositozu 6. Time-lapse Mikroskopi
- 8-iyi odasının borosilikat coverglass sistemi transfekte hücre / odasının 7.5 × 10 4 Tohum. 18-24 saat sonra, odalar kültür ortamının çıkarın ve Tyrode tamponu ile 3 kez yıkayın
- Her bölmeye Tyrode tamponu 72 ul ekle. 10x konsantrasyon Tyrode tampon içinde aktive edici reaktifler seyreltin. <li> ısıtılmış odasının (37 ° C) ve CO 2 kontrolör (% 4.8) ve 40X veya 63X amacı ile donatılmış bir konfokal floresan mikroskop kullanın. Mikroskop sistemleri açın: cıva lambası, bilgisayar, ve lazerler. Isıtmalı odası deney başlamadan önce doğru sıcaklıkta olduğundan emin olun.
- Isıtmalı odasında odasına yerleştirin ve oda doğru ve istikrarlı yüklü olduğundan emin olun.
- İlgili florofora göre floresan ışığı açın ve transfekte hücreleri görselleştirmek. Söz konusu bir hücreye ağartma ve sitotoksisite en aza indirmek için bu alanda bir kez floresan kapatın. Bu alan 2-3 transfekte edilmiş hücreleri ihtiva etmesi önemlidir. Transfekte hücreler de yayıldı ama birbirlerine dokunmadan değil edilmelidir.
- Gürültü ve doyma gibi toksisite en aza indirmek için (mikroskop bağlı) lazer gücü ayarlayın ve kazanç ayarlamak ve sinyal gürültü oranı değiştirmek için ofset. Hızlı tarama veyader lazer fuar (ortalama 2) süresini en aza indirmek için.
- Bu lazer gücünü azaltarak sağlar, maksimum iğne deliği boyutunu ayarlayın ve uzun bir süre için odaklanmış görüntüleri korumak için. İstenirse Z yığını iki-boyutlu konfokal optik dilim üç boyutlu, gürültü oranı için en iyi sinyal veren 1 havadar ünitesi (AU) iğne deliği boyutunu ayarlamak ve kazanmak ardışık tarama görüntü yeniden için, parametrelerini ayarlamak optik dilim ≤0.7 um z -axes.
- 15-30 sn her edinimi ve 15 dakika toplam satın alma süresi arasındaki süreyi ayarlayın ve görüntüleri elde başlayın. Iktisap 5 dakika sonra zaman serisini duraklatmak. 10x tetikleyici 8 ul ekleyin ve hemen satın devam edin.
- , Resimleri kaydetmek, bir Dekonvolüsyonun yazılımı kullanarak dekonvulasyon gerçekleştirmek ve üç boyutlu görüntüler ve Imaris yazılımını kullanarak bir film yığınları yeniden.
- Imaris yazılımı konfokal floresan mikroskop ile elde edilmiştir açılmış zaman serisi görüntüleri veri alma. Bu yazılım fazla 40 mikroskopi dosyaları okur. Yazılım dosyalarını okuyamaz ise; tif dosyaları ve ithalat dosyalarını dönüştürebilirsiniz.
- Açık veri seti basın düzenlemek sonuna zaman noktaları eklemek için -> set yeni veri Zaman Points ekleyin ve ithalat.
- Yüzey sihirbazı seçeneğini kullanarak MRFP kanalının yüzeyini oluşturun. Varsayılan algoritması seçin. NPY-MRFP kanalını seçin. Gürültüyü azaltmak için düzeltme seçeneği işaretleyin. Küçük detaylar 0.05 um alan ayrıntı düzeyini azaltmak kaybını önlemek için.
- Yoğunluk eşiği ayarlayın. Yeni gri yüzey görüntülenir. "Ayarlar" gidin ve "Merkez noktası" için "Surface" den stili geçiş.
- Seçilen nesnenin özelliklerinde istatistik sekmesine gidin detaylı sekmesini ve özel bir değer suc seçinfloresan yoğunluğu olarak saat, hacim vs.
- Verileri gözden ve değerler görüntüleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Örneğin, iki veya daha fazla bitişik tanecikler, bir daha büyük bir granül olarak ölçülebilir. Ortalama granül boyutu ölçülmesi için granül gerçek sayısı, birleştirilmiş granül boyutunu bölün.
- Excel dosyaları istenen veri setlerini İhracat ve verileri analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çünkü MCs düşük transfeksiyon verimi, genetik manipülasyonlar endojen SGS arabulucular tarafından ölçülen ortalama salgılanması çıktılan üzerinde bir etki bırakmak için olası değildir. Bununla birlikte, özel olarak ilgi konusu geni ifade eden hücre popülasyonu izlenmesinde raportör gen NPY-MRFP tam eş-ifade ve aynı hücre ko-transfekte edilmiş plazmid NPY-MRFP sonuçlarının izlenmesi kurarak. Bu nedenle, geleneksel yöntemler ile karşılaştırıldığında, bu deneyde avantajı seçici Genetik olarak manipüle edilmiş hücreler (Şekil 1) takip yeteneğidir.
Nitekim, biz çözünür NSF [N-etilmaleimid duyarlı füzyon] eki protein reseptör (tuzak) proteinler ve Rab GTPases aile üyeleri dahil 44 veziküler kaçakçılığı düzenleyen genleri ekranlı bu testi kullanılarak. Biz SGsize, sayı, kargo kompozisyonu ve ekzositoz 23 düzenleyen genleri tespit.
We 30 RABS tanımladı değişmiş (yani, inhibe veya teşvik) ya Ag veya Ca 2+ iyonoforun kombinasyonu ve forbol ester TPA (İyon / TPA) 23 tarafından uyarılan RBL hücrelerinde ekzositoz. Konfokal görüntüleme hücreleri veya SG- 30,32 morfolojisi değiştirerek dramatik fenotipleri neden tuzaklarına ve RABS saptandı. Bu proteinlerin Konfokal görüntüleme hücreleri veya SG morfolojisi 30,32 üzerinde dramatik fenotipleri neden 8 tuzaklarına ve RABS saptandı. Bu protokolü kullanarak bireysel SGS izlemek ve onların büyüklüğüne, floresan yoğunluğu, onların hareket ve ekzositoz ölçümlerini gerçekleştirmek başardık. Örneğin, SG biogenez 30 bir regülatör olarak Rab5 belirledi. Rab5 endositoz ile endozomal füzyon 24 bir ana regülatör olarak tanımlanmıştır. Bu kurucu negatif (CN), GDP-kilitli Rab5 bölgesinin endojen olarak ifade izoform mutantlarının (Rab5A, Rab5B ve Rab5C) ya da e-co-ifade edilmiş olanshRNAs hedefleme Rab5A / B / C, bir XPression sayıları 30 bir artış eşlik anlamlı SGS 'boyutunu azalttı. Tersine, bir GTP-kilitli kurucu olarak aktif (CA) Rab5A mutantının ifade (Rab5A Q79L, burada: "ca Rab5A"), ilk endozomların homotipik füzyon (EES'nin) 24 kolaylaştırmak için bilinen, dev oluşmasına neden biz onların salgı kargo NPY-MRFP içeriği ve serotonin ve düzenlenmiş bir biçimde 30 exocytose kendi kapasitesine göre SG- olarak tanımlanan Rab5A dekore kesecikler.
Şekil 2, NPY-MRFP içeren SG- morfometrik analizler göstermektedir. CA Rab5A-ifade eden hücrelerde ortalama SGS hacmi> kontrol GFP-ifade eden bu sayı 20 misli azalma ise hücreler (Şekil SGS ortalama hacmi daha büyük olarak 20 katı, 44 um 3 değerine ulaştı 2A). ters ilişkisayısı ve SGS (Şekil 2A) büyüklüğü arasında SGS Rab5 aracılı büyümesi, homotipik füzyon olarak görmektedir. CA Rab5A tarafından oluşturulan SGS içeren dev NPY-MRFP aksi mümkün olamazdı ayrıntıları SGS izleme sağlar, yüksek çözünürlüklü yaşayan hücrelerin konfokal mikroskopi görüntüleme sağlar. Örneğin, biz büyük olasılıkla, dev SG- arasında dağılmış küçük yapılar yanında SGS kaynaştırarak endozomlarda (Şekil 2B) karşılık gelen Rab5A algılandı. Ayrıca, biz göstermiştir yeni kurulan SG- ile Rab5A seçici ve geçici dernek sadece yeni oluşturulan granüller diğer SG- 30 kaynaştırmak kapasitesine sahip olduğu bir füzojenik aparatı ile uyumlu olduğunu düşündüren yeni oluşan SG- ile Rab5 geçici ve tercihen ortakları olduğunu.
Şekil 3 CA ifadesi ile oluşturulmuştur MC devi SG- temsilcisi time-lapse görüntüleri gösterirRab5A ve uyarıldıktan sonra tek SG çözümünde ekzositoz kinetiği. MC ekzositoz sırasında, SGS doğru hareket ve plazma zarı ile sigorta. Bunun bir sonucu olarak salgı yük hücre-dışı alana hücrelerden salınır. Bu sistemde, NPY-MRFP hücreleri tarafından salgılanan ve hücreler, yüzer buldu. Hücre süpernatanları NPY-MRFP floresansı bir floresan okuyucu ile ölçülebilir. NPY-MRFP yüzer seyreltilir Ancak, kendi flüoresans sinyali tespit veya flüoresan mikroskop ile görüntülenmiştir edilemez. NPY-MRFP floresan yoğunluğu ve NPY-MRFP içeren SG- ve disappearance.Therefore, uyarılmış hücrelerin ve NPY ölçümlerin canlı hücre görüntüleme büzülmesi olarak hızlı ve dramatik bir azalma ekzositozu sonuç sırasında granüllerden NPY-MRFP salınması -mRFP floresan yoğunluğu veya NPY-MRFP içeren SG boyutu ekzositozu kinetik doğru değerlendirmeler sağlamakBireysel tanecikler. Şekil 3B, bir Ca + 2 İyonofor ile hücrelerin uyarılması sonra SG- floresans yoğunlukları göstermektedir. Plazma membranı ile füzyonu değil, tek bir SG floresans yoğunluğu sabit kalırken, SGS, farklı zaman noktalarında (örneğin, 2, 3, 6, ve 11 dakika içerisinde stimülasyonu) olarak eksositoz tabi tutulur.
Şekil 1:. Protokol ana adımları çizimi RBL hücreleri NPY-MRFP ve ilgi ya da kontrol plasmidi tekabül eden ikinci bir gen ile birlikte transfekte hemen lamelleri, 8 oyuklu oda borosilikat coverglass sistemi ya da 96 oyuklu tabaklarda tohumlanır. Ertesi gün, dinlenme NPY-MRFP içeren SG- Görüntüleri ve tetiklenen hücreler konfokal mikroskopi (A) elde edilir. Yatarken Buna ek olarak, ekzositozug, 96 gözlü bir levha floresan okuyucu (B), NPY-MRFP salınımını ölçülmesiyle hesaplanabilir cellsis tetikleyen ve.
Şekil 2:. SGS boyutu ölçümü, RBL hücreleri NPY-MRFP ve GFP ya da GFP-CA, Rab5A ile birlikte transfekte 8 oyuklu oda borosilikat coverglass sistemi üzerine serpildi. 24 saat sonra, 8 oyuklu odası lazer konfokal mikroskop donatılmış ısıtılmış yatağı (37 ° C) içine yerleştirilmiştir. Optik dilimleri 0.7 mikron ile ardışık görüntülerin Z-yığın görüntüleri 63X petrol / 1.4 diyafram objektif sayısal kullanılarak ele geçirildi. görüntüler deconvoluted ve üç boyutlu görüntüleri Imaris yazılımı tarafından inşa edilmiştir. SG- ve sayısı ve hacmi Imaris yazılımı (A) kullanarak hesaplandı. NPY-MRFP içeren Granu parçasıles Rab5A (ok başları) içinde gömülü gibi görünüyor. Diğerleri çıplak ya da Rab5A (oklar) ile birbirinden ayrılır. Ölçek çubuğu = 5 mikron (B). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. ActivatedRBL hücrelerinde bir tek SG çözünürlükte kapsamını ve ekzositoz kinetiği Ölçme RBL hücreleri NPY-MRFP ve GFP-CA Rab5A ve seribaşı in8-iyi odasının borosilikat coverglass sistemi ile kotransfekte edildi. 24 saat sonra in8 çukurlu oda ısıtılmış yatağı (37 ° C) ile teçhiz edilmiş bir lazer konfokal mikroskobu ile yerleştirildi ve hücreler, 10 uM Ca + 2 İyonofor ile tetiklenmesi. Görüntüler 63X petrol / 1.4 diyafram objektif sayısal kullanarak her 15 saniyede elde edildi. Görüntülerdeconvoluted ve Imaris yazılımı ile işlenmiştir. Ölçek çubuğu = 5 mikron (A). NPY-MRFP içeren granüllerin ortalama florasan yoğunluğu Imaris yazılımı ile belirlenmiştir ve veriler zaman 0 (Ca + 2 İyonofor ilavesinin süresi) göre normalize edildi. oklar SGcargo serbest bırakılması wasnoted hangi zaman noktaları (B) temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz ekzositoz için bir raportör gen kullanılarak canlı hücrelerde SG- zaman-lapsed üç boyutlu görüntüleme ile MCs Ekzositoz ve dört (x, y, z, t) boyut sayımsal kantifikasyonunu birleştiren yenilikçi bir strateji tarif. Bu teknik olarak erken olgunlaşma yoluyla Golgi kendi çıkış, ekzositoz yetkinlik ve degranülasyonun satın olarak başlayan bu tür izleme SG- MC fonksiyonu üzerindeki etkileri için protein aileleri tarama sağlar. Birlikte SG- morfometrik ve kinetik karakterizasyonu ile ekzositoz ölçümleri kombinasyonu test proteinler MC fonksiyonları aracılık hangi mekanizmalar içgörüler sunar. Bu nedenle, bu yöntemi kullanarak, hedeflenen genlerin genetik manipülasyon MC SGS mağaza ve onların kargo bırakın hangi yeni moleküler mekanizmaları açıklayacak edebilirsiniz. Özellikle, NPY, MCF-7 hücreleri, bir hücre çizgisi türevli fr gibi diğer salgı hücrelerinde ekzositozu muhabir olarak görev yapabilirom, bir insan meme bezi adenokarsinom 31 kromafin hücreleri, 34 ve pankreatik β-hücresi 35.
Genetik manipülasyonlar fonksiyonel ağları araştırma için mevcut en güçlü araçlardır. Kimin silme paralel ağlar arasındaki karışma uygulamak veya fazlalık nedeniyle hiçbir etkisi olmayacaktır diğer proteinler, aksine genetik manipülasyonlar, silme sisteminin çöküşü zorunlu olacak her ağ, temel proteinlerin belirlenmesi sağlar. Bununla birlikte, MCs düşük transfeksiyon verimi, sadece küçük bir hücre fraksiyonu 'manipüle' test DNA 'sı ifade endojen aracıların eksositoz ölçerken. Endojen arabulucuların ekzositoz ölçerken Dolayısıyla, toplam okuma transfekte hücrelerin katkısı çok azdır. Bu nedenle, bu tür bir yaklaşım benimsemeye çalışırken MK'lerde düzenlenmiş ekzositoz ile ilişkili karmaşık ağlar keşfetmek oldu hampered. Bu teknik, düşük transfeksiyon verimlilik engel üstesinden gelir ve anlatım, demonte ve ilgi genlerin mutagenezi üzerinde neden MC SG- fenotipik ardalanmasından gözlemlemek için basit bir yol sağlar.
Bu teknik, geçici üçlü transfeksiyonunu fonksiyonel ağların etkileşim hiyerarşisini ve modunu araştırmak için uzatılabilir. Sonuçlar belli bir fenotip kurtarmak hangi gen belirlemek için analiz edilecek; Daha dramatik bir fenotipe neden ya da hiçbir etkisi yoktur. Bu tür kombinasyon transfeksiyonlardan göre, ekzositozu ağları yapılabilir. Örneğin, üç-transfeksiyon ile biz Rab5 bağımlı SG füzyon 25 sürecinde aşağı akış aracı olarak, SNARE proteini VAMP8 tespit etmek mümkün olmuştur.
Bu yöntem tek SG- çözümünde görselleştirme ve ekzositoz kantifikasyonunu izin verir. Nitekim biz SGS ekran diferansiyel yanıtları canlandırılmasına olduğunu göstermek başardıkuli. diğerleri vermedi veya MC SG füzyon diferansiyel kinetik nedeni ise plazma zarı ile kaynaşmış bazı SGS kalır neden olarak sebebi tespit edilecek. Bu deneysel yaklaşımı kullanarak gelecekteki çalışmalar bu sorulara cevap potansiyeline sahiptir. Örneğin, farklı tuzaklarına veya bireysel SG- üzerinde RABS ve ekzositoz yeterlilik ile korelasyon ve tek SG çözünürlükte ekzositoz kinetik ölçümü ekzositoz yeni regülatörleri açığa çıkarmalıdır.
Bu tekniğin ana sınırlama, bir proteinin aşırı ekspresyonu hücre fonksiyonunu veya morfolojiye etkileyebilecek çünkü genetik manipülasyon olduğunu. Bu nedenle, bu tamamlayıcı yaklaşımlar ile elde edilen sonuçların doğrulanması gereklidir. Örneğin, konstitütif olarak aktif bir mutantının aşırı ifadesi eksositoz, bir kurucu negatif mutantının etkisini önleyen ya da genin aşağı doğru vuruş sırasında hem de test edilmelidir.
Bu tekniği kullanarak, biz IDENTIFMC ekzositoz etkileyen ya SG morfolojisi değiştirmek MC fonksiyonları, IED yeni düzenleyiciler. SGS morfometrik karakterizasyonu ile birlikte ekzositoz ölçümleri kombinasyonu derin fonksiyonu içgörüler ve test proteinlerin etki mekanizmaları sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz NPY-MRFP cDNA hediye Dr. U. Ashery teşekkür ederim. Biz Dr teşekkür ederim. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani ve mikroskobu ile paha biçilmez yardım için Y. Zilberstein ve görüntü analizleri. Biz de bu yazının eleştirel okuma Dr Joseph Orly teşekkür ederim. Bu çalışma Bilimler Akademisi İsrail tarafından kurulan İsrail Bilim Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir (1139-1112 RS-e için.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
