Abstract
La piel humana tiene una función de barrera importante y contiene diversas células inmunes que contribuyen a la homeostasis del tejido y la protección contra los agentes patógenos. A medida que la piel es relativamente fácil acceso, que proporciona una plataforma ideal para estudiar los mecanismos de regulación inmune periférica. células residentes inmunes en sano conducta piel inmunovigilancia, pero también juegan un papel importante en el desarrollo de trastornos inflamatorios de la piel, tales como psoriasis. A pesar de ideas emergentes, nuestra comprensión de la biología subyacente de diversas enfermedades inflamatorias de la piel es aún limitada. Hay una necesidad de una buena calidad de las poblaciones (individual) de células aisladas a partir de muestras de piel biopsia. Hasta ahora, los procedimientos de aislamiento han sido seriamente obstaculizados por la falta de la obtención de un número suficiente de células viables. El aislamiento y el análisis posterior también se han visto afectados por la pérdida de marcadores de linaje de células inmunes, debido a la tensión mecánica y química causada por los procedimientos de disociación actuales para obtenersuspensión de células individuales. A continuación, describimos un método modificado para aislar las células T de la piel humana psoriásica saludable y participar mediante la combinación de disociación mecánica de la piel utilizando un disociador automatizado de tejidos y el tratamiento de colagenasa. Esta metodología conserva la expresión de la mayoría de los marcadores de linaje inmunes tales como CD4, CD8, Foxp3 y CD11c en la preparación de suspensiones de células individuales. Se muestran ejemplos de éxito de aislamiento de células T CD4 + y la posterior fenotípica y análisis funcional.
Introduction
La piel, como la interfaz principal entre el cuerpo y el medio ambiente, proporciona la primera línea de defensa contra la física externa, químicas y biológicas insultos tales como heridas, la radiación ultravioleta y los microorganismos. Piel comprende dos compartimientos principales, la epidermis y la dermis, y contiene una variedad de células inmunes incluyendo las células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), y cerca de 20 millones de células T de memoria, casi dos veces el número presente en todo el volumen de sangre 1 , 2. Una creciente cantidad de datos apoyan la noción de que la piel tiene funciones inmunológicas esenciales, tanto durante la homeostasis del tejido y en diversas condiciones patológicas. Se cree que las células inmunes residentes en la piel normal para llevar a cabo la inmunovigilancia 3 y se ha demostrado que desempeñan un papel en el desarrollo de trastornos inflamatorios tales como psoriasis 4. En la piel lesional psoriásica, tanto CD4 + y CD8 + se infiltraron las células T eran observed y se demostró que la relación de la CD4 y CD8 varía en función del estado de la enfermedad 5. Sin embargo, estas poblaciones de células son difíciles de estudiar porque las técnicas actuales permiten el aislamiento de sólo unas pocas células.
Las técnicas actualmente ampliamente utilizados para el aislamiento de células T de la piel humana se combinan disociación mecánica de la piel con tratamiento enzimático. Las biopsias de piel humana son ampliamente picada y se incubaron con enzimas como la tripsina, colagenasa y / o EDTA 6-8. Teniendo en cuenta que la piel es un tejido de barrera que es altamente resistente a las fuerzas de tracción y desagregación mecánica, los métodos establecidos de aislamiento de células T producen muy pocas células, e incluso un menor número de células viables, lo que hace ex vivo de cultivo de células de estas poblaciones de células difícil y desafiante.
Aquí, se presenta un método modificado para aislar los linfocitos de la piel humana psoriásica saludable y participar mediante la combinación de mechandisociación ical de la piel usando un disociador de tejido automatizado en lugar del método establecido de picado ampliamente, junto con la digestión enzimática usando colagenasa. Se observaron varios subconjuntos de células inmunes viables, incluyendo países en desarrollo y las células T después de la preparación de una suspensión de una sola célula. Es importante destacar que la expresión de los marcadores de superficie CD3, CD4 y CD8 se conservó bien. Las células preparadas de este modo, están listos para su uso en cultivos de células ex vivo o análisis de citometría de flujo. Este protocolo se ha empleado con éxito para el análisis de biopsias de piel individuales (4 mm) derivadas de la piel lesional de pacientes con psoriasis. Los resultados mostraron que las células T de la piel del paciente residente producen citoquinas inflamatorias como la más IL-17 y IFN en comparación con voluntarios sanos 9.
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Protocol
NOTA: Las biopsias de piel de individuos sanos se obtuvieron a partir de restos de piel abdominal de los individuos sometidos a cirugía plástica electiva tras el consentimiento informado por escrito o por vía oral para uso científico. El uso de piel humana fue aprobado y de acuerdo con las normas establecidas por los comités de ética médica para la investigación humana del centro médico de la Universidad Radboud, Nijmegen, Países Bajos y la Universidad de Essen, Alemania.
1. Preparación de suspensiones de células individuales de la piel humana (Trabajo estéril en un gabinete de flujo si el cultivo celular subsiguiente es obligatorio)
- Preparar medio de cultivo celular: RPMI 1640 + penicilina / estreptomicina (concentraciones finales de 100 unidades / ml y 100 mg / ml, respectivamente) + piruvato (0,02 mM) y glutamax (0,02 mM), sin suero añadido.
- Para preparar el medio de cultivo completo: medio de cultivo preparado en el paso 1.1 + 10% de suero humano agrupado (HPS); almacenar a 4 ° C. Llevar medio a 20 ° C ± 2 frente a nosotrosEn g.
- Obtener la biopsia de la piel utilizando un instrumento de biopsia por punción redonda de 4 mm y mantenerlo en medio de cultivo completo RPMI 1640 a 20 ° C ± 2 para un máximo de 4 horas oa 4 ° C ON. Procesar la biopsia tan pronto como sea posible a su llegada al laboratorio.
NOTA: más largo de almacenamiento de la piel influirá en el rendimiento de células y la viabilidad celular. - Etiquetar un tubo de disociación con tapa azul y añadir 5 ml de medio de cultivo completo en el tubo etiquetado.
- Añadir 2 ml de medio de cultivo completo en cada pocillo (un total de 3 pocillos) de una placa de cultivo estéril de 6 pocillos. Utilice herramientas estériles para colocar la biopsia en un solo pozo, enjuague, moverlo hacia un segundo pozo y repetir este paso una vez más, logrando así un total de tres enjuagues.
- Transferir la biopsia de la piel bien enjuagado a una placa de Petri estéril, añadir 100 l de medio de cultivo completo en la parte superior de la biopsia, y cuidadosamente raspar el tejido graso subcutáneo utilizando un acero inoxidable desechable bisturí estéril.
NOTA: Jes que es un paso crítico. - Cortar cada biopsia de piel en 4 trozos más pequeños en una placa de Petri estéril. Transferir las muestras (hasta cuatro de las biopsias de 4 mm por tubo) en el tubo de disociación preparado que contiene 5 ml de medio de cultivo completo.
- Cerrar herméticamente los tubos con la tapa y coloque boca abajo a la camisa del disociador automatizado de tejidos. Asegúrese de que todo el material de muestra se encuentra en la zona del rotor.
- Iniciar el proceso de disociación mediante la ejecución del "_01 m_spleen programa" (un programa predefinido proporcionada por la memoria interna del instrumento o de la tarjeta de programa acompañada) para disociar la biopsia a la velocidad de rotación apropiada para 56 seg.
- Después del procesamiento, separar el tubo de la disociación del disociador y asegurarse de que todo el material disociado se recoge en la parte inferior del tubo.
- Añadir 150 l de colagenasa IA (80 mg / ml) en el tubo de disociación e incubar la muestra en un baño de agua con agitación a 37° C durante 60 min. Añadir 100 l de DNasa I (5 MU / ml) en tubo de thedissociation, mezclar bien.
NOTA: Mayor concentración de colagenasa o el tiempo de incubación más largo va a alterar la viabilidad celular. - Una el tubo de disociación para la manga de la disociador tejido automatizado y ejecutar el "m_ programa bazo _01" para disociar la biopsia una vez más.
- Colocar un filtro de células de nylon 70 M en la parte superior de un tubo Falcon 50 ml. Aplicar materiales de muestra disociadas a este filtro de células para eliminar grupos de células / restos de tejido.
- Lavar filtro de células una vez con 5 ml de medio de cultivo completo. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 10 min y el sobrenadante aspirado.
- Repita el paso de lavado una vez más. Volver a suspender los sedimentos celulares en 300 l de medio de cultivo completo. una sola célula suspensiones están listos para su posterior análisis; continuar con protocolos para el cultivo de células ex vivo o citometría de flujo análisis.
- En caso de un nuevo itinción de citocinas ntracellular, estimular las células con PMA (12,5 ng / ml), ionomicina (500 ng / ml) y Brefeldine A (5 g / ml) durante 4 horas a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 4 h antes de la realización de flujo El análisis de citometría.
2. policlonal activación de células T cutáneas Residentes (Ex Vivo Cultura de la célula)
- Alícuota de 100 l suspensiones unicelulares (preparado en la etapa 1.15) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
NOTA: Para cada uno de 4 mm biopsia de la piel, las suspensiones de una sola célula adquiridos se pueden dividir en al menos dos pocillos de una placa de 96 pocillos. - Añadir anti-CD3 / anti-CD28 microperlas recubiertas con mAb (25.000 cuentas por pocillo), recombinante humana de citoquinas rIL-2 (concentración final 25 U / ml) y rIL-1ß (concentración final 50 ng / ml).
- Cubrir la placa de cultivo con una tapa de placa de marcado, se incuban en 5% de CO 2, el 100% de humedad, 37 ° C incubadora. Cambie medio cuando el color medio se pone en amarillo.
3. Análisis de citometría de flujo de células de la piel primaria / Residentes T cultivadas
- Preparar tampón FACS: PBS + BSA al 0,2%.
- Transferencia de células de interés en una placa de 96 pocillos de fondo en v. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
- Resuspender el precipitado en 100 l de PBS. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
- Las células se tiñen con 100 l de eFluorescence780 preparados conjugados colorante de viabilidad corregible (1: 1000 dilución utilizando PBS) a 4 ° C durante 30 min. Añadir 100 l de tampón de FACS, se centrifuga a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
- Seleccionar mAbs requeridos marcador de superficie celular, por ejemplo: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (FC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), y CD1c-APC (AD5-8E7, 01:10), preparar los mAbs mezcla usando tampón de FACS en función de cada factor de dilución mAb probado. Definir ajustes de la compuerta utilizando control de isotipo de anticuerpo junto con la muestra no mancha.
- Añadir 25 l de preparado mAbs-mezcla en cada pocillo. Incubar 20 minutos a 20 ° C ± 2, protegerlo de la luz.
- Añadir 100 l de tampón de FACS, se centrifuga a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
- Para las muestras que sólo requieren tinción de la superficie celular, continúe con el paso 3.16.
- En el caso de la tinción de Foxp3 intra-celular:
- Preparar la fijación y permeabilización de amortiguación mediante la mezcla de una parte de concentrado con 3 partes de diluyentes.
- Preparar tampón de permeabilización 1x: 1 parte de tampón de permeabilización 10x + 9 partes de H 2 O. esterilizada
- pellets de resuspender en 100 l de fijación y permeabilición tampón, mezclar bien e incubar a 4 ° C durante 30 min.
- Añadir 100 l de tampón de permeabilización a cada pocillo, se centrifuga a 450 xg a TA durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
- Lavar las células con tampón de permeabilización una vez más.
- Seleccionar mAbs intracelulares necesarias, por ejemplo, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) y IFN-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Preparar la mezcla de anticuerpos monoclonales usando tampón de permeabilización que contenía suero de rata normal 2% de acuerdo a cada factor de dilución del AcMo probado. Definir ajustes de la compuerta utilizando control de isotipo de anticuerpo junto con la muestra no mancha.
- Añadir 20 l de preparado mAb-mezcla en cada pocillo. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, protegerlo de la luz.
- Después de 30 min de incubación, añadir 100 l de tampón de permeabilización en cada pocillo. Centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 2 min, y el sobrenadante aspirado.
- Lavar las células con buffe permeabilizaciónr una vez más. sedimento se vuelve a suspender en 110 l de tampón FACS, y las suspensiones de células en un tubo de transferencia de microFACS.
NOTA: La muestra está lista para medición mediante citometría de flujo 10-color. - En el caso del número de células exacta requerida, añadir 10 l de suspensión uniforme bien mezclada de fluoroesferas en cada muestra inmediatamente antes de realizar las mediciones de citometría de flujo.
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Representative Results
El protocolo que aquí se presenta producirá entre 2.200 ± 615 (media ± SEM, piel de voluntarios sanos) hasta 178.000 ± 760 (media ± SEM, piel lesionada de pacientes con psoriasis) linfocitos viables de la piel humana cuando se utiliza una sola biopsia de piel de 4 mm.
Se identificaron diferentes tipos de células CD45 + en una sola célula suspensiones derivadas de la piel de individuos sanos, incluyendo las células T CD4 + (~ 45%), las células T CD8 + (~ 30%), y CD11c + DC (~ 5% ), mientras que pocas células B (CD19 +), células NK (CD56 + CD3 -), o los monocitos / macrófagos (CD14 + o CD1c +) se observaron (Figura 1A). La metodología también permite el análisis de CD4 + CD25 + Foxp3 + células en las biopsias de piel humana. Mediante el uso de la tinción intracelular después de la fijación y permeabilización, es posible demostrar la expresión de la transcripción factor Foxp3 en CD25 + células T (Figura 1A).
una sola célula suspensiones derivadas de biopsias de piel humana mostraron un fondo de alto autofluorescencia en FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (Pacífico azul) y FL10 (naranja cromo) canales usando un citómetro (datos no mostrados) . Para el correcto análisis de la población de linfocitos, por lo tanto, recomendamos el uso de un anticuerpo monoclonal anti-CD45 humana conjugado con un fluorocromo Brilliant Violet 421 de compuerta de la población de linfocitos y la exclusión de la población celular autofluorescent (Figura 1B). La mayoría de las células residentes en la piel humana eran células T CD3 + (Figura 1C). Para el análisis de la viabilidad celular, se recomienda utilizar un colorante de viabilidad se puede fijar a distinguir viable de células muertas / mueren (Figura 1C). Normalmente, este protocolo da como resultado 65,3% ± 7,7 (media ± DE) de células viables. Para más análisis de la citometría de flujo de datos, es advised a la puerta en la población de células viable, ya que las células muertas o moribundas pierden su integridad de la membrana celular, y puede unirse de forma no específica de anticuerpo conjugado, lo que aumenta la tinción de fondo.
células T aisladas por el presente protocolo son muy adecuadas para el análisis funcional adicional. Mediante el uso de un solo 4 mm biopsia de piel lesional de pacientes con psoriasis, se demostró que las células T de biopsia derivada producen IL-17A y IFN siguiente 4 estimulación horas con PMA / ionomicina en presencia de Brefeldina A (Figura 2).
Recién preparadas suspensiones de la piel de una sola célula a partir de lesiones en la piel psoriásica implicadas se pueden utilizar también para más de cultivo de células ex vivo y análisis funcional subsiguiente. Después de la expansión tras la estimulación policlonal con microperlas recubiertas mAb anti-CD3 / anti-CD28 en la presencia de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1 o IL-23 durante 8 días, las células pueden por ejemplo, ser analizados por su cytokine capacidad de producción (Figura 3). Al hacerlo, se observó una clara diferencia entre la producción de citoquinas potencial de las células derivadas de la piel de individuos sanos y psoriásicas. las células T de individuos con psoriasis mostraron una capacidad mucho mayor para producir la psoriasis asociada IL17A citoquinas y IFN. Esto implica que incluso después del cultivo ex vivo se mantiene un fenotipo psoriasis citoquina prototípico, ausente en el caso de los controles sanos.
Figura 1:. Los diferentes tipos de leucocitos se identifican en suspensiones unicelulares derivadas de la piel de individuos sanos linfocitos residentes de la piel aislado utilizando el protocolo descrito en el texto se tiñeron con los mAb conjugados con fluorocromo de interés más colorante de viabilidad se puede fijar y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo. (A) cy Flowtometric la detección de los monocitos (CD14), países en desarrollo (CD11c), células B (CD19), células NK (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + y CD25 + Foxp3 + subconjuntos dentro de los linfocitos residentes de la piel. CD45 anti-humano / BV421 mAb distingue a los linfocitos de células autofluorescent. Las estrategias de compuerta utilizadas para las células CD45 + se muestra en (B). (C) Porcentaje de células T CD3 + CD45 + viables después del aislamiento. Número muestra el porcentaje de células positivas. Se muestra un experimento representativo de tres experimentos diferentes / donantes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: las células T derivadas de la piel lesional de pacientes con psoriasis pueden produce la IL-17A y IFN. Una sola biopsia de piel de 4 mm fue tomada de la piel lesionada del paciente con psoriasis en forma oral o escrito el consentimiento informado para uso científico. Se aislaron las células T residentes de la piel utilizando el protocolo descrito en el texto. La producción de IL-17A y de IFN por las células T residentes de la piel. La acumulación intracelular de citoquinas en respuesta a la estimulación 4 horas con PMA / ionomicina en presencia de Brefeldina A se midió por citometría de flujo. se muestra Porcentaje de citoquinas de las células positivas. Se muestran los datos de tres pacientes diferentes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: células T cutáneas residentes son capaces de producir IL-17A e IFN siguiente ex vivo
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Discussion
A continuación, se presenta un protocolo para aislar eficazmente las células T residentes de la piel a partir de biopsias de piel humana. La ventaja de este protocolo es el aislamiento de un número relativamente alto de linfocitos viables, y la expresión de marcadores de superficie correspondientes. Los subconjuntos de células identificadas fueron:, células CD4 + y linfocitos T CD8 + y CD25 + Foxp3 + CD11c + DCS. Es importante destacar que la cultura ex vivo de las células T aisladas de la piel residentes fue muy bien factible y permitido para el análisis funcional subsiguiente.
La piel humana se puede disociar en suspensiones de una sola célula mediante la combinación de disociación mecánica con la degradación enzimática de las proteínas de adhesión extracelulares que funcionan para mantener la integridad estructural de los tejidos. Aunque dispasa separación de la capa a base de la epidermis y la dermis es un método ampliamente utilizado para determinar la infiltración de células en estas capas de la piel respectivas, hemos observado que el tratamiento dispasa llevó tOA importante reducción de la expresión de la superficie celular de la CD25 y CD27 (no se muestra). A medida que estos marcadores son importantes para caracterizar los subgrupos de linfocitos, creemos que dispasa influencias de tratamiento inmunofenotipo posterior. No es probable que la eliminación de la dermis es responsable de la reducción observada en CD25 o CD27 células que expresan, ya que en la piel de los individuos sanos, la mayoría de las células T se localiza en la dermis, mientras que el número de células minuto T están presentes en la epidermis 10 -12. El efecto perjudicial de dispasa en la capacidad de proliferación de los queratinocitos aislados se ha informado anteriormente 13. Por lo tanto, el uso prudente de dispasa se justifica si la función celular es el objetivo del estudio. En nuestro protocolo que hemos estado usando colagenasa tipo I para obtener la suspensión de una sola célula de biopsias de piel. A pesar de colagenasa I tiene una alta actividad tríptico en comparación con colagenasa IV y por lo tanto es más duro, hemos elegido esta colagenasa particular, ya que ha sido del tested por su idoneidad para el cultivo celular. El uso de una colagenasa IV que es adecuado para el cultivo de células podría ser un paso futuro para optimizar aún más el protocolo actual.
Debido a su naturaleza, la piel es muy resistente a fuerzas de tracción y desagregación mecánica. Hasta el momento, un análisis exhaustivo de las células inmunes en la piel humana se ha visto obstaculizada por problemas técnicos en la obtención de números de células suficientes al utilizar protocolos de digestión relativamente duras. Como consecuencia, la mayoría de los estudios publicados hasta la fecha se basan en análisis inmunohistoquímicos. El aislamiento directo de las células T CD4 + a partir de biopsias de la piel se considera generalmente engorroso. Una alternativa sería el uso de explante de piel arrastrarse fuera culturas 10. Sin embargo, estos toman 2-3 semanas de cultivo, y el medio de cultivo de explante de piel contiene un conjunto seleccionado de citocinas y quimiocinas, lo que podría llevar a cabo el rastreo preferencial de subconjuntos de células T específicas. Además del periodo de cultivo podría afect el fenotipo de las células. El protocolo actual no hace uso de citocinas añadidas o quimiocinas, y la expresión de CD4 (y también otros marcadores de células) está bien conservada después del aislamiento, lo que permite tanto fenotípica y estudio funcional de poblaciones de células T directamente después del aislamiento.
A disociador tejido automatizado comercialmente disponible se utiliza para la disociación de fragmentos de piel antes de su incubación con colagenasa, necesario para la degradación de la matriz extracelular. Para la posterior liberación de las células de la matriz extracelular, el disociador automatizado se utiliza de nuevo. Aunque extensa corte manual de la piel puede producir el número de células similares (datos no mostrados), los resultados son menos consistentes y son más dependientes de la experiencia del intérprete. La disociación de la piel usando el procedimiento predefinido ofrecido por el instrumento dará resultados mucho más reproducibles. De acuerdo con estudios anteriores que muestran que la piel contiene varios leukocytes subconjuntos células CD, CD8 + y CD4 + T 2,14, CD11c +, y se observaron las células Foxp3 + en las poblaciones de una sola célula preparados por el protocolo presentado aquí. Es importante destacar que, el protocolo proporciona un rendimiento relativamente alto de linfocitos viables. Debido a la eficiencia del protocolo, es particularmente útil en el estudio de material del paciente, donde a menudo sólo una única biopsia de la piel 4 mm puede ser obtenido. Utilizando el método, hemos sido capaces de demostrar que las células T aisladas de la piel lesional de pacientes con psoriasis mostraron una mayor capacidad para producir IL-17A y IFN en comparación con la piel sana 9.
Dependiendo de la pregunta de investigación, puede ser necesario purificar adicionalmente ciertos subconjuntos de células después de la preparación de suspensiones de células individuales. En este caso, las piezas más grandes de la piel se pueden utilizar para asegurar el rendimiento de células suficientes para los análisis de subconjunto. Al hacerlo, asegúrese de que la piel se debe cortar en pequeños pieces de alrededor de 2 mm x 2 mm antes de iniciar el protocolo de aislamiento.
En conclusión, el presente protocolo ofrece una forma mejorada para aislar células residentes de la piel, facilitando fenotípica significativa y el análisis funcional en un solo nivel celular, mejorando así nuestra penetración en la piel de las respuestas inmunes.
Los pasos críticos en el protocolo actual son la eliminación adecuada de tejido graso subcutáneo y el corte de la piel en trozos más pequeños, especialmente cuando se procesan más de una biopsia en un tubo de disociación. El tejido graso y / o grandes piezas de tejido hará que el disociador no funcione correctamente, pedir repetición de las elecciones. Esto dañará seriamente la viabilidad celular. La limitación de la técnica es que el número de células derivadas de una única biopsia de la piel 4 mm no son suficientes para el aislamiento posterior de los subconjuntos de células.
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Acknowledgments
biopsias de piel de pacientes con psoriasis fueron amablemente proporcionados por el Dr. Andreas Koerber (departamento de Dermatología de la Universidad de Essen, Alemania) tras el consentimiento informado por escrito o por vía oral para uso científico.
XH también es apoyado por SNCF 61263039 y 11101321 SNCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman - Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman - Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman - Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
