Summary
Une nouvelle préparation ex vivo pour l'imagerie de la moelle épinière de souris. Ce protocole permet l'imagerie à deux photons d'interactions cellulaires vivants tout au long de la moelle épinière.
Introduction
Des modèles murins de démyélinisation, y compris l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et l'infection par le virus intracrânienne neuroadapted de l'hépatite de la souris (MHV), sont d'excellents outils pour étudier les voies moléculaires et interactions cellulaires associés à la maladie. Ils ont mené et soutenu l'efficacité des thérapies pharmaceutiques approuvé par la FDA, ciblant principalement la cessation de l'auto-immunité et l'inflammation 1. Cependant, une fois la remyélinisation endogène a échoué, les thérapies actuellement approuvés ne réparent pas efficacement les lésions démyélinisées dans le système nerveux central. Par conséquent, les thérapies de réparation axé à ce stade de la maladie sont décisifs pour le soulagement des symptômes chroniques et l'amélioration de la qualité de vie. Récemment, des cellules précurseurs neurales (PNJ) sont venus à l'avant-garde comme une modalité thérapeutique régénérative potentiel pour cibler des zones d'inflammation et de démyélinisation. Plusieurs études ont mis en évidence la capacité des PNJ pour induire endógenonous remyélinisation et participer directement à la remyélinisation 2-8. Parce que les PNJ sont impliqués dans la remyélinisation directe, il est impératif de comprendre leur cinétique et les interactions avec des cellules endogènes après la transplantation. Après la transplantation, NPC migrent ventralement à des zones de blanc atteinte de la substance, puis rostrale et caudale par rapport au site de transplantation 5,9. La cinétique de la migration diffèrent en réponse aux signaux environnementaux; NPCs transplantées dans la moelle épinière non endommagés ont de plus grandes vitesses que PNJ transplantées dans la moelle épinière endommagée 6. Après une période de migration, transférés PNJ prolifèrent abondamment, à un taux supérieur dans une moelle épinière endommagée par rapport à une moelle épinière intacte 6. Enfin, la majorité des PNJ se différencier en oligodendrocytes et initier 4,6,9 de la remyélinisation directe.
La lésion démyélinisée est complexe et peut comprendre une population diverse de cellules à divers stades d'unctivation. Par exemple, une lésion active la sclérose en plaques (MS) peut comprendre une importante population de cellules T activées, la microglie et des macrophages M1 M1, mais une lésion chronique silencieux MS peut être composée essentiellement d'astrocytes réactifs avec quelques cellules inflammatoires 10-13. En raison de la diversité des cellules effectrices, à deux photons (2P) imagerie dans des modèles murins de démyélinisation est un outil extrêmement utile pour aider à comprendre les interactions cellulaires locales au sein de la lésion. Dans la SEP et de nombreux modèles de recherche de MS largement utilisées, la majorité des lésions sont situées sur la face ventrale de la moelle épinière, une région inaccessible à l'imagerie intravitale 2P en raison de la profondeur de la lésion et la forte teneur en lipides de la moelle épinière. Pour contourner ces problèmes et interactions étude cellule-cellule au sein de lésions long de la moelle épinière ventrale nous avons développé simple vivo 2P préparation d'imagerie 6 ex.
Cette étude fait suite à une précédente publication méthodes, qui a montréla procédure de transplantation protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) PNJ dites-vous dans la moelle épinière de souris après souche JHMV de démyélinisation MHV-induite 14. Souris âgées de cinq semaines sont infectées par JHMV et transplantées avec eGFP-PNJ au niveau thoracique 9 sur 14 jours post-infection. Le protocole présenté ici fournit des instructions détaillées sur la façon d'extraire la moelle épinière, faire une préparation ex vivo agarose et image transplanté interactions eGFP-NPC avec la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) des axones dites-vous. Les souris exprimant sous la EYFP Thy1 promoteur spécifique de neurones ont été utilisés dans cette procédure 15. Seuls quelques-uns des axones exprimer EYFP, le rendant utile pour l'imagerie axones individuels. Ici, nous montrons la moelle épinière prélevés à sept jours post-transplantation; Toutefois, la moelle épinière peuvent être extraites à tout point de temps après la transplantation. Bien que nous montrons interactions avec des PNJ axones endommagés, notre protocole peut être utilisé en combinaison avec des marqueurs fluorescents génétiquesd'autres types de cellules à examiner une multitude d'interactions cellulaires qui se produisent tout au long de la moelle épinière de souris.
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Protocol
NOTE: Éthique Déclaration: Le protocole de manipulation des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Californie, Irvine, le protocole # 2010-2943.
1. Suppression de la moelle épinière
- Placez des serviettes en papier mouillés avec ~ 100% d'isoflurane liquide, USP dans la chambre euthanasie et placer des serviettes en papier sec sur le dessus. Placez la souris dans la chambre au-dessus de serviettes en papier sèche afin souris ne est pas en contact avec le isoflurane et se assurer que la chambre est couverte. Attendre au moins une minute après l'arrêt de la respiration pour que la souris est euthanasiée.
- Effectuez une transection moelle du cou pour se assurer de la souris est euthanasié. Ne pas effectuer une dislocation cervicale car cela pourrait endommager la moelle épinière.
- Pulvériser la souris avec 70% d'éthanol pour mouiller les cheveux.
- Utilisez des ciseaux Beaux pointus pour enlever la peau et les cheveux à l'arrière de la souris pour exposer la colonne vertébrale d'environ 1 lamina cervicale (C1) À lame sacrée 4 (S4).
- En utilisant un scalpel à lame # 10, faire des incisions à gauche et à droite de la colonne vertébrale de la séparer de muscle et la graisse. Cela rendra le retrait de la moelle épinière beaucoup plus facile.
- option: une rongeurs Luer courbes peuvent être utilisés pour ramasser loin chair supplémentaire.
- Tout en maintenant le haut de la colonne vertébrale avec des pinces dentelées Graefe, insérez titane ciseaux courbés Vannas avec le côté bombé vers le haut dans la colonne vertébrale exposée au C1, en faisant attention à ne pas toucher la moelle épinière.
- Faites glisser le titane ciseaux courbes Vannas tout le chemin à droite et faire une petite coupure. Un petit son crunch devrait être entendu et ressenti comme les ciseaux coupent les vertèbres. Répétez cette coupe sur le côté gauche de la corde. Veillez à ne pas aller trop vite ou de faire trop grand d'une coupe car cela risque d'endommager le cordon avec les ciseaux.
- La seule lame doit pouvoir être soulevé avec la pince lorsque les côtés des vertèbres sont coupés. REPEAT cette étape pour chaque lamelle jusqu'à S4, du maintien et tirez les vertèbres de la moelle épinière.
REMARQUE: les vertèbres au-dessus du site de greffe viendra probablement une fois qu'il est coupé au site de transplantation. Continuer la procédure de départ juste en dessous du site de transplantation. - option: jeter les vertèbres bas pour voir où le site de transplantation est et mesure et couper ~ 20 mm rostrale et caudale vers le site de transplantation.
REMARQUE: Lors de la transplantation PNJ plus ne sera pas nécessaire que les PNJ transplantés généralement ne migrent pas à plus de 15 mm. Le montant de la moelle épinière nécessaire sera fonction des caractéristiques d'expérimentation et de migration de type de cellule transplanté. Faire des coupes rostrale et caudale qui sont équidistants sur le site de transplantation permettra au site de transplantation d'être placées plus facilement lors de l'imagerie. - Avec un scalpel avec une lame # 11 Découpez soigneusement les ganglions sur la droite et à gauche de la face ventrale de la moelle épinière à partir de la fin rostrale. Ce wmalade permettre la moelle épinière à être présente dans les vertèbres ventral plus facilement.
REMARQUE: Fait rapidement (étapes 01.07 à 01.11), la moelle épinière ne se dessèche pas. Cependant, PBS 1x peut être administré à la corde pour garder humide. - Inverser la souris et maintenez la souris vers le haut de sorte que la moelle épinière est orientée vers le bas. Retirer délicatement sur la moelle épinière en utilisant des pinces dentelées Graefe fermés. Sans entailler la moelle épinière, découpez soigneusement toutes les ganglions restants pour permettre la moelle épinière pour être levée dans une seule pièce intacte.
- Assurez-vous que la moelle épinière est en RPMI-1640 et le placer sur la glace pour le transport vers le microscope 2P.
2. Préparation de la moelle épinière for Imaging
- Intégration de la moelle épinière dans l'agarose
- Gardez la moelle épinière isolée dans réfrigérés RPMI-1640 sur la glace avant l'imagerie.
- Peser agarose (à basse température de gélification) et préparer une solution à 5% dans 5 ml de 1 x PBS. Micro-ondes la solution d'agarose à 5% pendant 15 secondes pour dissoudre le agse leva et laissez refroidir la solution à 37 ° C.
- Préparation de la moelle épinière en le plaçant sur une feuille de Parafilm avec la face ventrale vers le haut.
- Pipet environ 5 ml de solution d'agarose 5% par rapport à la face ventrale de la moelle épinière. Soit l'agarose se solidifie par refroidissement à la température ambiante. Solidification complète prend environ 5 min.
- Appliquer une légère couche de colle tissulaire à un couvercle carré glissement 22 mm.
- Inversez la moelle épinière intégré, plaçant la face ventrale sur Parafilm. La face dorsale va maintenant être orientée vers le haut. Respecter la lamelle à la face dorsale, et plonger la moelle épinière / préparation couvercle intégré agarose de glissement dans IPMB pour solidifier l'adhésif. Enlever l'excédent de solidifié agarose en utilisant une lame de rasoir.
- Montage de la moelle épinière sur la platine du microscope
- Appliquez de la gelée de pétrole au fond de la lamelle. Ce sera de stabiliser la préparation pendant la perfusion.
- Placer la préparation de la moelle épinière dans unImagerie bien sur la scène microscope avec la face ventrale vers le haut vers l'objectif de trempage 25X. L'imagerie bien construit sur mesure est d'environ 20 mm de profondeur, 50 mm de long et 50 mm de diamètre.
- Image tout superfusing la préparation avec réchauffé (37 ° C), oxygéné (95: 5 l'oxygène: dioxyde de carbone carbogène) milieu RPMI-1640 sans sérum.
- Médias Préchauffer à 37 ° C dans le bain d'eau et connectez-le à la pompe à tube en insérant le tube dans la bouteille de médias.
- Maintenir la température du fluide à 37 ° C, un dispositif de chauffage au niveau du raccordement de la tubulure à la chambre. Médias à travers Superfuse bien à 3 ml / min en utilisant un tube relié à la pompe à tube (figure 1B).
3. 2P imagerie de la moelle épinière ventrale
- Configuration de Microscope
- Acquérir des images à partir Thy1-EYFP la moelle épinière à l'aide d'un Ultra Chameleon Ti: Saphir laser réglé à 900 nm. Atténuer la puissance du laser à laspécimen à <5% pour assurer un minimum de 16 phototoxicité. Maintenir la température de l'oxygène en perfusant perfusé RPMI-1640 à une température constante de 37 ° C en utilisant un seul dispositif de chauffage de la solution en ligne pour assurer l'imagerie stable, et pour empêcher la dérive des tissus et des dommages cellulaires.
- Pour séparer eGFP et EYFP signal fluorescent, placer un dichroïque 520 nm bord unique et un nm bord unique diviseur 560 de faisceau dichroïque en série pour séparer 2P émission dans trois canaux, diviser volontairement l'émission verte pour améliorer la visibilité.
NOTE: Ce canal sont appelés bleu-vert (émission <520 nm), vert-jaune (520-560 nm) et rouge (émission> 560 nm). tubes photomultiplicateurs détectent la lumière émise dans chaque canal.
- Localiser les zones d'imagerie d'intérêt
- Utilisation de l'oculaire et une source lumineuse de la lumière de champ, se concentrer l'objectif de trempage à la partie ventrale de la moelle épinière pour définir un point de référence.
- Assurez-vous que la source de lumière ambiante est éteint et swdémangeaison de 2P excitation en ouvrant l'obturateur laser.
- Si possible, lors de la recherche de tissus pour les zones d'intérêt, utilisez un cadre de résolution inférieure, le volume plus élevé sans zoom numérique, et le taux de balayage plus élevé que lors de l'acquisition des images finales. Paramètres typiques avec ce système lors de la recherche de tissus pour une région d'intérêt sont: la résolution: 256 pixels; volume: x = 600 um, y = 600 um, z = 0 à 300 um.
- Respecter les axones EYFP près du bord ventral de la moelle épinière. Signal de second harmonique à partir de collagène (bleu) sera plus brillante au bord de la moelle tissu de la moelle. Situez les axones EYFP juste dorsale au second signal harmonique à partir du collagène et le signal est EYFP visualisées dans le canal vert-jaune.
- Localiser le site de transplantation dans le centre longitudinal de la préparation de la moelle épinière 14. Pour les souris un jour suivant la transplantation eGFP-NPC, localiser le site de transplantation en se concentrant la trajectoire du faisceau dans le plan z profondément dans les tissus. Le site de transplantation will varier légèrement entre les animaux mais il est généralement situé ~ 200 um du bord ventral. Respecter les grappes de eGFP-PNJ dans les secteurs de la substance blanche, plus proche des bords ventrales et latérales chez la souris après une jours post-transplantation.
- Acquisition d'images finales
- Acquérir une résolution d'image de 512 pixels; volume: x = 270 um, y = 212 um, et z = 100 um logiciel à l'aide Slidebook 6. Compiler z-piles par l'acquisition de plans focaux séquentiels dans 2,5 um incréments.
- Effectuez un balayage entrelacé bidirectionnelle avec bon décalage pour assurer une quantification rapide de tous les objets qui migrent dans la moelle épinière. Assurez-vous que le taux idéal de trame d'acquisition pour déterminer la vitesse cellulaire dans la moelle épinière est d'environ 1 image / sec.
REMARQUE: Les paramètres d'imagerie peuvent être changés pour les préférences des utilisateurs individuels, tels que la cadence d'acquisition, la résolution de l'imagerie et des volumes d'imagerie. Volumes d'imagerie plus grands prendront généralement plus de temps à acquérir à un GIVen résolution. - Analyser, cultures, lisse et pseudocolor fichiers image Slidebook avec le logiciel d'analyse d'image tels que Bitplane Imaris 7,7. Produire finales vidéos time-lapse en peignant volumes d'imagerie consécutifs à l'aide d'un processus automatisé dans Slidebook et Imaris.
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Representative Results
Alors que le protocole d'imagerie de la moelle épinière explantées peut être utilisé pour visualiser ne importe quel fluorescence de la moelle épinière, nos résultats démontrent représentatifs interactions avec eGFP-NPC-EYFP axones. Premièrement, nous montrons la préparation de la moelle épinière ventrale intégré à la figure 1A. Ensuite, on montre la configuration 2P du microscope et des éléments clés sur la figure 1B. La figure 2 illustre la fluorescence EGFP et l'EYFP dans un seul z-stack au sein de la moelle épinière ventrale. Acquisition de z-piles consécutives peut être compilé pour produire des vidéos time-lapse pour analyser la dynamique cellulaire en temps réel dans le tissu intact. L'utilisation d'un dichroïque 520 nm bord unique et un 560 nm bord unique diviseur de faisceau dichroïque, comme indiqué dans le protocole, peut séparer le signal eGFP et EYFP. Les canaux individuels peuvent être pseudocolored logiciel vert et jaune en utilisant l'imagerie.
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Figure 1: la moelle épinière et la configuration de microscope. (A) Un moelle épinière incorporé dans un gel d'agarose à 5% (à gauche) et montée sur une lamelle couvre-objet suivant élimination de l'excès d'agarose (à droite). (B) Une image de la configuration de microscope avec des composantes fondamentales marquées. 1. bain-marie réglé à 37 ° C. 2. préchauffé RPMI-1640. 3. C / L du tube de pompe à vitesse variable. 4. Simple inline chauffe-solution. 5. Objectif de trempage. 6. thermomètre numérique. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Image Exemple 2P acquis à l'intérieur de la moelle épinière ventrale reconstructions 3D de la partie ventrale d'un non infectées, non endommagé (A) et JHMV infectées, démyélinisée (B) de la moelle épinière.à partir d'une Thy1-EYFP souris après la transplantation avec les PNJ eGFP-étiquetés. Axones marqués par fluorescence sont pseudocolored jaune et PNJ sont pseudocolored vert. Résolution de l'image: 512 pixels; volume d'image: (A) x = 239 um, y = 259 pm, z = 65 um construits en utilisant 26 z empilements espacés de 2,5 um à part et (B) x = 497 um, y = 389 pm, z = 127,5 pm construits en utilisant 51 z empilements espacés de 2,5 um d'intervalle.
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Discussion
En temps réel 2P imagerie du tissu intact est nécessaire pour enquêter sur la cinétique et interactions NPC après la transplantation dans la moelle épinière de souris démyélinisée. Imagerie intravitale 2P est couramment utilisé pour déterminer la dynamique cellulaire sur la face dorsale de la moelle épinière chez les souris vivant, et a été utilisé pour étudier dorsale démyélinisation maladie démyélinisante 17-19. Toutefois, en raison des PNJ transplantées migrent à la matière blanche ventrale, qui se trouve trop profonde à l'image in situ en utilisant la microscopie 2P, une préparation ex vivo est nécessaire. Cette méthodologie a été utilisée dans notre laboratoire afin de déterminer la motilité et la cinétique de la remyélinisation NPC transplantées dans la moelle épinière endommagée et non-endommagé 6. Ex vivo préparations permettent balayage de la moelle épinière non seulement longitudinalement, mais également transversalement à partir de la face ventrale 6,20 . Cela permet pour l'analyse des différences dans le mouvement cellulaire (vitesse et direction) et les interactions à la transplant emplacement, à proximité du site de transplantation, et à des distances différentes à partir du site de transplantation 6. Attendu que nous avons d'abord imaginé cette préparation à l'image transplanté NPC-eGFP sur la face ventrale de la moelle épinière, il peut être utilisé à ne importe quelle image de cellule marqué par fluorescence ou de la teinte ventrale, dorsale, ou sur les côtés latéraux en modifiant l'orientation de la moelle épinière est monté. Avantages de cette préparation sur l'imagerie intravitale inclure permettant l'imagerie de la face ventrale et sans la nécessité d'anesthésie et de la chirurgie de survie, qui est toujours nécessaire avec les nouvelles préparations intravitale utilisant une configuration "de la fenêtre de verre» qui permettent de multiples séances d'imagerie sans chirurgies répétées 19,21 . Il convient de noter que l'une des limites de cette procédure par rapport à l'approche «vitre» en combinaison avec l'imagerie intravitale est l'incapacité à obtenir de multiples points de temps à partir d'une seule souris, étant donné que la moelle est éliminée et la souris est euthanasiée.
Imagerie 2P est idéal pour résoudre la dynamique des cellules individuelles dans les tissus intacts 22,23. 2P excitation utilise des photons dans le proche infrarouge qui permettent pendant de longues périodes de l'imagerie des tissus profonds avec phototoxicité minime. 2P excitation se produit lors de l'absorption simultanée de deux photons par un fluorophore. La concentration élevée des photons nécessaires pour 2P excitation est réalisée par compression spatio-temporelle de la sortie du laser 2P dans un plan focal unique. Cela limite l'excitation fluorescente au point focal, ce qui réduit encore la phototoxicité dans les régions de la moelle épinière en dehors du plan focal. Photons dans le proche infrarouge ont également réduit la diffusion, ce qui permet l'imagerie jusqu'à environ 300 um à partir de la face ventrale de la moelle épinière 16.
Comme pour toute nouvelle technique, cependant, 2P imagerie de la moelle épinière explantée a des limites qui doivent être gardés à l'esprit. Ce protocole d'imagerie utilise un dichro 520 nmic miroir qui permet la séparation des eGFP et EYFP fluorescence en détournant eGFP émission dans le canal fluorescente généralement réservé à la lumière bleue. Génération de seconde harmonique créé par le collagène dans la moelle épinière apparaît également dans le canal bleu, mais est facilement distingués des cellules eGFP-étiquetés qui sont nettement plus brillant dans cette préparation, et qui ont une partie de leur émission identifiable dans le canal vert-jaune collagène ne fonctionne pas. Cette technique de mélange de canal et la séparation des différentes parties d'un spectre d'émission en utilisant dichroïques spécifiques est souvent utile pour une identification visuelle ou automatique de fluorophores individuelles avec des spectres d'émission à proximité ou près de chevauchement. Phototoxicité est une autre limitation de ce protocole d'imagerie 2P. Cellules dans un volume d'imagerie unique sont sensibles à la phototoxicité; par conséquent, expérimentateur devrait être tout à fait conscients des signes de phototoxicité. Phototoxicité est typiquement première évident dans la réduction ou l'absence de cellulemotilité, suivie par photoblanchiment et / ou des changements morphologiques dans les tissus locaux. Plusieurs facteurs peuvent endommager le tissu conduisant à la phototoxicité ou de rendre impropre à imagerie des cellules vivantes. Il est essentiel de contrôler la puissance du laser et de la température et de l'oxygénation du milieu RPMI-1640 perfusé. Il est également impératif pour assurer l'élimination correcte de la moelle épinière de la souris sans un étirement excessif ou la compression de la moelle épinière et sans couper la moelle épinière avec les lames. Il est manipulé correctement, la préparation de la moelle épinière explantée restera viable pour jusqu'à dix heures, tel que déterminé par la motilité cellulaire robuste au sein de la moelle épinière ventrale sans diminution à dix heures post-extraction. Une variété de tissu extrait est souvent imagé pendant de longues périodes de temps et considéré comme viable 23-26. Par conséquent, la quantification de la dynamique cellulaires dans plusieurs régions dans une seule moelle épinière est possible. Enfin, il convient de noter que la grande majorité des cellules that ne sont pas marqué par fluorescence sera pas visualisée par cette préparation (sauf si autofluorescentes naturellement), et il est important de reconnaître que les cellules marquées sont en interaction avec un environnement complexe d'autres cellules non marquées, apparemment invisibles endogènes et des éléments structuraux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
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