Protocol
الموافقة دراسة: تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل الوزارة الإيطالية للصحة (روما، ايطاليا) وفقا لDecreto legislativo 27 gennaio 1992، ن. 116 "Attuazione ديلا Direttiva ن 86/609 / CEE في خواص المواد دي protezione ديلي animali utilizzati وفيني sperimentali س إعلان ألتري فيني scientifici."
1. الحصول على عينات الجلد
- الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
- الأذن:
- قطع الجزء أصلع من آذان الفأر.
- الظهرية منفصل والجانب البطني عن طريق سحب بينهما بالملقط. إزالة أي غضاريف المتبقية عن طريق كشط بلطف الجزء الداخلي من الأذن مع ملقط.
- الجلد الجذع:
- حلق الجلد كله من الحيوان على حد سواء مع الحلاقة الكهربائية ومع محلول مزيل الشعر الدقيق.
- قطع عينة من الجلد المطلوبة (من 2 سم 2 حتى جلد الحيوان كله).
- إذا قطع ظهري كله وفينترال الجلد الماوس، وجعل قطع رأسي في منتصف الماوس مرة أخرى ثم قطع على طول حدود المناطق حلق في جميع أنحاء الجسم الماوس.
- فصل بلطف الجلد من الصفاق وعضلات الظهر، والحفاظ على عينة من الجلد لا يزال مع ملقط حين فصل عينة من الجلد مع إغلاق نصائح فوز جولة من مقص جراحي أو مشرط.
- إعداد لوحة الثقافة خلية 100 ملم تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
- القضاء على الدهون تحت الجلد عن طريق غمر عينة من الجلد في برنامج تلفزيوني في لوحة أعدت في الخطوة 1.3.3 وتجريف عينة من الجلد بالملقط.
- ذيل:
- قطع ذيل الماوس.
- جعل قطع رأسي على الذيل مع مقص جراحي أو مشرط جراحي، بدءا من قاعدة الذيل وصولا الى طرف الذيل.
- استخدام ملقط لفصل الجلد من الذيل. الاستيلاء على حافة القطع في قاعدة الذيل وسحب بلطف نحو الطرف في حين عقدالجسم من الذيل مع ملقط.
- إزالة أي الدهون الزائدة عن طريق كشط بلطف عينة من الجلد.
- قاطع الطريق
- قطع القدم الماوس كامل مع مقص جراحي. تجنب قطع أي الجلد شعر.
- قطع الجلد من القدم طوليا من الكاحل إلى بداية الأرقام.
- عقد عظام الكاحل مع ملقط أو باليد أثناء الاستيلاء على الجلد مع ملقط وسحب الجلد نحو الأرقام كما لو تقلع القفازات.
2. الهضم
- تحضير الكوكتيل الهضم من المحلول (المعدة كما هو الحال في قائمة المواد) مع الوصفة التالية: أنزيم مزيج (انظر قائمة هذه المواد لمواصفات) 300 ميكروغرام / مل، DNAse1 50 U / مل. تمييع في RPMI 5٪ FBS.
- ختم عينات الجلد مع مقص الى قطع صغيرة في طبق بتري 35 مم مع 2 مل من الهضم كوكتيل (للبشرة الجذع: 2 مل من كوكتيل الهضم كل 2 سم 2 من الجلد، وتصل إلى 3 مل المجموع).
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. يهز بلطف طبق بيتري 1-2 مرات خلال حضانة.
- صب عينات الجلد هضمها على مصفاة 70 ميكرومتر الخلية في 66 طبق ملم بتري تحتوي على 1 مل من RPMI1640 5٪ FBS.
- غسل مصفاة مع 5 مل من RPMI 1640 FBS 5٪.
- ضغط على عينة من خلال مصفاة الخلية مع المكبس حقنة.
- الغطاس دافق، طبق بيتري ومصفاة مع 20 مل من RPMI1640 5٪ FBS، ونقل إلى أنبوب 50 مل.
3. الأجسام المضادة وصفها
- غسل تعليق تم الحصول عليها مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1٪ FBS (أو BSA).
- تسمية تعليق خلية تم الحصول عليها مع الأجسام المضادة المطلوبة.
- Resuspend والعينات في 100 ميكرولتر / عينة من مزيج يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من aCD16 / CD32 (استنساخ 2.4G2) المخفف في برنامج تلفزيوني 1٪ FBS.
- احتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية وذلك لمنع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة المطلوبة عن طريق مستقبلات لكرة القدم.
- إضافة الأجسام المضادة هو مبين في الجدول1.
- إعداد مزيج تمييع الأجسام المضادة المطلوبة في 100 ميكرولتر / عينة من برنامج تلفزيوني 1٪ FBS بتركيز 4 ميكروغرام / مل.
- إضافة 100 ميكرولتر من المزيج المعد في الخطوة 3.2.3.1 لكل عينة حتى أنه في الأنبوب، وسوف يكون هناك حجم 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة في تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتغطي من الضوء.
- تغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1٪ FBS، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج، تجاهل وطاف resuspend في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1٪ FBS.
- إضافة دابي في تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل واحتضان عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء لمدة 10 دقيقة.
- تحليل العينات التي تم الحصول عليها عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- من أجل عزل الكريات البيض، استخدام استراتيجية النابضة التالية:
- أولا إزالة أي خلايا ميتة من قبل المعزولة على السكان DAPI-.
- اختر singlets لفي FSC-A مقابل FSC W مؤامرة كما هو مبين في الشكل رقم 1
- بوابة الخلايا استنادا إلى حجم وتحبب نموذجية من الكريات البيض من الفائدة.
- اختر CD45 + الخلايا في FSC-A مؤامرة CD45 كما هو مبين في الشكل 1.
- التمييز بين مجموعات مختلفة من الكريات البيض عن طريق التعبير عن علامات سطح النحو التالي:
- تحديد البلدان النامية كما CD11c و+ MHC II + الخلايا. ويمكن تحليلها في وقت لاحق للتعبير عن CD207 للتمييز خلايا لانغرهانس وCD207 + الجلدية البلدان النامية من CD207- الجلدية البلدان النامية.
- تحديد الضامة كما CD64 + الخلايا F4 / 80 +.
- تحديد الخلايا البائية إلى خلايا CD19 + MHCII +.
- تحديد الخلايا T كما CD8 + أو CD4 + الخلايا.
- من أجل عزل الكريات البيض، استخدام استراتيجية النابضة التالية:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم هضمها الجلد من منطقة مختلفة من الجسم وفقا للبروتوكول وصفها وملطخة الأجسام المضادة المشار إليها. وصفت استراتيجية المحاصرة في الشكل 1. حدد أول الخلايا الحية (خلايا DAPI-)، ثم البوابة على singlets ل(FSC-A مقابل FSC-W) وعلى خلايا لمفاوية مع التشكل (FSC-A مقابل SSC-A). عندما المشار إليها، ويتم اختيار خلايا CD45 + من أصل للدم.
وصفت البلدان النامية مع مكافحة CD11c و، -MHCII، و-CD45 الأجسام المضادة، ويتم تحديد الضامة كما F4 / 80 + CD64 + CD45 + الخلايا، الخلايا البائية كما CD19 + CD45 + MHCII + الخلايا، CD4 + T الليمفاوية كما CD4 + CD45 + الخلايا، والخلايا الليمفاوية CD8 + T والخلايا CD8 + CD45 + (الشكل 2).
هذه الطريقة غوarantees جدوى عالية من السكان يتفاعل مع أكثر من 50٪ من مجموع خلايا قابلة للحياة (DAPI-) في جميع مناطق الجلد التي يتم تحليلها (الشكل 3A). مؤشرا على عدد من CD45 + الخلايا تسفر لكل سم 2 وصفت في الشكل 3B.
يشار تقديرا لعدد من البلدان النامية، الضامة، الخلايا البائية وCD4 + أو خلايا CD8 + T الذي يمكن الحصول عليه من عملية الهضم من 1 سم 2 من الجلد الماوس في الشكل 3C.
تم ملطخة الشكل 1. تحديد خلايا المنشأ الجنينية في الجلد وحيدة الخلية تعليق. تعليق وحيدة الخلية مع دابي والأجسام المضادة لمكافحة CD45. بين الخلايا الحية (دابي السلبية)، ويتم تحليل singlets ل(FSC-A مقابل FSC-H) لتحديد الخلايا التي تحتوي على الكريات البيض مورفولوجيا (FSC-A مقابل SSC-A). يتم تحديد خلايا المنشأ الجنينية كما CD45 +.
هي بوابات الشكل 2. تحليل الخلايا المناعية الموجودة في الجلد الماوس المستمدة من مختلف المناطق. الخلايا كما هو مبين في الشكل 1. يتم تحديد البلدان النامية كما CD11c و+ MHC II + CD45 + الخلايا والملون في وقت لاحق مع CD207 للتمييز خلايا لانغرهانس وCD207 + الجلد البلدان النامية من CD207 -. يتم تحديد الضامة كما CD64 + F4 / 80 + CD45 + الخلايا. وتنقسم الخلايا اللمفية تي في CD8 + CD45 + الخلايا وخلايا CD4 + CD45 + الخلايا. ويتم تحديد الخلايا البائية إلى خلايا MHCII + CD19 + CD45 +. ويشار إلى النسب المئوية لمجموع الخلايا CD45 +.
الشكل 3. التحليل الكمي من الخلايا المناعية الموجودة في الجلد الماوس من مختلف المناطق (أ) نسبة قابلة للحياة. (دابي -) الخلايا المشتقة من المناطق المشار إليها من الجلد الماوس. (ب) الأرقام المطلقة CD45 + الخلايا في مناطق مختلفة من الجلد الماوس أعرب في عدد من الخلايا لكل سم 2 من الجلد. (ج) عدد التقدير من البلدان النامية، MΦ، خلايا B وخلايا CD4 + أو خلايا CD8 + T المستمدة من 1 سم 2 من الجلد من المناطق المشار إليها من الجلد الماوس.
| الجسم المضاد | تلطيخ | تركيز | مرة | درجة الحرارة |
| البلدان الناميةمزج | ||||
| CD11c و | PE-Cy7 | 2 ميكروغرام / مل | 30 دقيقة | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| الضامة ميكس | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 ميكروغرام / مل | 30 دقيقة | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| T و B الخلايا ميكس | PE | 2 ميكروغرام / مل | 30 دقيقة | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
الجدول 1. مؤشرات لتلطيخ من مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية ملء الجلد. يشار إلى ثلاثة يمزج لتلطيخ من البلدان النامية، الضامة والخلايا اللمفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفناها طريقة لإعداد وحيدة الخلية تعليق من مختلف مناطق الجلد الماوس. طريقة الهضم الذي اعتمدناه، ليس فقط يعطي عوائد عالية ولكن أيضا يحافظ على التعبير عن علامات السطح، وهو أمر أساسي لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لاحق.
استخدام مزيج من كولاجيناز الأول والثاني وthermolysin، يضمن الحد الأدنى من دفعة لدفعة الاختلافات في نشاط انزيم يجعل هذا الأسلوب استنساخه للغاية. الأساليب الأخرى المنشورة تعتمد على الكوكتيلات انزيم مختلفة ولكن في أيدينا أنها تعطي عوائد أقل، والأهم، هي أقل استنساخه. لدينا وسيلة، ومع ذلك، لا يميز بين الخلايا ملء البشرة والخلايا ملء الأدمة. منذ ذلك الحين في كثير من الحالات، قد يكون من المفيد التمييز بين هذين مقصورات مختلفة، ونحن توجيه القارئ إلى هذه الأعمال السابقة التي تستخدم مثل هذه الأساليب. 15
في لدينا عينة التجربة الجلدالصورة من الأذن والذيل هي أسهل للهضم من الجلد الجذع حيث لابد من كشط بدقة من أجل جعل الأدمة الوصول إلى كوكتيل انزيم طبقة الشحوم تحت الجلد. في خطوة تشحيم دي، على الرغم فضلا عن القطع يجب أن يتم تنفيذ بسرعة وبلطف من أجل الحفاظ على بقاء الخلية. خطوة إزالة الشحوم لفترات طويلة أو وافية جدا يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا المناعية المقيمين في الجلد وبالتالي يؤدي إلى انخفاض العائد كثيرا وانخفضت قابلية الخلايا استردادها.
وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه من أجل الحفاظ على سلامة علامات سطح، يجب أن يتم تنفيذ عملية الهضم في تخلو المتوسط للحد من وكلاء مثل β-المركابتويثانول. لتجنب الضرر غير المرغوب فيها إلى السطح علامات، يجب أن تبقى فترة حضانة كما أقصر وقت ممكن، وعلى أي حال، وليس لفترة طويلة لأكثر من 90 دقيقة.
عناية خاصة وينبغي، أيضا، اتخذت عندما سكب عينات الجلد هضمها في الخليةمصفاة. ومن المهم أن اغسل الجلد هضمها من أجل يغسل خلايا المحررة قبل تحطيم عينة يتفاعل مع المكبس حقنة. مع هذه الخطوة يتم غسل عينة من الجلد من الخلايا المناعية المحررة التي ثم لا تخضع لأية ضغوط أكثر المادي. وينبغي أيضا أن يؤديها تحطيم بلطف لكي لا لقتل أي خلايا وكل من مصفاة الخلية والمكبس حقنة يجب غسلها جيدا في الخطوة غسل اللاحقة.
الجلد الهضم لا يمكن أن يؤديها كما في 50 مل الصقر في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. في هذه الحالة الجلد يمكن المفروم مسبقا ثم وضعت في أنبوب الصقر. لاحظ أن عينات الجلد يجب أن يغطس دائما في المخزن الهضم أثناء الحضانة والأذن قطع عصا على الجانبين من أنابيب الصقر. عند استخدام أنابيب الصقر، ولذلك، تأكد من القطع الإقامة الجلد المفروم غارقة في المتوسط الهضم.
يمكن أن يكون هذا الأسلوب مفيدا في أماهنيويورك إعدادات التجريبية المختلفة، وخاصة عند دراسة الجلد غير ملتهبة. أثناء الالتهاب، وتوسع الأوعية والأنسجة تورم تخفف بنية الأنسجة والخلايا المناعية من الدم ويتم تجنيد واسع للجلد. كفاءة الانتعاش الخلية، وبالتالي، أعلى من ذلك بكثير. في ظروف التماثل الساكن، وسيلة فعالة لهضم مصفوفة الكولاجين ضيقة من الأدمة هو، في الواقع، هناك حاجة لاستعادة الخلايا المناعية التي تشكل شبكة معقدة ملء الجلد.
قد يكون القارئ مهتما أيضا استعراضا شاملا يغطي المنشأ والنمط الظاهري للخلايا والضامة ملء الجلد في كل الظروف التماثل الساكن والتهابات شجيري مختلفة. 16
في إعدادات التجريبية المختلفة، وأجزاء مختلفة من الجلد الماوس يمكن علاجها. على سبيل المثال، في نماذج زرع الجلد، ويمكن زرع جزء من الذيل على جذع حيوان المستقبلة؛ عندما studyinز تشكيل ذمة أو إجراءات التحصين، وغالبا ما يتم حقن المحفزات على قاطع الطريق من الفئران، في حين كثيرا ما يستخدم الأذن لتقييم ذاكرة الخلايا التائية مع المقايسات المباشرة الى البيوت. مع أسلوبنا أننا يمكن أن كفاءة استخراج الخلايا المناعية المقيمين الجلد من مواقع مختلفة مما يجعل لدينا وسيلة مفيدة لإعداد تجريبي في الاختيار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
- Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
- Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. The Skin-Resident Immune Network. Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).
- Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
- Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
- Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
- Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
- Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
- Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
- Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
- Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
- Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
- Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
- Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
- Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
- Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
- Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).
