Protocol
l'approbation de l'étude: Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le ministère italien de la santé (Rome, Italie) selon le décret législatif 27 gennaio 1992, n. 116 "della Direttiva de attuazione n. 86/609 / CEE en materia di protezione degli animali utilizzati un fini Sperimentali o ad altri fini Scientifici."
1. Obtenir des échantillons de peau
- Euthanize la souris par dislocation cervicale.
- Oreille:
- Découpez la partie glabre des oreilles de souris.
- dorsale séparée et face ventrale en les tirant avec une pince. Retirez tous les cartilages restants en grattant doucement la partie intérieure des oreilles avec une pince.
- Trunk peau:
- Raser l'ensemble de la peau de l'animal à la fois avec un rasoir électrique et avec une lotion dépilatoire délicate.
- Couper l'échantillon de peau désirée (de 2 cm 2 à l'ensemble de la peau des animaux).
- Si coupant l'ensemble dorsale et êmela peau de la souris trale, faire une coupe verticale au milieu de la souris en arrière et puis couper le long des frontières des zones rasées autour du corps de la souris.
- Séparez délicatement la peau du péritoine et les muscles du dos, en gardant l'échantillon de peau encore avec la pince tout en séparant l'échantillon de peau avec les pointes à bords arrondis fermés de ciseaux chirurgicaux ou un scalpel.
- Préparer une plaque de culture cellulaire de 100 mm contenant 10 ml de PBS glacé.
- Éliminer la graisse sous-cutanée en immergeant l'échantillon de peau dans du PBS dans la plaque préparée à l'étape 1.3.3 et racler l'échantillon de peau avec des pinces.
- Queue:
- Couper la queue de la souris.
- Faire une coupe verticale sur la queue avec des ciseaux chirurgicaux ou d'un scalpel chirurgical, à partir de la base de la queue et atteignant à la pointe de la queue.
- Utilisez une pince pour détacher la peau de la queue. Prenez le bord de la coupe à la base de la queue et tirez doucement vers la pointe tout en maintenant lale corps de la queue avec une pince.
- Retirez tout excès de graisse en grattant doucement l'échantillon de peau.
- bandit
- Découpez le pied de la souris entière avec des ciseaux chirurgicaux. Éviter couper toute peau velue.
- Couper la peau du pied longitudinal de la cheville au début des chiffres.
- Tenir les os de la cheville avec une pince ou à la main tout en saisissant la peau avec une pince et tirer la peau vers les chiffres comme si le décollage d'un gant.
2. Digestion
- Préparer le cocktail de digestion de la solution mère (préparée comme dans la liste des matériaux) avec la recette suivante: Enzyme mix (voir la liste des matériaux pour les spécifications) 300 pg / ml, DNAse1 50 U / ml. Diluer dans RPMI 5% de FBS.
- Hacher les échantillons de peau avec des ciseaux en petits morceaux dans un plat de 35 mm de Pétri avec 2 ml de cocktail Digestion (Pour la peau du tronc: 2 ml de cocktail de Digestion tous les 2 cm 2 de peau, jusqu'à 3 ml au total).
- Incuber à 37 ° C pendant 90 min. Secouer doucement la boîte de Pétri 1-2 fois pendant l'incubation.
- Verser les échantillons digérés de la peau sur un tamis de 70 um cellulaire dans 66 mm plat de Pétri contenant 1 ml de RPMI1640 5% de FBS.
- Laver le filtre avec 5 ml de RPMI 1640 5% de FBS.
- Presser l'échantillon à travers le tamis cellulaire, avec un piston de seringue.
- plongeur Flush, boîte de Pétri et la crépine avec 20 ml de RPMI1640 5% de FBS, transférer dans 50 ml tube.
3. Anticorps et étiquetage
- Laver la suspension obtenue deux fois avec 5 ml de PBS 1% de SFB (ou BSA).
- L'étiquette de la suspension cellulaire obtenue avec les anticorps désirés.
- Remettre en suspension les échantillons dans 100 ul / échantillon d'un mélange contenant 2 pg / ml d'aCD16 / CD32 (clone 2.4G2) dilué dans du PBS 1% de FBS.
- Incuber pendant 15 min à 4 ° C afin de bloquer la liaison non spécifique des anticorps désirés par l'intermédiaire des récepteurs Fc.
- Ajouter les anticorps indiqués dans le Tableau1.
- Préparer un mélange en diluant les anticorps souhaités dans 100 ul / échantillon de PBS 1% de FBS à une concentration de 4 pg / ml.
- Ajouter 100 ul du mélange préparé à l'étape 3.2.3.1 à chaque échantillon de telle sorte que dans le tube, il y aura un volume de 200 ul d'anticorps mélange à une concentration finale de 2 pg / ml.
- Incuber pendant 30 min à 4 ° C et couvrir de la lumière.
- Laver avec 1 ml de PBS 1% de FBS, centrifuger pendant 5 min à 400 g, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 300 pi de PBS 1% de FBS.
- Ajouter DAPI à une concentration finale de 2 pg / ml et on incube à 4 ° C, à l'abri de la lumière pendant 10 min.
- Analyser les échantillons obtenus par FACS.
- Afin d'isoler les leucocytes, utilisez la stratégie de déclenchement suivant:
- Tout d'abord éliminer les cellules mortes par gating sur la population de DAPI-.
- Sélectionnez singulets dans le FSC-A vs. FSC W parcelle tel qu'indiqué dans la Figure 1
- Porte les cellules en fonction de la taille et de la granularité typique des leucocytes d'intérêt.
- Sélectionnez CD45 + cellules dans le FSC Une parcelle de CD45 comme indiqué sur la figure 1.
- La distinction entre les différentes populations de leucocytes par l'expression de marqueurs de surface comme suit:
- Identifier les PED comme CD11c + cellules MHC II +. Ceux-ci peuvent être analysés plus tard pour l'expression de CD207 pour distinguer les cellules de Langerhans et CD207 + Dermal DC de CD207- Dermal PED.
- Identifier Macrophages que / 80 + cellules CD64 + F4.
- Identifier les cellules B que les cellules CD19 + CMHII +.
- Identifier les cellules T CD8 + ou les cellules CD4 +.
- Afin d'isoler les leucocytes, utilisez la stratégie de déclenchement suivant:
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Representative Results
Peau de l'autre région du corps a été digéré selon le protocole décrit et colorées avec les anticorps indiqués. La stratégie de déclenchement est représenté sur la figure 1. Tout d' abord sélectionner les cellules vivantes (cellules DAPI-), puis porte sur singulets (FSC-A vs. FSC-W) et sur des cellules ayant une morphologie des lymphocytes (FSC-A vs SSC-A). Lorsque cela est indiqué, les cellules CD45 + d'origine hématopoïétique sont sélectionnés.
DC sont marqués avec anti-CD11c, -MHCII et -CD45 anticorps, Macrophages sont identifiés comme F4 / 80 + CD64 + CD45 +, des cellules B CD19 + CD45 comme + MHCII + cellules, les lymphocytes T CD4 + que CD4 + CD45 + les cellules et les lymphocytes T CD8 + que les cellules CD8 + CD45 + (figure 2).
Cette méthode guarantees haute viabilité de la population digérée avec plus de 50% de cellules viables totales (DAPI-) dans toutes les régions de la peau qui sont analysés (figure 3A). Une indication du nombre de cellules CD45 + donné par cm 2 est représenté sur la figure 3B.
Une estimation du nombre total des CD, des macrophages, des cellules B et T CD4 + ou CD8 + T pouvant être obtenu à partir de la digestion de 1 cm2 de peau de souris est indiqué sur la figure 3C.
Figure 1. Identification des cellules d'origine hématopoïétique dans la peau des suspensions monocellulaires. Les suspensions de cellules uniques ont été colorées avec du DAPI et l'anticorps anti-CD45. Parmi les cellules vivantes (DAPI-négatif), singulets (FSC-A vs FSC-H) sont analysés pour sélectionner les cellules avec leucocytaire morphologie (FSC-A vs SSC-A). Les cellules d'origine hématopoïétique sont identifiés comme étant CD45 +.
Figure 2. Analyse des cellules immunitaires présentes dans la peau de souris dérivées de différentes régions. Les cellules sont gated comme indiqué sur la figure 1. DCs sont identifiés comme CD11c + CMH II + cellules CD45 +, puis colorées avec CD207 de distinguer les cellules de Langerhans et CD207 + dermique DC de CD207 -; Macrophages sont identifiés comme CD64 + / 80 cellules F4 + CD45 +; Les lymphocytes T sont divisés en cellules CD8 + CD45 + et les cellules CD4 + CD45 + cellules; Les cellules B sont identifiées comme étant des cellules CD19 + MHCII + CD45 +. Les pourcentages sont appelés les cellules CD45 + au total.
La figure 3. L' analyse quantitative des cellules immunitaires présentes dans la peau de souris provenant de différentes régions (A) Pourcentage de viabilité. (DAPI -) des cellules dérivées des régions de la peau de souris indiqués. (B) Les chiffres absolus CD45 + cellules dans les différentes régions de la peau de souris exprimés en nombre de cellules par cm 2 de peau. (C) Nombre estimé de DC, MΦ, les cellules B et CD4 + ou des cellules CD8 + T dérivées de 1 cm 2 de peau à partir des régions de la peau de souris indiquées.
| Anticorps | tachant | Concentration | Temps | Température |
| DCMélanger | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 pg / ml | 30 minutes | 4 ° C |
| II du CMH | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| macrophages Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 pg / ml | 30 minutes | 4 ° C |
| II du CMH | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| les lymphocytes T et B Mix | PE | 2 pg / ml | 30 minutes | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tableau 1. Les indications de la coloration des différentes populations de cellules immunitaires qui peuplent la peau. Les trois mélanges sont indiquées pour la coloration des CD, des macrophages et des lymphocytes.
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Discussion
Nous avons décrit un procédé pour la préparation de suspensions monocellulaires à partir de différentes régions de la peau de la souris. La méthode de la digestion, nous avons adopté, donne non seulement des rendements élevés mais préserve aussi l'expression de marqueurs de surface, ce qui est fondamental pour l'analyse FACS ultérieure.
L'utilisation d'un cocktail de collagénase I et II et de la thermolysine, garantit lot minimum des différences de traitement par lots dans une activité enzymatique qui rend cette méthode extrêmement reproductible. D'autres méthodes publiées reposent sur différents cocktails d'enzymes, mais dans nos mains, ils donnent des rendements inférieurs et, plus important encore, sont moins reproductibles. Notre méthode, cependant, ne fait pas de discrimination entre les cellules qui peuplent l'épiderme et des cellules qui peuplent le derme. Etant donné que dans de nombreux cas , il pourrait être utile de faire la distinction entre ces deux compartiments différents, nous dirigeons le lecteur à ces travaux antérieurs qui utilisent de telles méthodes 15.
Dans notre échantillon de peau d'expériences de l'oreille et la queue sont plus faciles à digérer que la peau du tronc où la couche de graisse sous-cutanée doit être grattée à fond afin de rendre le derme accessible au cocktail enzymatique. L'étape de dégraissage, mais aussi bien que la coupe doit être effectuée rapidement et en douceur afin de maintenir la viabilité des cellules. Une étape de dégraissage prolongée ou trop en profondeur peut entraîner des dommages aux cellules du système immunitaire réside dans la peau et par conséquent se traduire par un rendement beaucoup plus faible et une diminution de la viabilité des cellules récupérées.
Il convient également de noter que, pour préserver l'intégrité des marqueurs de surface, la digestion doit être réalisée dans un milieu dépourvu d'agents tels que le β-mercaptoéthanol réducteur. Pour éviter des dommages indésirables à la surface des marqueurs, le temps d'incubation doit être aussi courte que possible et, en tout état de cause, ne se prolonge pas pendant plus de 90 min.
Une attention particulière doit être, également, pris lors de la coulée des échantillons digérés de la peau dans la cellulepassoire. Il est important de se laver soigneusement la peau digérée afin de laver les cellules libérées avant de défoncer l'échantillon digéré avec le piston de la seringue. Avec cette étape, l'échantillon de peau est lavé à partir des cellules immunitaires libérés qui alors ne subissent aucune contrainte physique. L'écrasement doit également être effectué en douceur afin de ne pas tuer toutes les cellules et tous les deux le filtre cellulaire et le piston de la seringue doivent être soigneusement lavés à l'étape ultérieure de lavage.
la digestion de la peau peut également être réalisée dans un falcon de 50 ml dans un bain d'eau à 37 ° C. Dans ce cas, la peau peut être coupé à l'avance et ensuite placé dans le tube de faucon. On notera que les échantillons de peau doit toujours être immergé dans un tampon de digestion pendant l'incubation et que les oreillettes collent aux côtés des tubes Falcon. Lors de l'utilisation des tubes Falcon, par conséquent, assurez-vous que les pièces de séjour de la peau hachée immergés dans le milieu de la digestion.
Cette méthode peut être utile dans many différents paramètres expérimentaux, en particulier lorsque l'on étudie la peau non enflammée. Au cours de l'inflammation, la vasodilatation et l'enflure des tissus desserrer la structure du tissu et les cellules immunitaires du sang sont massivement recrutés pour la peau. L'efficacité de la récupération des cellules est donc beaucoup plus élevée. Dans des conditions homéostatiques, un moyen efficace pour digérer la matrice de collagène du derme serré est, en effet, nécessaire afin de récupérer la cellule immunitaire constituant le réseau complexe peupler la peau.
Le lecteur peut également être intéressé par un examen complet qui couvre l'origine et le phénotype des différentes cellules et les macrophages qui peuplent la peau dans les deux conditions homéostatiques et inflammatoires dendritiques. 16
Dans différents paramètres expérimentaux, les différentes parties de la peau de la souris peuvent être traitées. Par exemple, dans des modèles de transplantation de la peau, une partie de la queue peut être transplanté sur le tronc d'un animal ayant reçu; lorsque studyIng formation d'un oedème ou des procédures d'immunisation, les stimuli sont souvent injectés dans le coussinet plantaire de souris, tandis que l'oreille est fréquemment utilisé pour évaluer la mémoire des lymphocytes T avec les dosages par SRD. Avec notre méthode, nous pourrions efficacement extraire les cellules immunitaires résidentes de la peau de différents endroits rendant notre méthode utile pour le réglage expérimental de choix.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
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