別のマウス皮膚の領域から細胞蛍光分析のための単一細胞懸濁液の調製

Protocol

研究の承認：実験プロトコルはDecretoに応じた保健のイタリア省（ローマ、イタリア）によって承認された27 gennaio 1992 legislativo、n個。 116「AttuazioneデッラDirettivaのn。609分の86 / CEEでマテリアディprotezioneデッリanimali utilizzati Aフィニsperimentali O広告altriフィニscientifici。」

1.皮膚サンプルを入手

1. 頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
2. 耳：
   1. マウスの耳の毛のない部分を切り取ります。
   2. 鉗子でそれらを引き離すことにより、独立した背と腹側。静かにピンセットで耳の内側の部分をこすることによって、残りの軟骨を取り除きます。
3. トランク皮膚：
   1. 電気かみそりで、繊細な脱毛ローションで両方の動物の皮膚全体を剃ります。
   2. （2 cm ²で全動物の皮膚まで）所望の皮膚サンプルを遮断。
      1. 全体の背側を切断した場合とVENクトルのマウスの皮膚は、バックした後、マウス本体の周りの毛を剃った領域の境界線に沿って切断し、マウスの真ん中の縦のカットを行います。
      2. 静かに手術用ハサミやメスの閉じラウンドエッジの先端で皮膚のサンプルを分離しながら、鉗子でまだ皮膚サンプルを保ち、腹膜や背中の筋肉から皮膚を分離します。
   3. 氷冷PBSの10ミリリットルを含む100ミリメートル細胞培養プレートを準備します。
   4. ステップ1.3.3で製造したプレートにPBSで皮膚サンプルを浸漬し、鉗子で皮膚試料をこすることによって皮下脂肪を除去します。
4. 尾：
   1. マウスの尾を切り落としました。
   2. 尾の基部から始まり、尾の先端に到達し、手術用はさみまたは外科メスで尾の垂直カットを行います。
   3. 尾から皮膚を分離するために鉗子を使用してください。尾の基部にカットのエッジをつかみ、そっと押さえながら先端に向かって引っ張ります鉗子で尾の体。
   4. 優しく皮膚試料をこすることによって、任意の余分な脂肪を取り除きます。
5. 追いはぎ
   1. 手術用ハサミでマウス全体の足を切り取ります。任意の有毛皮膚を切断回避。
   2. 数字の先頭に縦方向に足首から足の皮膚をカット。
   3. 鉗子で皮膚をつかんながら鉗子でまたは手で足首の骨を持ち、手袋を脱いでいるかのように数字に向かって皮膚を引っ張ります。

2.消化

1. 酵素ミックス（仕様のための材料リストを参照してください）​​300μgの/ mlの、DNAse1 50 U / mlの次のレシピ（材料リストのように調製）ストック溶液から消化カクテルを準備します。 RPMI 5％FBS中で希釈します。
2. （：消化カクテルの2ミリリットル皮膚のあらゆる2 cm ²で、最大3 mlの全トランク肌用）消化カクテルの2ミリリットルと35ミリメートルペトリ皿に小片にハサミで皮膚サンプルをみじん切りに。
3. 90分間37℃でインキュベートします。ゆっくりインキュベーション中のペトリ皿に1-2回振ります。
4. RPMI1640 5％FBSの1ミリリットルを含む66ミリメートルペトリ皿に70μmのセルストレーナーに消化された皮膚試料を注ぎます。
5. RPMI 1640の5ミリリットルの5％FBSでストレーナーを洗ってください。
6. シリンジプランジャと細胞ストレーナーを通して試料を絞ります。
7. フラッシュプランジャー、RPMI1640 5％FBSの20ミリリットルとペトリ皿とストレーナ、50ミリリットルチューブに移します。

3.抗体とラベリング

1. PBS、1％FBS（またはBSA）の5ミリリットルで二回得られた懸濁液を洗​​ってください。
2. 所望の抗体で得られた細胞懸濁液にラベルを付けます。
   1. 100μlのサンプルを再懸濁/ PBS、1％FBS中で希釈したaCD16 / CD32（クローン2.4G2）を2μg/ mlを含むミックスのサンプル。
   2. Fc受容体を介して、所望の抗体の非特異的結合をブロックするために4℃で15分間インキュベートします。
   3. 表に示した抗体を追加します。1。
      1. 4μg/ mlの濃度でPBS、1％FBSを100μl/サンプル中の所望の抗体を希釈ミックスを調製します。
      2. チューブに、2μgの/ mlの最終濃度で抗体混合物200μlの容量が存在することになるように、各サンプルにステップ3.2.3.1で準備ミックス100μlのを追加します。
   4. 4℃で30分間インキュベートし、光から覆います。
3. PBS、1％FBSの1ミリリットル、400×gで5分間の遠心分離で洗浄し、PBS、1％FBSの300μlの上清および再懸濁を捨てます。
4. 2μg/ mlの最終濃度でDAPIを加え、10分間、光から保護し、4℃でインキュベートします。
5. FACSによって得られた試​​料を分析します。
   1. 白血球を単離するために、以下のゲーティング戦略を使用します。
      1. まずDAPI-集団に対してゲートすることによって、任意の死細胞を排除します。
      2. 図1に示すように、FSCのWプロット対FSC-Aにシングレットを選択
      3. ゲート関心の白血球の典型的な大きさと細かさに基づいてセル。
      4. 図1に示すようにFSC-CD45プロットでCD45 +細胞を選択します。
   2. 次のように、表面マーカーの発現によって、白血球の異なる集団を区別する。
      1. CD11c ⁺ MHC II ⁺細胞としてDCを識別します。これらは、後でCD207-皮膚樹状細胞からのランゲルハンス細胞及びCD207 +皮膚樹状細胞を区別するためにCD207の発現について分析することができます。
      2. CD64 + F4 / 80 +細胞としてマクロファージを識別します。
      3. CD19 + MHCII +細胞などのB細胞を識別します。
      4. CD8 +またはCD4 +細胞のようなT細胞を識別します。

Representative Results

体のさまざまな部位からの皮膚は、標識した抗体を用い説明し、染色されたプロトコルに従って消化しました。ゲーティング戦略は、まずシングレット（FSC-W対FSC-A）にし、リンパ球の形態（SSC-A対FSC-A）を持つ細胞でライブ後、細胞（DAPI-細胞）、ゲートを選択し、図1に示されています。示された場合に、造血起源のCD45 ^+細胞が選択されます。

DCは、マクロファージは、F4 / 80 ⁺ CD64 ⁺ CD45 ⁺ CD4 ⁺ CD45 ⁺のようなCD19 ⁺ CD45 ⁺ MHCII ⁺細胞、CD4 ⁺ Tリンパ球のような細胞、B細胞として同定される、抗CD11cの、-MHCII、および-CD45抗体で標識されていますCD8 ⁺ CD45 ⁺細胞（ 図2）のような細胞、およびCD8 ⁺ Tリンパ球。

このメソッド区分析された皮膚の全ての領域における総生存細胞（DAPI-）の50％以上で消化人口（ 図3A）のarantees高い生存性。 CD45 ⁺細胞の数の表示は、 図3Bに示されている1cm ²当たりもたらします。

マウス皮膚の1cm ²の消化から得られたDC、マクロファージ、B細胞およびCD4 ⁺またはCD8 ⁺ T細胞の総数の推定値は、図3Cに示されています。

皮膚の単細胞懸濁液中の造血起源の細胞の図1の同定。単一細胞懸濁液を、DAPIおよび抗CD45抗体で染色されています。生細胞（DAPI陰性）の中で、シングレット（FSC-H対FSC-A）は白血球で細胞を選択するために分析されます形態（SSC-A対FSC-A）。造血起源の細胞は、CD45 ⁺として同定されます。

異なる領域に由来するマウスの皮膚に存在する免疫細胞の図2.分析。 図1に示すように、細胞がゲートされる。DCはのCD11c ⁺ MHC II ⁺ CD45 ⁺細胞として同定され、それ以降のランゲルハンス細胞を区別するためにCD207で染色し、CD207 ⁺されていますCD207から真皮のDC ^{- 。}マクロファージは、CD64 ⁺ F4 / 80 ⁺ CD45 ⁺細胞として同定されます。 Tリンパ球は、CD8 ⁺ CD45 ⁺細胞およびCD4 ⁺ CD45 ⁺細胞に分割されます。 B細胞は、MHCII ⁺ CD19 ⁺ CD45 ⁺細胞として同定されます。パーセンテージは、総CD45 ⁺細胞と呼ばれています。

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異なる地域からのマウスの皮膚に存在する免疫細胞の図3.定量分析 、生存の（A） の割合。（DAPI ^{- ）}マウス皮膚の示す領域に由来する細胞。マウス皮膚の異なる領域における（B）の絶対数のCD45 ⁺細胞は、皮膚の1cm ²当たりのセルの数で表されます。 DCの（C）を推定数、MΦ、B細胞とマウス皮膚を示した領域から皮膚の1cm ²の由来するCD4 ⁺またはCD8 ⁺ T細胞。

CD8a

抗体	染色	濃度	時間	温度
DCはミックス
CD11c	PE-Cy7の	2 / mlの	30分	4°C
MHC II	PE	「	「	「
CD45	PE-Cy5.5を	「	「	「
CD207	APC	「	「	「
マクロファージミックス
F4 / 80	APC-Cy7を	2 / mlの	30分	4°C
MHC II	PE	「	「	「
CD45	PE-Cy5.5を	「	「	「
CD64	PE-Cy7の	「	「	「
TおよびB細胞のミックス
PE	2 / mlの	30分	4°C
CD4	APC-Cy7を	「	「	「
CD19	APC	「	「	「
CD45	PE-Cy5.5を	「	「	「

皮膚を移植免疫細胞の異なる集団の染色表 1. 表示はスリーミックスはDCを、マクロファージおよびリンパ球の染色のために示されています。

Discussion

我々は、異なるマウス皮膚領域からの単一細胞懸濁液を調製するための方法を記載しています。我々が採用した消化の方法は、高い収率を与えるだけでなく、その後のFACS分析のために基本的な表面マーカーの発現を維持するだけでなく。

コラゲナーゼIおよびIIおよびサーモリシンのカクテルの使用は、この方法は、再現性の高い作り酵素活性のバッチの違いに最小バッチを保証します。他の公表された方法は、異なる酵素カクテルに依存しているが、我々の手で、彼らはより低い収率を与えると、もっと重要なのは、あまり再現性があります。私たちの方法は、しかし、表皮の移植細胞と真皮を移植する細胞を区別しません。多くの場合、それは、これら2つの異なる区画を区別することが有用である可能性があるため、我々はこのような方法を使用して、これらの以前の作品を読者に指示します^。15

我々の経験の皮膚試料中の耳と尾からの皮下グリース層は、徹底的に酵素カクテルに真皮にアクセスできるようにするために掻き取られなければならないトランク皮膚よりも消化しやすくなります。脱加脂工程、並びに切断は細胞の生存を維持するために、迅速かつ静かに行うべきであるけれども。長期化または脱脂工程は、皮膚内に常駐免疫細胞に損傷を与えるので、はるかに低い収量をもたらし、回収された細胞の生存率を低下させることができる、あまりにも徹底。

消化は、βメルカプトエタノールなどの還元剤を欠く培地中で行うべきで、表面マーカーの完全性を維持することもを留意すべきです。マーカー表面への不要な損傷を回避するために、インキュベーション時間は、できるだけ短くとして保たれるべきであり、いずれにしても、以上90分間延長しません。

細胞内に消化された皮膚サンプルを注ぐときに、特に細心の注意を、また、取られるべきですストレーナ。徹底的にシリンジプランジャで消化されたサンプルを壊し前に遊離した細胞を洗い流すために、消化皮膚を洗浄することが重要です。このステップでは皮膚サンプルは、任意のより多くの物理的なストレスを受けない遊離した免疫細胞から洗浄されます。スマッシングは、任意の細胞を死滅させないために穏やかに行われるべきであり、セルストレーナーとシリンジプランジャの両方が完全に続く洗浄工程で洗浄されるべきです。

皮膚の消化はまた、37℃の水浴中で、50mLのファルコンで行うことができます。この場合、スキンは、予め細断することができ、その後、ファルコンチューブに入れました。皮膚試料は常にインキュベーション中に消化緩衝液中に沈めなければならず、その耳片がファルコンチューブの側面に固執することに注意してください。ファルコンチューブを使用する場合は、したがって、消化培地に沈めみじん切り皮膚料金の作品を確認してください。

この方法は、ミリアンペアに役立ちます特に非炎症を起こした皮膚を研究nyの異なる実験の設定、。炎症、血管拡張および組織の間に血液から組織および免疫細胞の構造を緩める腫れ大規模な肌に補充されます。細胞回収の効率は、従って、非常に高いです。恒常性条件下で、真皮のタイトコラーゲンマトリックスを消化するための効果的な方法は、実際には、皮膚を移入複雑なネットワークを構成する免疫細胞を回収するために必要とされます。

また、読者は、恒常性および炎症性の両方の条件に皮膚を移植異なる樹状細胞およびマクロファージの起源と表現型をカバーする包括的なレビューに興味があるかもしれません^。16

別の実験設定では、マウスの皮膚の異なる部分を処理することができます。例えば、皮膚移植モデルで、尾の部分が受けた動物の胴体に移植することができます。 studyinとき耳はしばしばDTHアッセイでT細胞記憶を評価するために使用されるG浮腫形成または免疫化手順は、刺激は、多くの場合、マウスの足蹠に注射します。私たちの方法で、私たちは、効率的な選択の実験設定のための私達の方法が有用となるの異なる場所から皮膚常駐免疫細胞を抽出することもできます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Supplemented RPMI 1640 medium			RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml]
Materials
Surgical Scissors
Surgical Forceps
Surgical Scalpel
35 mm Petri dishes
66 mm Petri dishes
100 mm Petri dishes
70 µm Cell Strainers	BD	352350
Digestion cocktail			Dilute in RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 µg/ml
DNAse1			50 U/ml
Antibodies
Name	Company	Clone	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC