Abstract
وتتطلب التنمية الخلايا T داخل الغدة الصعترية لشبكه ثلاثي الأبعاد معقدة تتألف من خلايا انسجة مختلفة، أي خلايا غير-T. Thymocytes تجتاز هذه السقالة في النظام الزمني والمكاني منسق للغاية في حين يمر بالتتابع نقاط تفتيش إلزامية، أي T التزام النسب الخلية، تليها T مستقبلات الخلايا الجيل ذخيرة واختيار قبل تصديرها إلى الهامش. الاثنان أنواع الخلايا المقيمين الرئيسية تشكيل هذه السقالة هي الخلايا الظهارية الغدة الصعترية القشرية (cTECs) والنخاعية (mTECs). ومن السمات الرئيسية لmTECs هو ما يسمى التعبير منحل العديد من المستضدات المقيدة الأنسجة. يتم عرض هذه المستضدات المقيدة الأنسجة لغير ناضجة thymocytes بشكل مباشر أو غير مباشر عن طريق mTECs أو الخلايا الجذعية الغدة الصعترية، مما أدى على التوالي في التسامح مع النفس.
مناسبة في المختبر نماذج محاكاة الممرات وظائف التنموية للcTECs وmTECs هي أمريكا اللاتينية والكاريبي حالياالملك. هذا النقص في نماذج تجريبية كافية وعلى سبيل المثال أعاق تحليل التعبير الجيني منحل، التي لا تزال غير مفهومة على المستوى الخلوي والجزيئي. نحن تكييفها لعضوي النمط نموذج التعاون ثقافة 3D لثقافة فيفو السابقين mTECs معزولة. وقد وضع هذا النموذج في الأصل لزراعة القرنية في مثل هذه الطريقة لتوليد ما يعادل الجلد في المختبر. نموذج 3D الحفاظ على ميزات وظيفية رئيسية من MTEC البيولوجيا: (ط) انتشار والتمايز النهائي من CD80 ها اير سلبية في CD80 مرحبا، اير إيجابية mTECs، (ب) الاستجابة لRANKL، و (ج) التعبير متواصلة من FoxN1، اير والجينات المقيدة الأنسجة في CD80 mTECs مرحبا.
Introduction
thymocytes تطوير يشكلون نحو 98٪ من الغدة الصعترية، في حين تتكون المتبقية 2٪ من مجموعة متنوعة من الخلايا التي تؤلف مجتمعة سدى الغدة الصعترية (أي الخلايا الظهارية، والخلايا الجذعية، الضامة، والخلايا B، الخلايا الليفية والخلايا البطانية). الخلايا الظهارية القشرية الخارجية (cTECs) حصاد هجرة الخلايا الموالية-T من نخاع العظم، T نسب الخلية الاستقراء في الخلايا ما قبل-T متعددة القدرات واختيار الإيجابية للMHC الذاتي قيدت thymocytes غير ناضجة. وتشارك الخلايا النخاعية الداخلية الغدة الصعترية الظهارية (mTECs) في الحث التسامح من تلك thymocytes مع تقارب عالية TCR للمجمعات الببتيد الذاتي / MHC إما عن طريق إحداث اختيار سلبية أو انحرافها إلى الخلايا التائية التنظيمية النسب. في سياق الحث التسامح المركزي، mTECs هي فريدة من نوعها من حيث أنها تعبر عن طيف واسع من المستضدات الذاتية المقيدة الأنسجة (ترا) مما يعكس الطرفية النفس. وتسمى هذه الظاهرة منحل التعبير الجيني (فريق الخبراء الدائم)1،2.
معظم الدراسات الحالية على هذا النوع من الخلايا رائعة تعتمد على الخلايا المعزولة خارج الحي، ومختلف النظم ثقافة 2D المدى القصير أدت دائما في خسارة فريق الخبراء الدائم والجزيئات منظم رئيسية مثل الطبقة MHC II، FoxN1 واير في غضون أيام 2 الأولى 3-6 . ومع ذلك فإنه لا يزال غير واضح، والتي مكونات وملامح شبكه 3D سليمة من الغدة الصعترية معينة في عداد المفقودين في نماذج 2D. كانت الثقافة الجهاز الغدة الصعترية إعادة التجميع (RTOC) حتى الآن هو النظام الوحيد الذي يسمح 3D دراسة تطوير الخلايا T، من جهة، وبيولوجيا الخلايا اللحمية، من ناحية أخرى، في المكروية الغدة الصعترية سليمة 7. بعد، RTOCs دينا بعض القيود، أي أنها تحتوي بالفعل خليط معقد من الخلايا، تتطلب مدخلات خلايا انسجة الجنين ويدوم فترة ثقافة القصوى من 5 إلى 10 أيام.
عدم وجود اختزالية في نظم الاستزراع المختبر أعاق دراسةعدة جوانب T تطوير خلية والتوتة توالد ليس أقلها التنظيم الجزيئي للفريق الخبراء الدائم وعلاقته البيولوجيا التطورية من mTECs.
نظرا لقرب القرابة للمنظمة تنظيما للخلايا الظهارية من الجلد والغدة الصعترية، اخترنا ثقافة عضوي النمط (OTC) نظام 3D التي وضعت أصلا لمحاكاة تمايز الخلايا القرنية في المختبر، وبالتالي خلق معادل الجلد. ويتكون النظام OTC من مصفوفة سقالة الخاملة مضافين مع الخلايا الليفية الجلدية التي المحاصرين في هلام الليفين، على الذي هي المصنفة الكيراتينية 8،9. هنا، فإننا استبدال الخلايا الكيراتينية مع mTECs تنقيته. مع الحفاظ على السمات الأساسية لهذا النموذج، ونحن الأمثل معايير معينة.
في نموذج OTC اعتمدت انتشرت mTECs، خضع التمايز النهائي والحفاظ على الهوية MTEC وفريق الخبراء الدائم، ومحاكاة بالتالي عن كثب في الجسم الحي تطوير mTECs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد اعتمدت هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات Regierungspräsidium كارلسروه. وتم إيواء جميع الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض محددة في مركز أبحاث السرطان الألماني (DKFZ). لجميع الجراء تجارب زراعة الماوس تتراوح 1-7 أيام من العمر استخدمت.
1. عزل mTECs من الغدة الصعترية
ملاحظة: تم إجراء الخطوات التالية الهضم كما هو موضح سابقا 1 تحت ظروف معقمة مع بعض التعديلات على النحو التالي.
- قطع رأس الجراء الماوس وإزالة الغدة الصعترية. ضع التوتة على الجليد في طبق بتري تحتوي RPMI 1640 المتوسطة (التي تحتوي على 5٪ FCS).
- قطع التوتة في الدقيقة، وقطع صغيرة ووضعها في أنبوب أسفل مستديرة مع ~ 5-30 مل وسائل الاعلام RPMI ويحرك برفق باستخدام مغناطيس لمدة 10 دقيقة في RT.
- بعد ذلك، صب طاف تحتوي أساسا thymocytes وهضم بالتتابع الأنسجة المتبقية مع جولة واحدة من collagenaحد ذاته نوع IV (0.2 ملغ / مل و 57 U / مل concentartion النهائي) لمدة 15 دقيقة لكل منهما على 37 درجة مئوية، تليها كولاجيناز / dispase (0.2 ملغ / مل وتركيز النهائي 1.2 U / مل) لمدة 25 دقيقة لكل منهما على 37 درجة C في حمام مائي مع التحريك المغناطيسي حتى التوتة يتم هضمها تماما. استخدام 1 مل انزيم في 02:58 التوتة.
- تستنهض الهمم الأنسجة مرة كل 7-10 دقيقة مع ماصة باستور. تجميع كولاجيناز / dispase الكسور وتصفية من خلال الشاش 70 ميكرون.
- إثراء mTECs بواسطة الخلايا المغناطيسية الفرز (MACS). أداء تنقية mTECs بواسطة الخلايا المغناطيسية الفرز كما هو موضح سابقا 11، ومبين في الشكل 1.
ملاحظة: للحصول على الفرز المغناطيسي للmTECs استخدمنا الأجسام المضادة التالية: مكافحة CD80-PE (16-10A1، استخدامها في التخفيف 1: 100) ومكافحة EpCAM الحيوية (G8.8، استخدامها في التخفيف 1: 100) (12). وقد تم تحديد mTECs غير ناضجة وناضجة تستخدم أجهزة ماكينتوش على النحو التالي: CD45 - EpCAM + CD80 - وCD45 - CD80 + respectivاعل. - بعد MACS تنقية (نقاء mTECs غير ناضجة = 83.1 ± 6.3٪ وmTECs ناضجة = 79.23 ± 3.42٪)، والبذور وmTECs على الثقافات عضوي النمط كما هو موضح أدناه (القسم 2.3).
- بدلا من ذلك، mTECs الترتيب حسب FACS (باستخدام 100 ميكرون فوهة) بعد نضوب CD45 MACS باستخدام الأجسام المضادة التالية: مكافحة CD45-PerCP (30-F11، استخدم في التخفيف 1: 100)، ومكافحة Ly51-FITC (6C3، استخدم في 1 : 100 تمييع)، ومكافحة EpCAM-Alexa647 (G8.8، استخدم في 1: 500 تمييع) واستخدام الألغام المضادة للCD80-PE (16-10A1، في التخفيف 1: 100). استبعاد الخلايا الميتة باستخدام يوديد propidium (1: 5000) (يوم 4). وتم تحديد mTECs غير ناضجة وناضجة باستخدام FACS على النحو التالي: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - وPI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +، على التوالي.
2. 3D عضوي النمط المشارك الثقافات (OTCs)
ملاحظة: بنيات-3D الجلدي للزراعة عضوي النمط من keratinocytأعدت وفاق كما هو موضح سابقا 9،13. في جميع الخطوات وحضنت الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. أعدت OTCs باستخدام mTECs مع تعديلات طفيفة على النحو التالي.
- إعداد الخلايا الليفية الإنسان
ملاحظة: تم الحصول على الخلايا الليفية الجلدية الإنسان من الثقافات يزدرع من الأدمة-epidermised دي كما هو موضح سابقا 9.- باختصار، وقطع شرائح من جلد الإنسان (~ 5 سم طول) وعلاج مع thermolysin (0.5 ملغ / مل في المياه المالحة مع 10 ملي HEPES 7.4 درجة الحموضة) O / N عند 4 درجات مئوية.
- بعد ذلك، فصل البشرة من الأدمة باستخدام ملقط.
- قطع ناعما الأدمة إلى قطع صغيرة، ومكان في لوحة 10 سم بيتري والسماح ليجف لمدة 1-2 ساعة تحت تدفق الهواء المعقم. تكملة لل explants بانتظام مع DMEM تحتوي على 20٪ FBS.
- تقسيم الخلايا الليفية النمو بها عندما متموجة (عادة حوالي 3 أسابيع) باستخدام 0.1٪ التربسين والتأكد من أن إإكسبلنتس مواصلة الالتزام لوحة لمزيد من يخدعجولات secutive من ثمرة.
- توسيع الخلايا الليفية من نفس إإكسبلنتس لمدة تصل إلى 3 مرات في DMEM مع 10٪ FBS والبرد الحفاظ عليها 14. استخدام نفس دفعة من الخلايا الليفية لكل سلسلة التجريبية.
ملاحظة: لم يتم المشع والخلايا الليفية لمجموعة المتابعة من حكمه عن طريق الجلد.
- إعداد سقالة
- قطع 0،4-0،6 مم فسكوزي سميكة، ومادة ليفية محبوكة (تفاصيل المنتج في دعم ورقة اكسل) إلى دوائر ترسيمها جيدا باستخدام حاد 11 مم المعادن الناخس لتناسب بالضبط في 12 جيدا مرشح تدرج. ثم وضعه في 12- جيدا إدراج مرشح (البوليستر المسام الشعرية الغشاء، 3 ميكرون حجم المسام)، وسقالة. وضع الإعداد مرشح الكامل في العقيمة لوحة 12-جيدا.
- تحضير هلام الليفين باستخدام الفيبرين الغراء عدة لعملية جراحية تتكون من مزيج من الفيبرينوجين والثرومبين. قبل تمييع fibrinogen- فضلا عن الثرومبين مكون من مجموعة إلى 8 ملغ / مل و 10وحدة / مل على التوالي. للبئر واحدة من لوحة 12-جيدا المضي قدما على النحو التالي.
- تمييع 100 ميكرولتر الفيبرينوجين (8 ملغ / مل) مع 100 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم، ودرجة الحموضة 7.0. تمييع 100 ميكرولتر الثرومبين (10 وحدة / مل) مع 100 ميكرولتر FCS التي تحتوي على 270،000 الليفية.
- الاستغناء عن 200 ميكرولتر من ثرومبين التي تحتوي على الخلايا الليفية خلية خلط على منصة الاعدام، التي تضيف 200 ميكرولتر الفيبرينوجين (1: 1 خليط)، مما أدى إلى تركيز النهائي من الفيبرينوجين من 2 ملغ / مل والثرومبين من 2.5 وحدة / مل. تخلط جيدا وتوزيعها بالتساوي على كامل منطقة السقالة من قبل pipetting لطيف (يوم 1).
ملاحظة: بعد 30 دقيقة عند 37 ° C جلطة إحاطة الليفية سيكون قد شكلت، وملء تماما المساحات الداخلية للسقالة وتشكيل السطح العلوي على نحو سلس.
- شارك في الثقافة مع mTECs
- لمرحلة ما قبل الثقافة، submerse الثقافات الجهاز فيDMEM مع 10٪ FBS، 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك وL-1 نانوغرام / مل TGF-β1 مع تغيير المتوسط كل يوم لمدة 4-5 أيام.
- في يوم MTEC البذر، استبدل المتوسطة التي كتبها rFAD المتوسطة (1: 1 + DMEM DMEM / F12) مع 10٪ FBS، 10 -10 M بكتيريا الكوليرا، 0.4 ملغ / مل الهيدروكورتيزون، 50 ميكروغرام / مل حمض L-الأسكوربيك، يجند RANK (0.1 ميكروغرام / مل) و 500 وحدة / مل من أبروتينين، وبالتالي منع انحلال الفيبرين المبكر من قبل البروتياز سيرين تفرزها الخلايا الليفية.
- في وقت لاحق 8/7 ساعة، انشاء والثقافات مشترك من بذر 250000 mTECs (إما mTECs كاملة، أو CD80 CD80 فرعية لو ومرحبا)، في حجم 100 ميكرولتر لكل بئر على أعلى سقالة الليفية. عد الخلايا باستخدام غرفة نويباور (يوم 4).
ملاحظة: في جميع الأوقات مغمور الثقافات عضوي النمط 3D الصعترية في وسائل الإعلام على عكس OTCs الجلد التي هي من رفعت الهواء. - بعد 24 ساعة الحضانة، وتزويد الثقافات مع المتوسط (إجمالي التبادل المتوسط) على النحو المذكور أعلاه (الخطوة 2.3.2) الآن containiانخفاض نانوغرام مبالغ أبروتينين، 250 وحدة / مل (يوم 5).
- من أجل تقييم النشاط التكاثري من mTECs، إضافة ايدو (6.7 ميكرومتر / مل، أي 10 ميكرومتر / جيد) لOTCs لمدة 4 ساعة قبل انتهاء الثقافات. أداء تلطيخ OTC البرد أقسام كما هو موضح في أدوات ايدو التصوير جنبا إلى جنب مع زملاء تلطيخ الكيراتين 14. تحديد مؤشرات التكاثري من mTECs، إما عن طريق عد خلايا K14 + ايدو + في قسمين من كل عينة الثقافة أو عن طريق التدفق الخلوي (EDU التدفق الخلوي، القسم 1.7 ولكن بدلا من Ly51-FITC استخدام CDR1-PB 15 في التخفيف 1: 100 و2.3.6.4).
- بعد 4-7 أيام من الثقافة المشتركة، إنهاء OTCs وعملية عزل الحمض النووي الريبي، البرد باجتزاء أو تحليل FACS (يوم 11/8).
- إنهاء الثقافات باستخدام ملقط، وفصل ما يعادل سقالة / الجلد من مرشح من إدراج جيدا.
- لالبرد باجتزاء، تضمين OTC بأكملها في أكتوبر المجمع وتجميد في ليبخار النيتروجين مضغة قبل البرد باجتزاء. إعداد 5-7 ميكرون أقسام OTC سميكة باستخدام ناظم البرد وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. لالمناعية الكيمياء النسيجية من OTCs مقطوع البرد استخدام الألغام المضادة للالكيراتين 14 (AF64، استخدم في 1: 1000 تمييع)، ومكافحة vimentin (GP53، استخدم في 1: 100 تمييع) الأجسام المضادة. أداء غير مباشر تلطيخ المناعية الكيمياء النسيجية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية منها.
- لعزل الحمض النووي الريبي، إضافة 1 مل تغيير طبيعة الحل (التي تحتوي على الفينول وguanidinium ثيوسيانات) في سقف المسمار من أنبوب مجانا 2 مل ريبونوكلياز. قطع OTC كلها الى قطع مع مشرط وإضافة إلى الأنبوب الذي يحتوي الحل تغيير طبيعة. أجاد ميكانيكيا OTCs مع FastPrep أداة مرتين لمدة 30 ثانية بسرعة 6.0، ضع في بين على الجليد لمدة 2 دقيقة (يمكن تخزين العينة في -80 ° C بعد هذه النقطة). إذا المجمدة في -80 ° C، ذوبان الجليد على الجليد. أنابيب الطرد المركزي في 11،500-13،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل أنبوب جديد، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT ووollow بروتوكولات عزل الحمض النووي الريبي باستخدام حمض guanidinium استخراج ثيوسيانات الفينول كلوروفورم كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
- لتحليل FACS، إزالة السقالة وفصل الغشاء من الفيبرين / الليفية / MTEC هلام. قطع ناعما هلام مع مشرط وهضمه في أنبوب FACS ل~ 20 دقيقة أو حتى هضمها تماما مع 2 مل من كولاجيناز / dispase عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مع التحريك المغناطيسي. تستنهض الهمم الحل الانزيم مع ماصة باستور مرة واحدة كل 5 دقائق. بعد الهضم الكامل، تصفية تعليق الخلية من خلال مرشح 70 ميكرون. وصمة عار على تعليق خلية واحدة باستخدام الأجسام المضادة كما هو موضح في 1.7 و تحليل التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اعتمدنا 3D عضوي النمط نموذج التعاون الثقافة (3D OTC) التي وضعت أصلا لفي المختبر ثقافة على المدى الطويل من الخلايا الكيراتينية 9. وكانت المصنفة mTECs MACS التخصيب (انظر MACS تخصيب مخطط الشكل 1) على سقالة تتألف من هلام الليفين والخلايا الليفية شرك. توفر الخلايا الليفية المصفوفة خارج الخلية الأساسية (ECM) دعم mTECs في المختبر. تم الانتهاء من زراعة MTECs في OTCs عن 4-14 أيام بحضور RANKL في الثقافات المغمورة على عكس الخلايا الكيراتينية، والتي هي المعرضة للهواء محاكاة في الجسم الحي بيئتهم (انظر OTC الإعداد مخطط الشكل 2).
كلا فرعية MTEC تحليلها هنا (أي CD80 CD80 لو وmTECs مرحبا) نجا خلال الفترة ثقافة كاملة لمدة تصل إلى 14 يوما. وقد تم تحديد MTECs من قبل الكيراتين 14 التعبير وكان يمكن تمييزها بسهولة من الخلايا الليفية-vimentin الإيجابي (الشكل
المجموعات الفرعية MTEC نجا فحسب، بل انتشرت أيضا في ظل ظروف 3D OTC وفقا لتقييم ايدو التأسيس (الشكل 3C، 3D). ومن المثير للاهتمام، انتشرت على CD80 لو mTECs بمعدل أعلى في وجود RANKL، في حين أن العكس هو الصحيح لCD80 mTECs مرحبا 10.
بالإضافة إلى ذلك، CD80 لو mTECs متباينة في CD80 mTECs مرحبا بحضور RANKL في غضون 4 أيام من الثقافة، كما أشار إلى ذلك يصل التنظيم القوي CD80. أيضا الحفاظ على mTECs متباينة في التعبير عن اير، FoxN1 (الجينات وصrotein) أعرب وكذلك باباحه اير مستقل ومعتمد على ترا 10.
الشكل 1. MACS إثراء TECS. بعد الترشيح، وإثراء mTECs من الغدة الصعترية تعليق خلية واحدة باستخدام الخلايا المغناطيسية الفرز (MACS). أولا، تم استنفاد الأنساب الخلايا المكونة للدم باستخدام معاداة CD45 بلي. وCD45 - خلايا ثم تم تحضين مع مكافحة CD80 PE الأجسام المضادة، تليها مكافحة PE بلي. كانت شطافة تحتوي على CD80 + -mature mTECs مثقف مباشرة على OTCs، في حين تضمن التدفق من خلال CD80 - mTECs غير ناضجة والخلايا اللحمية الأخرى. وقد أثرى MTECs باستخدام مزيد من الأجسام المضادة وستربتافيدين بلي مكافحة EpCAM الحيوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مخطط لإعداد التدريجي للOTCs 3D. وضعت مصفوفة السقالة إلى تصفية إدراج 12-جيدا. والخلايا الليفية الجلدية من الجلد explanted (270000 خلية / OTC أيضا) تم تلقيح إلى هلام الليفين (التي تتكون من نسبة 1: 1 من الفيبرينوجين والثرومبين). وقد تستمر هذه حكمه الجلد لمدة 4-5 أيام مع DMEM + المواد الغذائية حتى mTECs (250000 خلية / OTC أيضا) والمصنف على رأس ومثقف مع المتوسط المخصب مع المواد الغذائية المختلفة (rFAD + المواد الغذائية).
الشكل 3. أنماط النمو وانتشار mTECs داخل OTCs. والمخصب CD80 لو mTECs تميل إلى النمو باعتبارها طبقة ثنائية على اتصال وثيق مع الخلايا الليفية (A)، ذوي الخوذات البيضاء ereas ومتباينة CD80 mTECs مرحبا تنمو المجاميع خلية أو مجموعات ضيقة (B). وصفت OTCs في يوم 4 من الثقافة مع المضادة للقرنين 14 (الأحمر) وأضداد vimentin (الأخضر) جنبا إلى جنب مع تلطيخ النووي (هويشت، الأزرق). لتقييم انتشار mTECs، ونابض وOTCs مع ايدو (6.7 ميكرومتر / مل، أي 10 ميكرومتر / جيد) لمدة 4 ساعة قبل انتهاء فترة الثقافات. وبعد ذلك ملطخة OTC البرد أقسام مع المضادة للقرنين 14 (الأخضر)، وايدو انقر للتكنولوجيا خليط التفاعل (أرجواني) جنبا إلى جنب مع تلطيخ النووي (هويشت والأزرق). صور الممثل يصور تنتشر ايدو + CD80 لو mTECs (C) وايدو + CD80 mTECs مرحبا (D) يتم عرض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. مقارنة بين نظامين الثقافة الغدة الصعترية 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جنبا إلى جنب مع RTOCs، وقد كان OTCs 3D من قبل أعلى بكثير من حيث التمايز TEC وفريق الخبراء الدائم صيانة / الاستقراء (الجدول 1) بالمقارنة مع غيرها (ط) "ثقافات 3D مبسطة" استخدام - الخلايا الليفية وحدها دون السقالة. (ب) نظم 2D باستخدام - الخلايا الليفية / التغذية شارك في تربيتها مع TECS 10، (ج) خلايا 3T3-J2 حيث تتطور استنساخ TEC، ولكن خسر فريق الخبراء الدائم، (د) matrigel أو (ضد) مكونات ECM (بيانات غير منشورة). واستمر فريق الخبراء الدائم لمدة تصل إلى 7 أيام في OTCs 3D، 4 أيام كونها المثلى الوقت نقطة بعد ذلك، يبدأ فريق الخبراء الدائم في الانخفاض. واستمرت ملامح TEC شكلية أخرى لمدة تصل إلى 14 يوما. يثير الاهتمام والفضول، وOTCs بدعم مرحلة نهاية MTEC التمايز يراها هاسال مثل البنى المتشكلة في بعض الأحيان 10.
وقد استمدت هذه التوتة تستخدم لOTCs من الشباب الفئران بعد الولادة لما لها من الميل العالي البقاء على قيد الحياة في الثقافة مقارنة التوتة الكبار. TECS المستمدة جيئة وذهابام الجنينية التوتة لم يتم اختبارها في OTCs. أكثر من ذلك، وبعد فترة طويلة الهضم (لا تستخدم التربسين بسبب انشقاق بعض الحواتم) ظهرت الخلايا أكثر قدرة على البقاء تستخدم أجهزة ماكينتوش بدلا من FACS الخلايا الفرز. باستخدام خطوتين بروتوكول تخصيب إيجابي على أعمدة MACS (الخرز مكافحة PE) من CD80 + mTECs تحسين بالإضافة إلى TEC النقاء.
لإعداد OTC لا بد من التأكد من أن فسكوزي، وقطع مادة ليفية محبوكة إلى حادة، والدوائر ترسيمها بشكل جيد من دون أجزاء مفككة أو مسنن الغايات كما سبق أن تناسب بالضبط في 12 إدراج الثقافة بشكل جيد. بدلا من ذلك، السقالات مثل BEMCOT- فسكوزي ممسحة M-3 (http://www.bemliese.com) يمكن أن تستخدم أيضا. حجم جيد للOTC هو أيضا حرجة وينبغي اختبار، إذا صيغ وحة أخرى من 6 جيدا و12-جيدا صيغ ينبغي استخدامها.
وينبغي إعداد جل الليفين هذا أن المكونات الفيبرينوجين والثرومبين لا تأتي إلى CONTACر مع بعضها البعض قبل أن يتم تعيين على OTC، تأكد من تبادل غيض ماصة. مزيج من العنصرين بدقة في طبق فوق سقالة لتشكيل السطح العلوي على نحو سلس. إعداد دائما هلام اختبار جنبا إلى جنب مع في بئر دون سقالة للتحقق من تكوين جلطة السليم والحصول على تقدير جيد من الوقت اللازم لتخثر. تأكد من أن الجل الليفين في OTC وقد يتخثر تماما قبل توريد الثقافات مع وسائل الإعلام.
عند انتهاء ثقافات mTECs المصنف يمكن استرجاعها بسهولة عن طريق الهضم الأنزيمي (كولاجيناز / dispase) من هلام الليفين، والتي يمكن استخدامها لتوصيف mTECs مثقف على سبيل المثال، من خلال التدفق الخلوي أو PCR.
وOTCs 3D الموصوفة هنا لديه القدرة على دراسة أو التلاعب العديد من المعلمات TEC وهي: 1) لدراسة و / أو التلاعب (عن طريق سيرنا، oligos morpholino) مسارات وظائف التنموية للmTECs. 2) لدراسة دور mTECs في الخلايا التائية تطويرمنة. 3) لcTECs الثقافة؛ 4) لاختبار إمكانات السلف من التوتة الخلايا الجذعية المشتقة. 5) لTECS البشرية الثقافة والخلايا الجذعية. 6) لإجراء فحوصات واحدة TEC نسيلي. وOTCs 3D تمثل تقنية ثقافة متقنة محاكاة جزء من الجسم الحي في الغدة الصعترية المكروية. وينبغي التأكيد على أن أي فحوصات إضافية تطبق على TECS في الإعداد OTC الحالي سوف تحتاج إلى فحصها بدقة والأمثل على حدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب المالي أو التجاري للاهتمام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
References
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
- Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
- Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
- Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
- Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
- Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
- Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).
