חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיתוח תא T תוך-הרתי דורש meshwork תלת-ממדי מורכב מורכב מתאי סטרומה שונים, כלומר, תאים שאינם-T. Thymocytes לעבור פיגום זה בצו של זמן ומרחב מתואם מאוד בעת שעברה ברצף נקודות בדיקת חובה, כלומר, מחויבות שושלת תא T, ואחריו דור רפרטואר קולט תא T ובחירה לפני יצואם לפריפריה. שני סוגי תאי התושב גדולים ויוצרים פיגום זה הם תאים בקליפת המוח (cTECs) והלשדיים הרתי אפיתל (mTECs). תכונה מרכזית של mTECs היא הביטוי המופקר כביכול של אנטיגנים-מוגבל רקמות רבות. אנטיגנים-מוגבל רקמות אלו מוצגים לה בוסר thymocytes במישרין או בעקיפין על ידי mTECs או תאים דנדריטים הרתי, בהתאמה וכתוצאה מכך סובלנות עצמית.
דגמים מתאימים במבחנה חיקוי המסלולים ופונקציות ההתפתחותי של cTECs וmTECs הם Lac כרגעהמלך. זה חוסר מודלים ניסיוניים נאותים יש למשל הקשו הניתוח של ביטוי גנים מופקר, שעדיין הוא הבין היטב ברמה התאית ומולקולרית. מתאמנים את מודל 3D organotypic שיתוף תרבות לתרבות לשעבר vivo mTECs המבודד. מודל זה תוכנן במקור כדי לטפח קרטינוציטים בדרך כגון כדי ליצור מקבילה עור במבחנה. מודל 3D נשמר תכונות פונקציונליות מרכזיות של ביולוגיה Mtec: התפשטות (i) ובידול מסוף של CD80 lo, Aire-השלילי להיי CD80, mTECs Aire-החיובי, (ii) היענות לRANKL, וכן (iii) ביטוי מתמשך של FoxN1, Aire וגנים-מוגבל רקמה בmTECs היי CD80.
מבוא
thymocytes פיתוח מהווה כ 98% מהתימוס, ואילו 2% הנותרים מורכב ממגוון רחב של תאים שביחד מרכיב את סטרומה הרתי (כלומר, תאי אפיתל, תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאי B, fibroblasts, תאי האנדותל). התאים החיצוניים של קליפת המוח אפיתל (cTECs) להשיג הגירה של תאים פרו-T ממח העצם, האינדוקציה שושלת תא T בתאים טרום-T multipotent וסלקציה חיובית של עצמי MHC מוגבל thymocytes בשל. התאים הפנימיים הלשדיים הרתי אפיתל (mTECs) מעורבים באינדוקצית סובלנות של thymocytes אלה עם זיקה גבוהה TCR למתחמי פפטיד העצמי / MHC או על ידי בחירה שלילית התרמה או הסטייה שלהם לשושלת תא T רגולטורים. בהקשר של אינדוקציה סובלנות מרכזית, mTECs הם ייחודיים בכך שהם מבטאי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של קרלסרוהה Regierungspräsidium. כל בעלי החיים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים במרכז הגרמני לחקר הסרטן (DKFZ). לכל גורי עכבר ניסויי התרבות החל 1-7 ימים של גיל היו בשימוש.
1. בידוד של mTECs מקורנית
הערה: שלבי העיכול הבאים בוצעו כפי שתואר לעיל 1 בתנאים סטריליים עם כמה שינויים כדלקמן.
- לערוף את גורי העכבר ולהסיר את בלוטת התימוס. מניחים את thymi על קרח בצלחת פטרי המ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנחנו אימצנו מודל 3D organotypic התרבות המשותפת (3D OTC) שפותח במקור לתרבות לטווח ארוכה במבחנה של קרטינוציטים 9. mTECs המועשר MACS (ראה איור תכנית העשרת MACS 1) היו זורעים על פיגום הכולל ג'ל הפיברין ופיברובלסטים בפח. Fibroblasts לספק המטריצה חיונית תאית (ECM) התומכת mTECs במבחנה. MTECs עובדו בOTCs ל4-14 ימים בנוכחות RANKL בתרבויות שקועות בניגוד קרטינוציטים, שהם מחקים את הסביבה שלהם in vivo (ראה א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לצד RTOCs, OTCs 3D היה עדיף בהרבה על ידי במונחים של בידול TEC ותחזוקה / אינדוקציה PGE (טבלה 1) בהשוואה לאחרים (i) "תרבויות 3D פשוטות" באמצעות - fibroblasts לבד בלי הפיגום; (Ii) מערכות 2D באמצעות - תאי פיברובלסטים / מזין שיתוף תרבותי עם Tecs 10, (iii) תאי 3T3-J2 בי השיבוטים TEC לפתח, אבל PGE הולכים לאיבוד, (iv) matrigel או (v) רכיבי ECM (נתונים שלא פורסמו). PGE נשמר לעד 7 ימים בOTCs 3D, להיות נקודת הזמן האופטימלית לאחר מכן 4 ימים, PGE מתחיל לרד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שום ניגוד כספי או מסחרי של עניין.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הגרמני לחקר הסרטן (DKFZ), קונסורציום האיחוד האירופי "סובלנות", ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) וה-Landesstiftung Baden-Württemberg.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכברים בהריון C57BL/6 | נהר צ'ארלס WIGA | ||
| LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| עמודות MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 מיקרו-חרוזים, עכבר | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| מיקרו-חרוזים נגד PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| סטרפטווידין מיקרו-חרוזים | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 ו-biotin) | Ref. 12 | ||
| נוגדן CD80-PE | BD Pharmingen | 553769 | |
| נוגדן CD45-PerCP | BD Pharmingen | 557235 | |
| נוגדן Ly51-FITC | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| נוגדן קרטין 14 | Covance | PRB-155P | |
| נוגדן וימנטין | Progen | GP58 | |
| Cy3 מצומד AffiniPure Goat אנטי-ארנב IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-מצומד AffiniPure F(ab')2 שבר עז אנטי-חזיר ניסיונות IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| נוגדן משני נגד ארנב עיזים IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | בדיקות מולקולריות מצומדות (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 ערכת הדמיה | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 ערכת בדיקת ציטומטריית זרימה | Invitrogen | C10425 | |
| מוסיף מסנן 12 בארות (thincerts) | Greiner bio-one | ||
| צלחת 12 בארות | גריינר | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, ג'ורלה מינור, איטליה | ||
| פיברינוגן TISSUECOL-Kit אימונוס | בקסטר | ||
| תרומבין TISSUECOL-Kit אימונוס | בקסטר | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | לונזה | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| אפרוטינין (טרסילול) | Bayer | 4032037 | |
| רעלן כולרה | ביומול | G117 | |
| הידרוקורטיזון | סרומד (ביוכרום) | K3520 | |
| חומצה L-אסקורבית | סיגמא | A4034 | |
| TGF-ß 1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R& D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT תרכובת | TissueTek | 4583 | |
| טריזול (המכונה גם תמיסת דנטורינג - מיצוי חומצה גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | תרמו מדעי | ||
| קולגנאז סוג IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 מ"ג/מ"ל ו-57U/ml סופי |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 מ"ג/מ"ל ו-1.2U/ml סופי |
| DNase I | רוש | 11 284 932 001 | 25 ומיקרו; g/ml conc סופי. |
מקורות
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
