3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Sheena Pinto; Hans-Jürgen Stark; Iris Martin; Petra Boukamp; Bruno Kyewski

doi:10.3791/52614

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

10.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/52614

⸱

30 luglio 2015

Sheena Pinto^*¹ , Hans-Jürgen Stark^*² , Iris Martin² , Petra Boukamp² , Bruno Kyewski¹

¹Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), ²Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Lo studio delle cellule epiteliali midollari del timo in vitro è stato in gran parte infruttuoso, poiché gli attuali sistemi di coltura 2D non imitano lo scenario in vivo. Il sistema di coltura 3D qui descritto - un modello di coltura organotipica della pelle modificata - si è dimostrato superiore nella ricapitolazione della proliferazione, della differenziazione e del mantenimento dell'espressione genica promiscua di mTEC.

Abstract

Lo sviluppo delle cellule T Intra-timico richiede un reticolo tridimensionale complessa composta da varie cellule stromali, cioè cellule non-T. Timociti attraversano questo patibolo in un ordine temporale e spaziale altamente coordinato, mentre in sequenza passa punti di controllo obbligatori, cioè, l'impegno linea cellulare T, seguita da generazione repertorio recettore delle cellule T e la selezione prima della loro esportazione nella periferia. I due principali tipi di cellule che formano residente questa impalcatura sono cellule epiteliali del timo corticali (CTEC) e midollari (mTECs). Una caratteristica fondamentale di mTECs è la cosiddetta espressione promiscua di numerosi antigeni tissutali limitato. Questi antigeni tissutali con restrizioni vengono presentati immaturi timociti direttamente o indirettamente da mTECs o cellule dendritiche del timo, causando rispettivamente in self-tolleranza.

Adatto in vitro modelli che emulano i percorsi di sviluppo e le funzioni di CTEC e mTECs sono attualmente lacre. Questa mancanza di adeguati modelli sperimentali è per esempio ostacolato l'analisi dell'espressione genica promiscua, che è ancora poco conosciuta a livello cellulare e molecolare. Abbiamo adattato una organotipica modello di co-coltura 3D per la cultura ex vivo mTECs isolati. Questo modello è stato originariamente concepita per coltivare cheratinociti in modo tale da generare un equivalente pelle in vitro. Il modello 3D conservato caratteristiche funzionali chiave di MTEC biologia: (i) la proliferazione e la differenziazione terminale di CD80 ^ecco, Aire-negativo in CD80 ^hi, Aire-positivi mTECs, (ii) la risposta a RANKL, e (iii) espressione sostenuta di FoxN1, Aire e geni tessuto-limitato a CD80 mTECs ^hi.

Introduzione

Timociti sviluppo costituiscono circa il 98% del timo, mentre il restante 2% è costituito da una varietà di cellule che compongono collettivamente stroma timico (cioè, cellule epiteliali, cellule dendritiche, macrofagi, cellule B, fibroblasti, cellule endoteliali). Le cellule epiteliali esterni corticali (CTEC) procurano immigrazione di cellule pro-T dal midollo osseo, induzione linea cellulare T in multipotenti cellule pre-T e selezione positiva di auto-MHC limitati timociti immaturi. Le cellule interne midollari timiche epiteliali (mTECs) sono coinvolti nella induzione della tolleranza di questi timociti con un alta affinità TCR per complessi auto-peptide ....