Summary
Denne protokol udgør en metode til at skabe en stor ensidig kraniotomi over tidsmæssige og parietale områder af mus hjernebarken. Dette er specielt nyttigt for sandtidafbildning over et ekspansiv område af en hjernehalvdel.
Abstract
Kraniotomi er en almindeligvis udføres procedure for at blotlægge hjernen til in vivo eksperimenter. I muse forskning, de fleste laboratorier anvender en lille kraniotomi, typisk 3 mm x 3 mm. Denne protokol indfører en metode til at skabe en væsentlig større 7 mm x 6 mm kraniel vindue udsætter det meste af en cerebral hemisfære over muse tidsmæssige og parietale cortex (f.eks bregma 2,5-4,5 mm, lateral 0 - 6 mm). For at udføre denne operation, skal hovedet vippes ca. 30 ° og meget af Tindingmusklen skal trækkes tilbage. På grund af den store mængde af knoglefjernelse er denne procedure kun beregnet til akutte forsøg med dyret bedøvet under hele operationen og eksperiment.
Den største fordel ved denne innovative store laterale kraniel vindue er at give samtidig adgang til både mediale og laterale områder af cortex. Denne store ensidige kraniel vindue kan anvendes til at studere de neurale dynamik mellem celler,samt mellem forskellige kortikale områder ved at kombinere flere elektrodeholdere elektrofysiologiske optagelser, billeddannelse af neuronal aktivitet (fx indre eller ydre billeddannelse), og optogenetic stimulation. Desuden er denne store kraniotomi også udsætter et stort område af kortikale blodkar, der giver mulighed for direkte manipulation af den laterale kortikale vaskulatur.
Introduction
Kraniotomi er en standardprocedure, som neurovidenskaberne bruger til at afsløre en del af hjernen. Siden starten af elektrofysiologi har kraniotomi muliggjort usædvanlige gennembrud inden for neurovidenskab. Tæt kortlægning af cerebral cortex med elektroder har ført til forsøg, der tester hypoteser og teorier baseret på disse kort. Vi er for nylig kommet ind i en ny æra, hvor kraniotomi anvendes til in vivo billeddannelse af cortical blodgennemstrømning 1 , 2 , 3 og neurovaskulær arkitektur 4 , der muliggør real-time visualisering af kortikal aktivitet inden for de udsatte områder 5 , 6 , 7 . Selvom mange studier bruger craniotomier kombineret med in vivo optiske billedteknikker til at studere strukturen og funktionen af kortikale neuroner, glia og cortiske vaskulatur 8, 9 er yderligere undersøgelser begrænset af små områder af blotlagt cortex (men se 10).
Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en fremgangsmåde til at skabe en stor lateral kraniotomi, udsætter hjernebarken fra midterlinjen til squamosal knogle, og strækker sig ud over bregma og lambda. Denne store kraniotomi muliggør samtidig modtagelse af foreningen cortex (retrospenialis, cingulate, og parietale), primær og sekundær motor, somatosensoriske, visuelle og auditive cortex. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet kombineret med spænding følsomt farvestof imaging (VSDI) for at undersøge, hvordan flere kortikale områder interagerer med hinanden under spontan og stimulus-induceret cortical aktivitet 5, 11, 12. De mest udfordrende aspekter af denne procedure omfatter placering af hovedetaf dyret, fastsættelse hovedpladen, og undgå blødning mens adskillelse Tindingmusklen fra parietalknoglen. Det må desuden tages i de bore- og kraniet fjernelsesprocesser som skallen kurver i en skrå vinkel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol følger Universitet Lethbridge Animal Care udvalg (ACC) retningslinjer, og gennemføres i overensstemmelse med standarderne i den canadiske Rådet om Animal Care (CCAC).
1. Fremstilling
- For længerevarende studieophold, autoklaveres alle åbne kirurgiske forsyninger og sikre fastholdes, at steriliteten hele operationen. Hvis flere operationer er nødvendige, autoklave mellem operationer.
- Sikre, at der er masser af hjerne-buffer på hånden (mindst 50 ml). Opløsningen består af 134 mM natriumchlorid, 5,4 mM kalium, 1 mM magnesiumchlorid-hexahydrat, 1,8 mM calciumchlorid-dihydrat og 5 mM HEPES natrium, pH afbalanceret til 7,4 med 5 M hydrogenchlorid.
- Placer musen i en induktion kammeret og bedøver med 3 - 4% isofluran. Følge med 1,0 - 2,0% isofluran for vedligeholdelse under operationen. Yderligere reducere til så lavt som 0,4 - 0,8% under afbildnings = "xref"> 5, 13, 14, 15, forudsat korrekt anæstesi opretholdes. Disse lave niveauer af anæstesi kræver vagt og hyppig overvågning af musen (ca. hver 5 min) for at sikre den forbliver areflexic på smertefulde stimuli.
BEMÆRK: Dehydrering kan blive problematisk på grund af den høje forhold mellem overflade og volumen af mus og forværres af langvarig brug af isofluran.- Bruge subkutane injektioner af saltopløsning, 0,1 ml pr 10 g legemsvægt, hver 1 - 2 ud h. Når tilstrækkeligt hydreret, vil musen urinere gang hver 1 - 2 ud h.
- Nøje overvåge musen for at sikre en ensartet anæstesi hele kirurgi og billeddannelse. Lad ikke musen uden opsyn, og passe på, at det aldrig kommer til bevidsthed.
- Overfør den bedøvede mus i hovedet-holder set-up og sted på en termo-regulerende varmepude indstillet til 37 ° C. Fastgør de øverste teeth i en tænder holder.
- Rotere musens hovedet mod venstre ca. 30 ° for at blotlægge den højre laterale side af hovedet og fastgør musens hoved med den stumpe ende af øre stænger (figur 1A).
- Anvende ophthalmisk salve for at forhindre corneal tørring.
- At reducere cerebralt ødem, injicere dexamethason (4 mg / kg) intramuskulært.
- Tør huden over det kirurgiske område med vatpinde dyppet i 4% klorhexidin (3 gange) og 70% ethanol (3 gange). Brug hver vatpind kun én gang.
- Don kirurgiske handsker og dække dyret med selvklæbende plastfolie. Tilvejebringe lokalbedøvelse ved injektion af lidocain (8 - 10 mg / kg; 2% epinephrin) subkutant over kraniotomi site. Vent 3 - 5 min for lægemidlet at blive absorberet i vævet.
2. Fjernelse af hud og Tilbagetrækning muskel fra Skull
- Udfør næsten alle disse procedurer, mens du ser kraniet under endissektionsmikroskop (fx 0,7 - 4,5 x strøm, afhængigt af situationen).
- Løft huden 1 mm til venstre for midterlinien (lige bag øret) med pincet og lave et lille vandret snit med kirurgiske sakse.
- Lave en 5 - 6 mm lateralt snit mod højre øre, og derefter skæres mod den rostrale ende af hovedet.
- Ved den indledende indsnit punkt, indsætte saks og klippe 10 mm rostralt.
- Skær huden omkring det højre øre og nær det højre øje til at eksponere den højre side af kraniet og tidsmæssige muskler. Sikre, at den bredeste del af det eksponerede areal er mindst 7 mm. Trim huden yderligere, hvis det kirurgiske område skal udvides.
- Fastsætte huden omkring snittet ved at sætte et par dråber butyl cyanoacrylatlim mellem kraniet og huden. Sikre vævet er blevet tørret med bomuld tippes applikatorer eller valsede væv til at forøge effektiviteten af klæbemidlet.
- Med en vatpind, gnide overfladenaf kraniet i en cirkulær bevægelse for at fjerne periosteum fra kraniet. Sørg for, at ingen forbliver ved tørring kraniet helt.
- Anvendelse spring saks og pincet, adskille Tindingmusklen fra kraniet; klippe og trække musklen sideværts indtil den når squamosal knogle (figur 1C). Vær meget forsigtig med ikke at beskadige den overfladiske tidsmæssige vene, der løber langs niveauet for den squamosal knogle nær øjet, ellers hemorrhaging kan forekomme.
- Kontrol blødning med gel skum forvædet i hjerne puffer. For alvorlig blødning bruge en varme cauterizer. Slip butyl cyanoacrylatlim onto blødende områder efter behandling med varmen cauterizer. Sikre området på forhånd er tørret ved hjælp af bomuld tippes applikatorer eller valsede væv til at forøge effektiviteten af klæbemidlet.
3. kraniotomi
BEMÆRK: Kirurgen skal forblive flittige under fjernelse af kraniet ogdura for at undgå unødvendige komplikationer. Fejlfinding trin er inkluderet burde der opstår komplikationer.
- Marker stedet for bregma enten med en fin spids markør eller skære en lille trekantet stykke tape og pege et hjørne ved bregma (figur 2A) for at orientere de underliggende områder af hjernen.
- Førend fastgørelse af hovedpladen sikre kraniet er helt tør. Kraniet vil hurtigt lufttørre efter påføring af gelen skum dyppet i hjernen buffer, hvis der kræves mere tørring, anvende bomuld tip svaberprøver. Dette trin er afgørende for hovedpladen fiksering (figur 1B).
BEMÆRK: Hvis der er periosteum venstre på skallen, eller hvis kraniet er ikke tør, før limning på hovedet plade, vil det sandsynligvis frigøre. Hvis dette sker, skal du forsigtigt fjerne hovedet pladen og starte forfra. Blødning kan forekomme under denne proces; tillade et par minutter for det til at størkne, og derefter forsigtigt fjerne. Denne proces kan ikke anbefales at blive gentaget mere end to gange. <li> Anvend ethyl cyanoacrylatlim omkring den nederste kant af toppladen 16, og lim hovedpladen over kraniotomi område (figur 1D & figur 2A). - Fylde åbningen rummet mellem kraniet og toppladen med dental cement så kun kraniotomi område blotlagt. Vente på dental cement til at tørre og hærde, typisk fra 5 - 10 min (figur 2B).
- Når cementen er indstillet, kortvarigt fylde brønden med hjernen buffer og lad dem trække i 3 - 5 min. Anvende en rullet væv at fjerne hjernen buffer inden boring (figur 2C).
- Skitsere kirurgiske område ved let scorer overfladen af kraniet med et tandlægebor. Bruge en pneumatisk bor (indstillet til maksimalt 20 PSI), med en FG ¼ burr, og styres med en variabel hastighed fodpedal.
- Forsigtigt spore boret langs oprindelige scoring at uddybe det, ensuring boret trænger ikke gennem kraniet ind i hjernen (figur 2D). Skiftes med få minutters mellemrum mellem boring og duppe kraniet overflade med fugtet rullet væv. Dette vil reducere opvarmning og tørring af kraniet fra mekanisk friktion og langvarig eksponering.
BEMÆRK: Skallen vil hurtigt lufttørre efter anvendelse af den våde gel skum. Hvis der er behov mere tørring, bruge bomuld tip svaberprøver.
Forsigtig: Skallen er ujævn tykkelse. For eksempel, den parietale-temporale højderyg er den tykkeste område, mens kraniet regioner nær midterlinien og squamosal landmærker er relativt tynde. - Under boringen jævnligt tjekke for krumning af kraniet ved forsigtigt at trykke på det med pincet eller den ikke-bevægelige bor. Når knoglen begynder at spænde, stop boring og nedsænke hele vinduet i hjernen buffer.
BEMÆRK: Hvis blod siv ud af et område, kan det foreslå, at dura er blevet beskadiget. Hvis dette er tilfældet, skal du placere et semi-våd gel skum over området og forsøge at opsuge blodet under forsigtig påføring af tryk på gelen skum med en vatpind vatpind. - Vente mindst 5 minutter før kraniet fjernelse at blødgøre knoglen og for at reducere risikoen for dura stikning til knoglen, hvilket gør kraniet fjernelse processen lettere.
- Udføre kraniet fjernelsesprocessen mens kraniet er nedsænket i hjernen buffer.
BEMÆRK: Hvis en del af kraniet forbliver hårdnakket bundet, kan en # 11 skalpelblad anvendes til forsigtigt score kraniet. Tag ekstrem omhu for ikke punkteres bladet gennem kraniet og ind i hjernen. - Begyndende fra den forreste kant, forsigtigt lirke den løs kraniet fra dura med en pincet.
BEMÆRK: Hvis der opstår en lille mængde blødning under kraniet fjernelsesprocessen, fjerne bufferen med en overførsel pipette eller sprøjte, og derefter erstatte med nye puffer. - Når knoglen er løs og "flydende" på dura, fast greb knoglen med pincet og løfte knoglen fradura. Sørg knoglen aldrig trænger ind i hjernen.
- At kontrollere blødning, rulle hjørnet af et væv i et punkt, og fjerne det meste af buffer fra den kraniale brønd. Hurtigt anvende gel skum, præ-gennemvædet i puffer, til blødende område under tilsætning meget let tryk med en vatpind vatpind.
BEMÆRK: blødning normalt kommer fra kanten af knoglen eller overfladen af dura; begge tilfælde er normale og blødning vil hurtigt stoppe, hvis nogen større blodkar er beskadiget. Hvis blødningen fortsætter, kan blod fylde hele vinduet, der danner et koagel ark over det billeddannende område.- At fjerne blodproppen ark, omhyggeligt afhente stykker af størknet blod fra det billeddannende område samtidig med at blodprop intakt omkring kilden den opbrudte blodkar. Vær omhyggelig med at ikke fjerne blodprop fra bløder kilde, da det kan føre til endnu mere blodtab. Overrisle overfladen af hjernen med hjernen buffer til at vaske væk enhver blod.
- Vær omhyggelig med at undgå at berøresarte hjernevæv eller tilsætning fremmed materiale til hjernen; gentag indtil blødningen er stoppet, for ca. 2 - 5 min (figur 2E).
BEMÆRK: På dette tidspunkt, kraniotomi er klar til at forberede kranie vindue (se trin 5). Hvis det er nødvendigt, fjerne dura før implantering af kraniel vindue (se trin 4).
4. Dura Removal
BEMÆRK: Dura fjernelse kræver ekstrem omhu og kan tage over 15 minutter.
- Trække væk overskydende buffer fra kraniotomi. Samtidig opretholde en fugtig overflade, grab et lille stykke dura med pincet og forsigtigt rive dura.
- Brug pincet og foråret saks til forsigtigt rive og skære væk dura.
- Falde mere hjerne buffer på hjernen overflade til at flyde dura og hjælpe den adskilt fra hjernen. Fortsæt, indtil al dura er fjernet fra kraniel vindue webstedet. Når udføres korrekt hjernen vil synes at være meget ren med tydelig blOodskibe og ingen pletter (sammenlign figur 2E med 2F ).
Forsigtig: Nogle områder af duraen er fastgjort til små arterioler på hjernens overflade ( fx nær midterlinjen proximalt til parietal associeringsområdet), og fjernelse af sådan kan bryde arterioleen. I sådanne tilfælde kan det være bedre at forlade et lille stykke dura intakt over toppen af arteriolen. VSD må ikke trænge ind i det lille område, men det foretrækkes at have større blødning. - Fastgør hjernefladen i agarose så hurtigt som muligt for at minimere bevægelse fra pulsering og forhindre yderligere hævelse (se trin 5).
5. Forberedelse af kraniale vindue
- Sprøjt glaspladen med 70% ethanol og brug en luftbeholder til forsigtigt at tørre. Sørg for, at glasset er helt rent uden pletter eller støv til stede.
- Tilbered 1,3% agarose ved opvarmning af 200 mg agarosepulver opløst i 15 ml hjernepuffer. Indstil microwave til høj og varme i 10 - 15 s ad gangen, forsigtig omrøring i mellem, indtil alt agar opløses.
Bemærk: Sørg ingen bobler eller partikler er til stede, da disse vil forstyrre billeddannelse. - Placere et termometer i den varme agarose og afkøl agarose ned til lige over størknende temperatur (~ 40 ° C).
BEMÆRK: Løb køligt vand over ydersiden af agarose beholderen kan fremskynde køleprocessen. Omrør forsigtigt kontinuerligt for at sikre, at ingen bobler eller partikler er til stede. - Umiddelbart før påføring af agar, fjerne hjernen buffer fra den kraniale brønd. Udarbejde agarosen med en overførsel pipette og slip agarose direkte på hjernen. Hurtigt placere dækglasset over overfladen og fastgør dækglasset med agarose dråber på hjørnerne.
6. Eutanasi
BEMÆRK: Det er vores erfaring, tager denne procedure erfarne kirurger mindst 3 - 4 praksis operationer for at opnå mere end 90%succesrate. Mindre erfarne kirurger kan kræve endnu mere praksis. Under kraniotomi eller durotomy, kan hjernen lide skade, såsom hvis boret slag gennem knoglen ind i hjernen. Nogle mindre skade på kanten af kraniotomi kan være tilladt. Men hvis hjernen ikke ser "ren" med lyse røde ubeskadigede blodkar og hvide cortex, kan forsøget behov, som skal afsluttes. Eksempler på dårlige præparater omfatter dem med døde blodkar, eller når cortex er markeret med iturevne eller beskadigede blodkar. Hvis nogen af disse symptomer er til stede, vil eksperimentet næppe give data af høj kvalitet. Hvorvidt kirurgi / eksperiment var en succes eller ej, humant aflive musen ved afslutningen af forsøget.
- Dybt bedøver med mindst 3,5% isofluran. Derefter giver en intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital ved 300 mg / kg. Ideelt set, hvis nålen indsættes i leveren, vil døden ske meget hurtigt (<1 min).
- Hvis perfusionen er påkrævet, skal du kontrollere, at dyret er dybt bedøvet før du fortsætter (se trin 1.3).
- Alternativt, hvis perfusion ikke er påkrævet, vente i mindst 5 minutter og derefter kontrollere, at musen er død. Bekræfte fravær af respiration, hjerteslag, såvel som en mangel på smerte tilbagetrækning og corneale reflekser. Også observere for bleg blå / hvid farvning af ekstremiteter og mørkfarvning af blodkarrene over cortex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At undersøge samspillet mellem kortikale områder i et enkelt halvkugle, brugte vi en stor kraniotomi strækker sig tværs over sinus sagittalis og 5 - 6 mm lateralt. Denne kraniel vindue inkluderet primære (motor, somatosensoriske, visuel, auditiv), sekundære (motor, visuelt), og forening (retrospenialis, cingulate, parietal forening) cortex af højre hjernehalvdel (figur 3A). For dette arbejde brugte vi spænding følsom farvestof (VSD) billeddannelse, som afspejler ændringer i membranpotentialet 3. Denne protokol ville også være nyttig til andre ydre (for eksempel calcium 17 og glutamat 18 billeddannelse) eller iboende billeddannelse eksperimenter. Ved stimulering bagbenet, forben, whiskers, visuelle eller auditive system af let bedøvede mus ved anvendelse af 0,5% isofluran, vi observerede konsensus mønstre af cortical depolarisering (> Figur 3B). I overensstemmelse med tidligere undersøgelser 5, 19, 20, 21, 22, fandt vi, at korte taktil stimulering af C2 tønde cortex førte til aktivering af primære somatosensoriske områder, såvel som "øer" af reaktioner i funktionelt beslægtede områder. For eksempel vil den primære motor cortex (M1) eller sekundær repræsentation af somatosensoriske cortex (S2, figur 3BI). En enkelt 1 ms tone pip (25 kHz) stimulering førte til aktivering af primære auditive cortex (A1) ca. 20 ms efter auditiv stimulering (figur 3Bii). I løbet af de næste par millisekunder, det depolarisering spredt over den auditive cortex og videre til nabolandet sekundær somatosensoriske cortex. Ca. 25 ms efter tonen indtræden, ville en sekundær kortikal depolarisering dukke op, ligger 1,07; 0,2 mm mediale og 1,9 ± 0,1 mm posteriort i forhold til bregma (n = 9 mus). Dette er omtrent placeringen af parietale foreningen område (PTA). VSD signal derefter opformeret med midterlinjen område, hvor andre kortikal forening områder er placeret herunder retrospenialis (RS) og cingulate cortex (CG). Derfor, auditiv stimulering førte til aktivering af to separate fokale områder, hvorfra der rejser bølger af VSD depolarisering spredes til et større område inden midterlinjen cortex. Fokal stimulering af det kontralaterale øje med en 1 ms grøn LED puls, førte til aktivering af den primære visuelle cortex inden for 40 ms (figur 3 BV). Denne primære aktivering af den visuelle cortex blev efterfulgt af: (1) Rumlig udvidelse af VSD depolarisering i naboområder placeret medialt, sideværts, og forreste til den oprindelige aktiverede område; (2) Depolarisering af en anden mediale kortikale region cirka 50 ms efter stimulering (n = 8 forsøg) placeret langs sa gittal sutur. Dette svarede til sensoriske stimulationer af forben (Figur 3Biii), bagben (Figur 3Biv), C2 whisker eller høreevne. Fremkaldte VSDI svar fra sensorisk stimulation af forlem, bagben eller audition begynde med aktiveret de respektive primære sensoriske cortex, efterfulgt af en anisotrop spredning af aktivitet, samt midterlinjen aktivering af cortex omkring 20 - 40 ms efter stimulering. Dette resultat svarede til svar fra visuel og whisker stimulation. Udbredelsen af sensorisk-fremkaldte aktivitet langs disse midterlinjen ruter og hyppig aktivering af samme regioner ved spontan aktivitet 6 kan antyde, at disse regioner er det centrale knudepunkt for forbindelsen kerne af muse cortex, hvori sensorisk information kan integreres med spontan cortical aktivitet.
2fig1.jpg"/>
Figur 1. Kirurgisk opsætning og klargøring. (A) Mouse hoved barberes, renset, drejet ca. 30 ° i lateral eksponering, og sikret med den stumpe ende af øre barer. Isofluran bedøvelsesmiddel leveres via et næsestykke og tænder holder. Musen er dækket med selvklæbende plastfolie for øget sterilitet og varme. (B) Close-up viser hud og periost fjernes fra parietale kraniet plade, Tindingmusklen er uberørt. (C) Tindingmusklen fjernes udsætte den tidsmæssige plade og squamosal knogle, bemærk den overfladiske vene er ubeskadiget. (D) Før fiksering, er hovedpladen anbringes i den korrekte placering med voks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Trin-for-trin Kirurgisk procedure. (A) Hovedet-plade er fastgjort til kraniet med ethyl cyanoacrylatlim på de forreste og bageste steder. Bemærk placeringen af bregma (sort stykke trekantet bånd). (B) Den kraniale vindue fremstilles ved at påføre fortykkede dental cement mellem hovedet-plade og kranium. Bemærk at bregma og squamosal vartegn forbliver synlige. (C) Efter tørring af cement, sættes hjerne buffer at blødgøre kraniet og forhindre vedhæftning af dura. En rullet væv vil hjælpe fjernelse hjerne buffer før boring. (D) Kanterne af kraniotomi er blevet scoret. Bemærk vaskulaturen er mere let ses gennem den indsnævrede ben nær dental cement kanter. (E) De parietale og tidsmæssig kranieplader har været afted og dura er synlig. Bemærk pletter af blod på dura fra mindre blødning, hvilket er normalt. Omhyggelig undersøgelse under 2 - 4X forstørrelse vil afsløre to lag blodkar, en i dura og den anden i pia. (F) Dura fjernes afslører en uberørt cortex. Pial kar er lyse rødt uden pletter tilstedeværende. Bemærk de omstrejfende stykker af hvid farvet dura på kanterne af kraniel vindue. I dette eksempel var der en mindre dural blødning ved den bageste del af den kraniale vindue, som hurtigt størknet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Unikke og Konsensus aktiveringsmønstre under flere former for sansestimulering. < / strong> (A) Skematisk af den ensidige kraniotomi viser afbildede corticale områder. (B) Photomicrograph af den brede ensidig kraniotomi med bregma angivet med en hvid cirkel i hvert billede. Mønstre af kortikal aktivering er vist i en mus bedøvet med isofluran (0,5%) efter (i) stimulering (stim) af den kontralaterale C2 whisker, (ii) auditiv stimulering, (iii) kontralateral forben stimulering, (iv) kontralaterale bagben stimulering og (v) visuel stimulation af det kontralaterale øje med en lysemitterende diode (LED). Der var midterlinjen aktivering efter alle former for sensorisk stimulation (hvide pile) ved 10 - 25 ms efter primære sensoriske cortex aktivering. Svarene er gennemsnittet af 20 forsøg. Billedet sekund fra venstre i den anden række (ii) angiver den forreste (A), posterior (P), medial (M) og laterale (L) retninger. Modificeret med tilladelse fra Mohajerani, et al., 2013.P_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne innovative protokol for et stort kranie vindue muliggør samtidig billedbehandling over tidsmæssige og parietale områder af hjernebarken. Kombineret med optisk afbildning, kan det hjælpe at afsløre neurale dynamik inden kortikale områder under spontan og stimulus-induceret aktivitet. Denne ekspansive kraniotomi udsætter også en stor udvidelse af den korticale vaskulatur netværket, herunder den proximale ende af den midterste cerebrale arterie (MCA), muliggør in vivo-billeddannelse af blodstrømmen og direkte manipulation af laterale fartøjer til iskæmiske modeller. Denne teknik vil være til stor nytte for nyligt udviklede linjer af mus, der udtrykker spænding og calcium indikator proteinerne 23. Disse mus tilbyde den praktiske fordel, at omgå behovet for at inkubere spænding følsomme farvestoffer på cortex. Disse ydre farvestoffer tage tid til tilstrækkeligt penetrere hjernevæv (-60 - 90 min) og er begrænset af deres milde toksicitet. Store kraniotomier har ogsåtidligere anvendt til at studere udviklingen af rottehjerne med VSDI 11. Nyfødte rotter har en meget større hoved og er sammenlignelig i størrelse med voksne mus. Dette giver forskerne en unik mulighed for at studere udviklingsmæssige problemer i neurovidenskab, om end ikke med transgene mus.
De vigtigste begrænsninger ved denne fremgangsmåde er den manglende evne til kroniske forsøg. Krumningen af kraniet gør boreprocessen mere udfordrende og tidskrævende end mindre kraniotomier. Til denne store kraniotomi, er det afgørende at placere hovedet med de centrale sutur og squamosal vartegn til at være parallel med fokus planet af linsen. Mens nogle forvrængning af hjernen der forventes af krumningen af hjernen, er disse overvindes ved at fokusere ind i de overfladiske lag af cortex. Dette problem er yderligere lettet ved at opnå mange gentagelser af stimulation og udjævning. Sammenfattende vores store kraniotomi teknik er almindeligt applicable for studiet af aktuelle problemer i neurobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC) Discovery Grant # 40.352, Campus Alberta for innovation Stol, Alberta Alzheimer Research Program til at MHM, og NSERC CREATE i BIF ph.d. fællesskab og AIHS postgraduate fællesskab til MK. Vi takker Pu Min Wang for udviklingen af denne protokol og til kirurgisk træning, og Behroo Mirza Agha og Di Shao for dyrehold.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating Pad | FHC | 40-90-2 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2 or more pairs are recommended |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00, 15000-10 | 1 pair should be designated for dura removal |
| Jet tooth shade powder | LANG Dental | Jet Tooth Shade Powder | to be mixed with the Jet Liquid |
| Jet tooth shade liquid | LANG Dental | Jet Tooth Shade Liquid | to be mixed wihth the Jet Powder |
| Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 | Midwest Dental | 385201 | |
| Agarose Powder | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Gelfoam | Sinclair Dental Canada | Pfizer Gelfoam | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Centre Ltd | 124125 | |
| Lidocaine 2% Epinephrine | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125299 | |
| Dexamethazone 5 mg/mL | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125231 | |
| Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) | Western Drug Distribution Centre Ltd | 12612 |
References
- Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).
- Mohajerani, M. H., et al. Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections. Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).
- Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice. J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).
- Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio. J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat. J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).
- Sweetnam, D., et al. Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke. J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).
- Yin, Y. Q., et al. In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia. Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).
- Sharp, P. S., et al. Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime. Scientific Reports. 5, 12621 (2015).
- Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Vanni, M. P., Murphy, T. H. Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex. J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs. Nat Commun. 6, 7738 (2015).
- Lim, D. H., et al. In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas. Front Neural Circuits. 6, (2012).
- Ferezou, I., et al. Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice. Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).
- Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
