Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Abstract

Ähnlich wie bei gesunden Geweben, viele Blut und solide Tumore sind jetzt vermutlich hierarchisch organisiert werden, mit einer Teilmenge der stielartigen Krebszellen, die selbst zu erneuern, während, die zu differenzierteren Nachkommen. Das Verständnis und die Ausrichtung dieser Krebsstammzellen bei Brustkrebs, die verstärkt Chemo- und Strahlenresistenz im Vergleich zu den nicht-Stammtumormasse besitzen kann, ist zu einem wichtigen Forschungsgebiet. Die mammosphere Assay wurde auch bekannt durch ihre Fähigkeit, im Nachhinein zu ermitteln kugel- verwendet: Markierungen einschließlich CD44, CD24 und ALDH-Aktivität kann unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) prospektiv isolieren Zellen, die eine verbesserte Tumorigenität anzuzeigen, wenn in immunsupprimierten Mäusen implantiert beurteilen bildenden Zellen, die aus einzelnen Stammzellen wie Klone zu entwickeln. Hier beschreiben wir Ansätze für die entsprechende Kultivierung mammospheres von Zelllinien oder primären Patientenproben, ihren Passagieren und Berechnungen zur Sphäre f schätzenorming Effizienz (SFE). Zuerst diskutieren wir wichtige Überlegungen und Fallstricke in der entsprechenden Planung und Auslegung von mammosphere Experimente.

Introduction

Die Existenz von Tumorzelllinien durch stielartigen Krebsstammzellen geleitet hat wesentlich zum Verständnis der Tumorheterogenität aufgenommen. Während einige phänotypische Vielfalt in Tumoren nicht aus der klonalen Auswuchs von genetisch unterschiedlichen Klone entstehen, wird ein wesentlicher Bestandteil von epigenetischen Unterschiede ergeben: Krebszellen zwischen Stammzellen, Vorläufer und differenzierte Staaten über die Aktivierung oder Unterdrückung der spezifischen Gens (manchmal auch reversibel) übergehen kann Ausdruck Programme ^1-3. Dies kann Zelle intrinsische oder extrinsische Faktoren widerspiegeln, was die Genexpression Programm, das gerade in einer Zelle mit ihrer resultierenden autokrine Signalisierung in Verbindung mit parakrinen Signalisierung von benachbarten Krebs, Stromazellen oder Immunzellen liefert modulierende Faktoren exprimiert und microenviromental Bedingungen, wie der Grad der Hypoxie ^2,4,5.

Obwohl innovative Linie Tracing Ansätzeavancieren unsere Fähigkeit, vermeintliche Krebsstammzellen in ihrer in vivo Nische ⁶ studieren ^{- 8,} bleiben Kugel bildenden Tests zu einem beliebten und bequemen Umgang mit potenziellen Brustkrebszellen 'schätzen, wie Stammzellen zumindest unter den Testbedingungen verwendet verhalten. Es wird häufig neben retrospektiven Verfahren zur Reinigung von Krebsstammzellen verwendet wird, durch ihre Expression von Membranmarker CD44 und CD24 ⁹ und Aktivität des Enzyms ALDH (Aldehyd Dehydrogenase) ^10, Marker, die vorgeschlagen wurden, um entsprechen mehr mesenchymal- und epithelialen -ähnliche Krebsstammzellen bzw. ^11. Die Kugelbildung Ansatz wurde zuerst als Neurosphäre Assay entwickelt, um somit das Wachstum von putativen Stammzellen aus einzelnen Klonen in nichthaftenden, serumfreien Bedingungen mit der Zugabe von epithelialen Wachstumsfaktor (EGF) ^12, wobei später nutzbringend auf normalen und kanzerösen angewendet Brustgewebe.

Ruheknochen fide Stammzellen, gedacht, um in G0-Phase ruhen, nicht die genaue Kombination von Faktoren, die Aktivierung in vivo begünstigen würde zu erleben. Die mammosphere Assay ermöglicht stattdessen das Wachstum von Zellen entweder balanciert für mitotische Teilung oder bereits Division ^13. Diese Vorläuferzellen, die aber nicht eine wirklich ruhende Zelle kann die Zell-Stadium, die mit den im Test verwendeten EGF und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) Mitogene vermehrt sein. Trotzdem enthalten sie eine Reihe von aktivierten Stammzellen-assoziierten Signalwege ^14. Darüber hinaus ist die Geschwindigkeit ihrer Entstehung betrifft die Tumorigenität der Gewebe sie abgenommen hat, wenn sie durch ihre Wirksamkeit in begrenzter Verdünnung Assays in Maus-Xenotransplantaten ^2,15,16 gemessen ^</ Sup>.

Hier stellen wir ausführliche Protokolle um einzelne Zellen zu isolieren, und zum Generieren von Primär mammospheres sowohl von menschlichen Brustkrebs-Zelllinien und klinischer Proben von Brusttumoren. Wir beschreiben auch, wie serielle Passagen von Primär mammospheres durchführen, um die Selbsterneuerung zu bewerten und wie zu berechnen Sphäre Bildungseffizienz, die einen Vergleich zwischen verschiedenen Einsaatdichten (siehe Schema in Abbildung 1) ermöglicht.

Protocol

Die Verfahren sind speziell ethisch von Imperial College, London zugelassen.

1. Erzeugung von Primär Mammospheres von menschlichen Brustkrebszelllinien

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter einer Sterilkultur Kapuze.

1. Bereiten Mammosphere Medien DMEM / F12 mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin. Bereiten komplettem Medium unmittelbar vor der Verwendung durch Zugabe von 20 ng / ml rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; Sigma), 10 ng / ml rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF; R & D Systems) und 1x B27 Supplement.
2. Absaugen Medien aus Kolben mit adhärenten MCF-7 oder MDA-MB-231-Zellen (oder eine Brustkrebszelllinie Ihrer Wahl; 70-80% Konfluenz), waschen zweimal in 1x PBS und trypsinieren Zellen.
3. Zentrifuge Zellen bei 200 · g bei Raumtemperatur für 5 min. Dekantieren und resuspendieren Zellen in 5.1 ml mammosphere Medien. Pipettenach oben und unten und ggf. mit einer 40 um Zellsieb Kappe Filter auf Einzelzellsuspension zu erhalten. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um sicherzustellen, eine Einzelzellsuspension gebildet hat (wenn nicht, verwenden Sie eine 25 G Nadel, um die Zellsuspension bis 3 mal spritze).
4. Ggf. Isolat CD44 + CD24- Zellmenge über FACS unter Verwendung von Anti-CD24-Phycoerythrin (PE) und Anti-CD44-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Antikörper ^9. Alternativ zu isolieren, wie Bevölkerung mit einem Magnetrührer aktivierte Zellsortierung (MACS) System mit Anti-CD44 und anti-CD24-Biotin kombinierten Mikroperlen nach Herstellerangaben. Führen Sie eine positive Selektion mit LS Spalten und negative Selektion mit LD Spalten und bestätigen Sie die Phänotypen aller isolierten Zellen mittels Durchflusszytometrie ^17.
5. Berechnung der Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml unter Verwendung von Trypanblau.
   HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen wird als die Anzahl der lebensfähigen Zellen innerhalb der Gitter geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen an der hemocy berechnetenMeter. Zellen, die bis zu Trypanblau gelten als nicht lebensfähig. Das folgende Verfahren wird verwendet, um genau zu bestimmen Anteil der lebensfähigen Zellen.
   1. Bereiten Sie eine 0,4% ige Lösung von Trypanblau in PBS. Fügen Sie 0,1 ml Trypanblau-Stammlösung zu 1 ml der Zellen. Legen Sie eine Zählkammer und unverzüglich zu untersuchen unter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung. Zählen die Anzahl der Gesamtzellen und der Anzahl der blauen Färbung Zellen.
      Lebensfähige Zellen = [1.00 - (Anzahl der blauen Zellen ÷ Anzahl der gesamten Zellen)] × 100.
   2. Um die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur zu berechnen, verwenden Sie die folgende Formel. Denken Sie daran, für den Verdünnungsfaktor zu korrigieren.
      Anzahl der lebensfähigen Zellen × 10 ⁴ × 1,1 = Zellen / ml Kultur
6. Resuspendieren eine vorgegebene Menge an Zellen in 2 ml Komplett mammosphere Medien in jede Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-adhärenten Platte. Die Aussaatdichte beträgt normalerweise 500-4000 Zellen / cm ² Zelle pro Vertiefung. Optional Verwendung low Aufsatz 24-Well-Platten, während Impfen Zellen mit gleicher Dichte in 0,5 ml Medium.
   HINWEIS: Wir empfehlen, die Optimierung der Aussaatdichte und Zeit der Kultur für jeden Zelllinien von Interesse.
7. Für 5-10 Tage (abhängig von der Zelllinie und der Größe mammospheres) Inkubieren ultra low-Anlage 6-Well-Platten bei 37 ° C und 5% CO _2, ohne die Platten zu stören, insbesondere während der Wachstumsphase der ersten 5 Tage .

2. Erzeugung von Primär Mammospheres von Human Breast Cancer klinischen Proben

HINWEIS: Menschliche Brustkrebsgewebe von Patienten einer Operation zur Entfernung von Brusttumoren erhalten werden. Speicher Gewebe auf Eis für bis zu 24 h in 50 ml sterile Röhrchen in Kulturmedien, die 100 U / ml Penicillin und 100 U / ml Streptomycin. Führen Sie folgende Schritte im Rahmen einer Sterilkultur Kapuze.

1. Übertragen der Probe in eine 100 mm Gewebepetrischale mit einem kleinen Volumen von Medien. Remove das Fettgewebe mit Hilfe einer sterilen Schere, Skalpell und Pinzette.
2. Fügen Sie 2-3 ml DMEM / F12 und Blatt vor der Probe in 1 mm ³ Stück mit einem sterilen Skalpell oder einer Rasierklinge, bis keine großen Stücke bleiben.
3. Resuspendieren der Gewebestücke in vorgewärmter 10 ml DMEM mit proteolytischen Enzymen (3.000 U / ml Kollagenase und 1.000 U / ml Hyaluronidase) und bei 37 ° C in einem Rotationsschüttler, bis alle Gewebefragmenten verdaut werden. In der Regel vollständige Verdauung dauert 1-3 Stunden. Stellen Sie die Kochzeit nach pathologischen Zeichen von Tumoren. (Zum Beispiel Brust-Adenokarzinom ist in der Regel schwerer zu verdauen, verglichen mit muzinösen Karzinomen, die empfindlicher ist und benötigt kürzere Aufschlusszeit). Bewerten Sie den Grad der Verdauung jede halbe Stunde durch die Beobachtung 20 ul Suspension unter Zählkammer.
4. Ermöglichen die Fragmente für 5 min sedimentieren, dann den Überstand in einem 15 ml konischen Polypropylen-Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g für 10 min bei Raum temtur. Dekantieren Sie vorsichtig von den Überstand und resuspendieren Zellen in 1-5 ml mammosphere Medien.
5. Folgen Sie den oben für Zelllinien zu erhalten und plattenEinzelZellSuspensionen beschriebenen Schritte 1,1-1,4. Pass-Zellen durch die Spritze 25 G für bis zu 2-mal, wenn notwendig, schädlichen Zellen zu begrenzen.

3. Mammosphere Forming Wirkungsgrad (%) Berechnung

1. Nach der Kulturzeit, zählen die mammospheres (größer als 40 um) Durchmesser unter einem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Digital Bild 5 zufälligen Feldern mit einer Digitalkamera auf einem Lichtmikroskop und bestimmen den mammospheres Größe mit der Erfassungssoftware. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Software.
2. Berechnen Mammosphere Bildungseffizienz (MFE%) mittels der folgenden Gleichung:
   MFE (%) = (Anzahl der mammospheres pro Vertiefung) / (Anzahl der Zellen pro Vertiefung ausgesät) x 100

4. Serien Passagieren von Mammospheres zur Bewertung der Selbsterneuerung

1. Überstand verwerfen und das Pellet in 500 ul vorgewärmtem 0,5% Trypsin / 0,2% EDTA. Inkubationszeit von 2-3 min.
2. Fügen Sie 500 ul FCS Trypsin zu neutralisieren. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min. Überstand verwerfen und Pellet in 100 ul mammospheres Medien, Auf- und Abpipettieren zu Kugeln zu zerlegen.
3. Zählen Sie die Zellen mit Hämozytometer und festzustellen, ob Zellen in Einzelzellsuspension. Wenn nicht durch eine 25 G passieren Spritze bis zu 3 mal, um Einzelzellen zu erhalten. Samen, die Zellen in eine neue Ultra Low-Befestigung 6-Well-Platte mit der gleichen Dichte im Primärerzeugung verwendet.
4. Nach 5-10 Tagen rechnen Bereichen> 40 & mgr; m und berechnen Sphäre Bildungseffizienz mit Hilfe der Formel bereits berichtet.

Representative Results

Verschiedene Proben oder Personen unterschiedlichen Behandlungen unterworfen wird, kann die Anzahl der mammospheres> 40 um, die nach der Normalisierung für Ausgangszellen ausgesät bilden variieren. Berechnen mammosphere Bildungseffizienz (MFE) für jede Behandlung in drei Exemplaren gezüchtet. Dies ermöglicht Experimente mit verschiedenen Einsaatdichten verglichen werden. Die Daten werden am besten auf einem Balkendiagramm dargestellt, idealerweise mit Positiv- und Negativkontrollen, und die Anzeige der Standardabweichung zwischen den drei Vertiefungen. Anhaftenden Zellen konsequent Transfer in nicht-haftenden Platten bei 60-80% Konfluenz. Sorgfältige Zellzählung ist wichtig, genau zu quantifizieren die Auswirkungen der Behandlungen. Schätzen Sie den Grad der Variabilität, die diesen wichtigen Schritt ist, um Ihre Ergebnisse einen Beitrag, indem man mehrere Suspensionen getrennt von der gleichen Behandlung gut. Wenn die Zellkonzentration gemessen unterscheidet sich deutlich von der gleichen gut, sollten Sie die Verfeinerung Ihrer Zählen Ansatz (Abbildung 2).

Abbildung 1: Die Verarbeitung von primären Brustkrebs und Zelllinie Proben mammosphere Kulturen erhalten werden Proben enzymatisch verdaut, als einzelne Zellen validiert und auf nicht-haftenden Platten in Serum-freiem Medium mammosphere mit Wachstumsfaktoren beschichtet.. Die Platten sollten nicht während der Wachstumsphase behandelt werden, um Kugel Fusion zu vermeiden. Das Bild rechts zeigt repräsentative MCF-7 Kugeln nach 5 Tagen fotografiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der mammospheres von einem epithelialen Östrogen positive gebildet (MCF-7) und eine Dreifach mesenchymalen negative (MDA-MB-231-Zelllinie). Minimale Zellfusion / Aggregation von niedriger Dichte Plattierung bei 500 Zellen / cm ² für MCF-7 erreicht, da, und 1.000 Zellen / cm ² für die MDA-MB-231.

Discussion

Erfolgreiche Bewertung der primären und sekundären mammospheres stützt sich auf Zellen, die bei ausreichend niedrigen Dichten, die Form mammospheres von Einzelklonen, mit minimalen Bereich Aggregation überzogen. Jedoch bei Dichten, die zu niedrig sind, können zu wenige mammospheres bilden, um die Auswirkungen der Behandlungen statistisch unterscheiden. Für jede Zelllinie verwendet, da sie erheblich in ihrer Sphäre bildet Effizienz variieren können, sollten Aussaatdichte optimiert werden (die niedrigen E-Cadherin exprimieren, können weniger stabil und kürzere Laufzeit mammosphere Kulturen ¹⁸ zu bilden). Diese Optimierungsphase sollten sicherstellen, die meisten primären und sekundären Kugelbildung ergibt sich aus der klonalen Wachstum einzelner Zellen. Plattieren einer Zelle pro Vertiefung ist der einzige Weg, um völlig sicherzustellen klonalen mammosphere Bildung und kann zur Quantifizierung der Selbsterneuerung / Differenzierung Raten frisch abgeleiteten Samples ¹³ empfohlen werden. Doch dieser Ansatz leidet auch unter erschwerenden Faktoren: a mammosphere bildenEffizienz von 1% wird nur ein einziges mammosphere pro Platte mit 96 Vertiefungen zu erhalten, und die Effizienz kann mit einer Verringerung der Anzahl mammospheres in der Abwesenheit von parakrine Wachstumsfaktor-Signalisierung zwischen suspendierten Zellen gebildet zu unterschätzen. Schließlich kann die Frequenz des Sekundärkugeln nach Passagierung Ebenen der Selbsterneuerung zu schätzen, und eine höhere Effizienz der Sekundär als Primärkugelbildung zu rechnen ist, wenn wirklich Selektieren auf Zellen, die mit Krebsstammzelleigenschaften. Reaggregation ist ein besonderes Problem bei der Ableitung von Sekundärkugeln und Zelltyp geeigneten sehr niedrigen Zelldichten sollte Richtung optimiert werden.

Die Zeit für mammospheres ergriffen werden, um zu wachsen, um> 40 & mgr; m wird auch variieren und mammospheres aus klinischen Proben müssen gegebenenfalls zwischen 5-12 Tagen, je nach Bereich Wachstumsgeschwindigkeit gewertet. Aggregation und Fusion von Kugeln tritt unvermeidlich aufgrund inhärenter Fortbewegung von Zellen in der Umgebung der Medien, aber das Verfahren weist offenbar im wesentlichen durch ex verbessert werdenperimenters während der Wachstumsphase ¹⁹ bewegt die Platten, was daher zu vermeiden.

Während große Kugeln werden routinemäßig angenommen, dass aus Stammzellen mit höheren langfristigen Replikationsfähigkeit kommen diese Annahme sollten mit Vorsicht behandelt werden. Größere Kugeln kann die proliferative Kapazität von Vorläufern, die Ansprechempfindlichkeit auf Wachstumsfaktoren widerspiegeln, oder ein Produkt der Aggregation oder Fusion sein. Beide Stammzellen und deren Transitverstärkertochterzellen sind in der Lage, die zu mammospheres ^20, wobei der kombinierte Häufigkeit der beiden Zelltypen können noch die Tumorigenität der Quelle Gewebe widerspiegeln.

Die mammosphere Assay wird durch eine Störung, die Komplexität der Krebsstammzellbildung und das Verhalten in ihrem in vivo Nische erfassen beschränkt. Um wirklich beurteilen die langfristigen in vitro und in vivo Selbsterneuerung und Differenzierung von prospektiv isoliert Brustkrebs Stammzellen, MammographieKugel-Tests sollten daher idealerweise in Verbindung mit Linienverfolgung und Xenotransplantation Experimente durchgeführt werden. Während Linienverfolgung stützt sich auf Marker, die genau die Krebsstammzellen Teilmenge, stark profitieren sie von Beibehaltung der in-vivo-Bedingungen, die an die dynamische Bildung von "Knochen fide" Krebsstammzellen bei. Die Beurteilung der Tumorbildung in Xenograft Experimente bei immungeschwächten Mäusen wird auch viele Nischen Komponenten fehlen mammosphere Assays, bei der noch aus menschlichen Immun und Stroma-Komponenten ^21. Obwohl technisch anspruchsvolleren sollten diese Techniken für eine vollständige und informative Ansicht Brustkrebs Stammzelleigenschaften und Tumorigenität versucht werden.

Die mammosphere Test tut bieten einen informativen und bequemes Werkzeug, sofern sie sorgfältig durchgeführt und die oben genannten Einschränkungen gelten: in der Tat, wie die Kenntnisse über die In-vivo-bedingungengen von Krebsstammzellen Fortschritte erlebt, kann mammosphere Assays eine wachsende Zahl von molekularen und Umweltfaktoren zu integrieren. Mit dem oben geschilderten Ansatz, Kugel-Bildungsraten entsprechen den Tumor-Initiation Raten in Xenotransplantaten ^2,15,16 und Selbsterneuerung von Kugeln tut Zunahme aggressiver Brustkrebs ²² ff Stammzellen zunehmende Eingriffe wie Chemotherapie ^23. Unterdessen werden die Kugeln selbst können eine wertvolle Ressource, mit der Expressionsunterschiede und neuartige Faktoren in der Stammzellen Genexpression Architektur beteiligt Studie liefern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146