Abstract
Multipl skleroz kayıp oligodendrositlerin, miyelin, aksonlar ve nöron içeren plak oluşumu ile karakterize edilen merkezi sinir sisteminin enflamatuvar demiyeline eden bir hastalıktır. Remiyelinizasyon yeni miyelin miyelin oluşturan oligodentrositlere çoğalması, işe alım ve oligodendrosit öncü hücrelerin farklılaşması sonra üretileceği bir endojen onarım mekanizması, ve daha fazla hasara gelen aksonlar korumak için gereklidir. Şu anda, multipl skleroz tedavisi için tüm terapötik inflamatuar relaps azaltır ama geri dönüşümsüz nörolojik düşüş ilerlemesini engellemez hastalığın anormal bağışıklık bileşeni, hedef. Bu remiyelinizasyon-teşvik stratejileri hastalığın ilerlemesini geciktirmek ve belki de nörolojik belirtiler ters olabilir geliştirilmesi bu nedenle zorunludur. Demiyelinizasyonun Çeşitli hayvan modelleri deneysel otoimmün ensefalomyelit ve curprizone dahil, mevcut; Bununla birlikte, Limi vardıryeniden miyelin oluşumunu çalışmak için bunların kullanımı kabili. Bir daha sağlam bir yaklaşım kemirgenler omurilik beyaz madde içine deterjan lizolesitin dahil merkezi sinir sistemi içine toksin enjeksiyonu fokal vardır. Bu protokol, farelerde ventral beyaz madde içine enjekte lisolesitin dahil cerrahi işlem hızlı, maliyet-etkin ve piyasada mevcut olan daha ek malzeme gerektirir göstermektedir. Bu prosedür, aynı zamanda, aday remiyelinizasyon destekleyici terapötik taranması için bir ön-klinik bir araç olarak sadece remiyelinizasyon sürecinde yer alan, normal olayları incelemek için önemlidir.
Introduction
Multipl skleroz (MS) bağışıklık hücre infiltrasyonu ve kayıp miyelin, oligodendrositlerin, akson ve nöron içeren plaklar ile karakterize santral sinir sistemi (MSS) kronik demiyelinizan hastalığıdır. Çoğu hasta remisyon dönemleri takip nörolojik semptomlar geniş bir yelpazede eşliğinde inflamatuar nüks oluşan bir hastalık kursu var. Bu hastaların yarısından fazlası sonunda hiçbir belirgin nüks ama sürekli nörolojik düşüş ile ikincil ilerleyici aşamaya geçiş. Bu ilerici bozulma aksonal hasar ve kayıp nedeniyle olduğuna inanılmaktadır, kronik demiyelinizasyon kısmen katkıda bulunmuştur. Kayıp miyelin geri Stratejileri ve böylece hastalığın ilerlemesini geciktirmek ve belki de nörolojik belirtiler tersine çevirmek için umut verici bir tedavi yaklaşımı olarak kabul edilir.
Remiyelinizasyon yeni miyelin kılıflar işe oligodendrosit öncü hücreler oluşturulur sayede MSS bir endojen onarım yanıtıMiyelin oluşturucu oligodendrositler ayırt (OPC). Remiyelinizasyon 1-3 Ancak, verimlilik 4 yaş ile birlikte azalan oldukça sağlam olması, hayvan modellerinde gösterilmiştir. MS hastalarında 5 çoğunda eksik olmasına rağmen Gerçekten de, remiyelinizasyon insanlarda görülür. MS için tüm mevcut ilaçlar öncelikle nüksleri azaltmada etkili olurken, belirgin hastalığın ilerlemesini gecikme yok, hastalığın anormal immün bileşenini hedef ve. MS tedavisi için tedavi stratejilerinin gelecek nesil ve tekerrür ilerlemesini 6 hem de önlemek için endojen remiyelinizasyon donanımıyla immünomodülasyonu gelişmeleri entegre edecek.
Bir yöntem de- çalışma ve MSS remiyelinizasyon omurilik beyaz cevher 1,3,7 içine deterjan lisofosfatidilkolin (lisolesitin) doğrudan enjeksiyon içerir. Bu prosedür iyi karakterize demyelinat üretiryaralanma esas makrofaj / mikrogliyal infiltrasyonu ve aktivasyonu 8,9, reaktif astrogliyozun, aksonal homeostasis / aksonal yaralanma, ve OPC çoğalması ve göç 10 pertürbasyonuna oluşan ing. lezyon tahmin edilebileceği bir kaç hafta süre içinde geliştikçe ve tam remiyelinizan nihayetinde yeteneğine sahiptir. Bu yöntem de- ve remiyelinizasyon katılan olayların koreografisini eğitim özellikle yararlı olmuştur. Ayrıca, bir demiyelinizan hakaret aşağıdaki onarım hızlandırmak için aday tedavilerinin klinik öncesi testler için bir araç olarak kabul edilmiştir.
Protocol
NOT: Bu prosedürde kullanılan hayvanlar Hayvan Bakımı Kanada Konseyi (CCAC) kurallarına uygun olarak bakım için. Etik Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Enjeksiyon için Şırınga hazırlayın
- (PH 7.4 PBS) ve mağaza, küçük kısımlar halinde -20 ° C (75 ul) içeren fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir% 1 çözelti ile lisolesitin çözündürülür. RT bir şişe çözülme.
Not: lisolesitin, çözünmemiş ise, bir tekdüze çözelti oluşturmak için yaklaşık 30 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyici (40 kHz), tüp sonikasyon. - Hassas ucu zarar vermemek için çok dikkatli önceden çekti cam kapiller Kolu. 10 ul enjekte şırınga somunu sökün ve yüksüklerinin çiftleşme uçları hizalayın ve kılcal konik yüksük (Şekil 1) rahat olmasını sağlamak, 2 yüksükler ardından kılcal düz ucuna üzerine geçirin. Izopropil ile şırınga durulayınil alkol ve pistonu çıkartın. Kuru kez, enjekte şırınga üzerine sıkı iğne düzeneği elini sıkın.
- Astar şırınga metal göbek iğne takın. Pierce iğne ile bir lastik disk ve tabanına aşağı doğru kaydırın. Lizolesitin ile astar şırınga doldurun. Sıvı iğne ucu görünür kadar hafifçe priming şırınga basın. Bu hava kabarcıkları enjekte şırınga içine olmayacak sağlar.
- Enjekte şırınga içine astar şırınga metal göbek iğne takın. Kılcal çözeltisi ile ucu doldurana kadar lastik disk ile bir firma mühür yapma, yavaş yavaş priming şırınga basın. Aynı anda hava kabarcıkları tanıtan olmadan enjekte şırınga varil doldurmak için basarken dikkatli astar şırınga çıkarın. Enjekte şırınga içine pistonu takın ve piston hafifçe basıldığında gibi çözüm kılcal ucundan akar sağlamak.
NOT: Herhangi bir hava kabarcıkları kap görünür isenizIllary veya şırınga enjekte şırınga hazırlık başından itibaren tekrar edilmelidir. Enjekte tertibatında sürekli sıvı doğru enjeksiyon hacimlerini sağlamak için çok önemlidir. - Stereotaktik mikromanipülatör koluna tamamlanmış şırınga enjekte takın. Bu tamamlanmış cihaz doldurulmuş gerek önce 15-20 hayvan enjekte mümkün olacak.
- Astar şırınga kalan lisolesitin atın. Çekiniz ve izopropil alkol birkaç kez basın ve metal göbek iğne ayırın. Tekrar doldurmadan önce buharlaşması hazırlama şırınga kalan izopropil alkol birkaç saat bekleyin.
2. Cerrahi Prosedür için Hayvan hazırlayın
NOT: Bu prosedür dişi C57BL / 6 fareleri, yaş 8-10 hafta için bir işlem açıklanmaktadır.
- Ketamin (200 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ya da kurumsal hayvan bakım düzenlemelerine göre bir intraperitonal enjeksiyon ile hayvan anestezisi. PlanıEnjekte anestezi kullanıyorsanız hayvan yaklaşık 1 saat anestezi altında olmak.
- Hayvan derinden sıkıca ayak kısma anestezi olduğunu test edin. Düzgün anestezi hayvan tutam yanıt vermez.
- Makası kullanarak, kulağına yakın hayvanın, dorsal tarafında 2-3 cm 2 alan tıraş. Kulakları zarar vermemek için dikkatli olun.
- Bir gazlı bez uygulanan% 70 etanol ile temiz alana silin. Tüm kırpılmış saç alanından kaldırıldı emin olun. Iyot ile bölgeyi dezenfekte edin.
- Prosedür boyunca kurumasını önlemek için gözlere vazelin uygulayın.
- Prosedürü başlatmak için hazır olana kadar ısıtılmış bir kurtarma odasında hayvan tutun.
3. Cerrahi Prosedürü gerçekleştirin
NOT: prosedürünün tüm adımlar için yeterli aseptik tekniğini emin olun. Bu eldiven, hairnets, maskeler ve perdeler doğru kullanımını içerir. Tüm araçlar temas bilgilerini gelmeden önce sterilize edilmelidirhayvan ile t.
- Bir stereotaktik çerçeve ile hayvan taşımak, dorsal yüzü yukarı, omurga eğriliği abartmak katlanmış kağıt havlu ile orta bölümünde yüksek. Cerrahi bant ile silah ve kuyruk sabitleyin ve bir diş kelepçe ile baş sabitleyin. Dengeleyici kulak çubukları, bu işlem için gerekli değildir.
- Kulakların hemen altındaki başlayan ve kaudal yönde kesim, 3 cm'lik orta hat kesi yapmak için bir neşter kullanın.
- 2 büyük yağ yapıları arasındaki bölünmeyi bulun ve bu ayrı çekmek için her el ince forseps kullanabilir. Cerrahi alan açmak için Ekartörleri yayıldı.
- Bir cerrahi mikroskop altında, T2 vertebra belirgin sonucudur sürecini bulun (Not: Bu özellik C57BL / 6 fare zorlanma karakteristik). Daha T2 görselleştirmek için üstlerinde kas yoluyla kapalı yaylı makas ile künt diseksiyon gerçekleştirin. Forseps kullanarak, uygun anatomik konumu onaylamak için T3 ve T4 sert yüzeyler için üzülüyorum.
- Yaylı makas kullanarak, T3 ve T4 arasındaki bağ dokusu (2-3 mm derinliğinde) sığ yan keser. Nedeniyle fare omurga kolonunun üst göğüs kısmı da omur arasındaki doğal aralık için, laminektomi omurilik ortaya çıkarmak için gerekli değildir. Çok derin bir kesik delmek ve kablosuna zarar edeceği dikkatli olun.
NOT: kanama küçük bir derecede bu aşaması esnasında yaygındır. Bu durum ortaya çıkarsa, kanama Subsidies (30-60 sn) kadar alana bir sünger mızrak tutun. - Omuriliği gözünüzde canlandırın. Kablosunu teşhir ederken bu meningeal tabaka henüz kesilmiş değil eğer görünür dura kalın bir tabaka ile kaplı olacaktır. Tanınmış bir kan damarı omurilik yaklaşık orta hat boyunca kaudal / rostral çalışır.
NOT: Bu damar orta hatta bir işareti olarak kullanılmamalıdır. Bunun yerine, yeterli aydınlatma dorsal sütun yan gri-beyaz cevher sınırlarını açığa çıkarmalıdır ve bu orta hat tahmin için kullanılmalıdır. - Dura Eğertemizlenene kadar bozulmadan kalır, bir 32 G, metal iğne ile nazik yanal scrapes yapmak. amaç olarak kalın ve görmek zor değildir kalan temel meninksler, kesim olmasa da dura kaldırmaktır.
NOT: beyin omurilik sıvısının Yayın araknoid ihlal gösterir ve bu dokuya mekanik zarar vermeden oluşabilir ise, birikmiş beyin omurilik sıvısı daha kord yüzeyini görselleştirmek için bir sünger mızrak ile çıkarılmalıdır. - Yerinde şırınga enjekte ettirin ve kılcal ucu zar zor orta hat her iki tarafında hemen yan omuriliği dokunana kadar yavaşça indirin. Yerinde kolu kilitleyin.
- Bir temel pozisyon ölçümü yapmak için Z-yönü stereotaktik kol kademeli ölçümleri kullanın. Bu okuma, 1.3 mm çıkarmak. Doku delmek için hızlı ve sığ aşağı hareket kullanın ve yeni ölçüm ulaşılana kadar sonra dikkatlice kılcal indirin. İsteğe bağlı: istenirse,Dorsal sütununda lezyonlar orta hatta aynı delme hareketi ve 0.3 mm (Daha fazla bilgi için tartışmaya bakınız) bir derinliğe göre üretilebilir.
NOT: Bu değerler T3 ve T4 arasında enjekte etmek için özeldir. Omurilik herhangi bir başka yerde enjeksiyon yapmak için tercih, bu değerler mevcut herhangi bir fare beyin atlas elde edilmesi gerekmektedir. - Ventral spinal kord beyaz cevher içine lisolesitin bastırmak için mikromanipülatör kullanın. 0.5 ul nihai hacim içinde elde edilen, 2 dakika boyunca mikromanipülatör 1 rotasyonu, her 5 saniye olun. Çözeltinin geri akmasını önlemek için 2 ek dakika yerinde kılcal bırakın, ve daha sonra dikkatlice kılcal çıkarın.
- Omuriliğe kaplanacağı kas / yağ dokusunda tek sütür kravat. Cildi kapatmak için olmayan bir kesintiye dikiş kullanın. Kesi daha fazla iyot uygulayın.
- O iyileşene kadar, daha sonra kendi kafesine geri ısıtılmış kurtarma odasında hayvan yerleştirin. Analjezikler uygulayın sonrasıAmeliyat kurumsal hayvan bakım düzenlemelerine göre. Hayvanlar kısa sürede anestezi onlar kurtarma tam olarak ayaktan ve kendini besleme ve içme yeteneğine sahip gibi ek post-operatif bakım genellikle gerekli değildir.
- Kalan hayvanlar için prosedürü tekrarlayın.
NOT: yeterlilik ile operasyon, özellikle sütür bağlama İkinci bir kişinin yardımıyla, hayvan başına 10-15 dakika içinde tamamlanabilir. ucu künt hale gelir ve değiştirilmesi gerektiğini önce aynı cam kılcal yaklaşık 15-20 ameliyatları için kullanılabilir. Yerine lizolesitin ve omuriliğe PBS enjeksiyonu ile, tarif edildiği gibi kontrol ameliyatları eşit yapılabilir. Biz ileride kullanmak üzere kılcal temizleme tavsiye etmiyoruz.
4. Doku İşleme ve Analiz
- İstenen zaman noktalarında ketamin (500 mg / kg) ve ksilazin (25 mg / kg) intraperitoneal doz aşımı ile hayvanlar kurban. Lezyonlar genellikle foll içinde gelişmeyenedeniyle şekilde: 1-3 gün, aktif demiyelinizasyon; 3-7 gün, OPC işe; 7-10 gün, oligodendrosit farklılaşması; 10-21 gün aktif remiyelinizasyon 2,10,11.
- Ilk önce PBS içinde 20 ml buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid ile ve ardından 20 ml RT PBS ile transcardial perfüzyon 12 yerine, histoloji için doku hazırlanması. Yarı veya ultra ince kesit için reçine gömülü doku hazırlanması için, adım 4.9 bkz.
- Her omurların omurganın servikal sonunda başlayan ve alt torakal seviyesine kadar çalışarak kesmek için kavisli kemik makas kullanarak omurilik çıkarın. 4 ° C'de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde omurilik O / N Düzelt. En az 72 saat için 4 ° C'de PBS içinde% 30 sakaroza kablolarını geçin.
- Omurilik dorsal yüzeyinde bir anormallik olarak enjeksiyon sitesini tanımlamak. (Merkezde enjeksiyon yerinde) ile doku 3 mm parça kesin ve optimal kesim sıcaklığının içeren cryomolds (Ekim) co parçaları hizalayınmpound. Ekim tamamen donmuş kadar 2-metilbütan ve kuru buz içinde soğutulmuş bir karışımı içinde cryomolds alt kısmını süspanse edin. Bölümüne kadar hazır -80 ° C'de saklayın.
- Mikroskop lamı üzerine 20 mikron genişliğinde bölüm kriostat spinal kablolarını ve hava kuru O izin / N -20 ° C'de slaytlar saklamadan önce.
- Miyelin 13 bir eriochrome Siyanin histolojik leke kullanılarak lezyon yerini ve boyutunu algılar. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. 30 dakika için Hava kuru slaytlar. 1 dakika her biri için sınıflandırılmış etanol Çözeltilerin rehidrasyondan sonra 1 dakika boyunca (100,% 95,% 90,% 70,% 50,% su) ajan temizleme yeri kayar.
- Su ile, 1 dakika yıkama ve ardından 15 dakika boyunca eriochrome siyanin çözelti içinde yer kaymaktadır. Su ile, 1 dakika yıkama, ardından 10 saniye boyunca% 0.5 amonyum hidroksit ayırır. Parlak alan mi 1 dakika montaj ortamı, her biri lamel ve görüntü için (yukarıda tarif edildiği gibi ters sırada) dereceli etanol Çözeltilerin kurutmakmikroskop.
- Akson ve miyelin görselleştirmek için immunohistokimyasal kullanın. 30 dakika için Hava kuru slaytlar. Oda sıcaklığında 2 dakika her biri için kademeli etanol (su,% 50,% 70,% 90,% 95,% 100) ile kurutmak, daha sonra tekrar su kelimelerinin sırasını tersine çevirebilir. Bu adım, bireysel miyelin halkaları 14 daha fazla çözünürlük ile sonuçlanır.
- Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca PBS içinde% 10 keçi serumu ve% 0.25 Triton X-100 kullanarak, spesifik olmayan antikor etkileşimi bloke eder. PBS ile 4 ° C sıcaklıkta / O slaytlar üzerinde N inkübe birincil antikor (1000: 2000, tavşan anti-MBP 1 fare anti-SMI312 1) ile seyreltilir.
- Oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika için 5 kez yıkayın. PBS içinde ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca slaytlar üzerinde inkübe sekonder antikor (500: 500, Alexa 546, anti-fare 1 Alexa 488 anti-tavşan 1) ile seyreltilir. Oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika için 5 kez yıkayın. Dağı bir floresan mikroskop GELVATOL ve görüntü kullanılarak lamelleri ile slaytlar.
- Oligodendrosit soy hücreleri görselleştirmek için immunohistokimyasal kullanın. St için prosedürü izleyinep 4.7, dehidratasyon / rehidrasyon adım atlama, ve% 10 at serumu yerine keçi serumu kullanarak. Aşağıdaki primer antikor seyreltileri kullanarak: keçi anti-PDGFRα 1: 100, fare anti-CC1 1: 200, tavşan anti-Olig2 1: 200. Alexa 488 anti-keçi 1: 500, Alexa 594 anti-fare 1: 500, Alexa 647 anti-tavşan 1: 500 Aşağıdaki ikincil antikor dilüsyonları kullanın.
- Ilk önce PBS içinde 20 ml buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid /% 1 glutaraldehid, ardından 20 mi RT PBS ile transcardial perfüzyon 12 yerine, yarı veya ultra-ince kesit için doku hazırlanması. Adım 4.3'de tarif edildiği gibi omuriliğin çıkarın. 4 ° C'de PBS içinde O / N% 4 paraformaldehid /% 1 glutaraldehit düzeltildi.
- Adım 4.4 açıklandığı gibi enjeksiyon sitesini tanımlamak. Enjeksiyon bölgesi içeren doku, 1 mm'lik bir parça kesin. Arzu edildiği takdirde, lezyonun her iki tarafında ek 1 mm'lik blokları ile hazırlanabilir.
- Bir çeker ocak içinde, buz üzerinde, her blok 10 kat hacim% 1 ozmiyum tetroksit /% 1.5 potasyum ferrosiyanür eklemek60 dakika karıştırıldı.
NOT: osmiyum tetroksit son derece zehirli bir maddedir ve aşırı dikkatle ele alınmalıdır. Ozmiyum tetroksit ile temas eden her türlü malzemenin nötrleştirme için mısır yağı (ozmiyum tetroksit çözeltisi olarak iki hacim) yerleştirilmelidir. - Mısır yağı içinde atarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.2 M kakodilat kordon 3 kez yıkayın. Dereceli etanol solüsyonları (suda,% 50,% 70,% 90,% 95, 2 kat,% 100 ile 2 kez, propilen oksit ile 2 kez) ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca birlikte dihidrat.
- Üreticinin talimatlarına göre reçine embed kordonlar.
- Bir ultramicrotome blokları kesin ve mikroskop slaytlar üzerinde su damlacıkları üzerine bölümleri monte edin. Kuru kadar sıcak bir plaka (yaklaşık 50 ° C) yerleştirin kayar.
- 50 ° C'de 10-15 saniye boyunca slaytlar üzerine mavi,% 1 toluidin /% 2 boraks solüsyonu ve bir kaç damla eklenerek miyelin görselleştirmek. Montaj medya ile su, kuru, ve lamel ile durulayın. Parlak alan mikroskobu Görüntü bölümleri.
Representative Results
Ventral beyaz cevher içine lisolesitin Odak enjeksiyonu yaklaşık 3 mm (Şekil 2) bir mesafe üzerinde saptanabilen bir ayrık demiyelinizan lezyon üretir. Lezyon miyelin için çekirdek (MBP) ve akson (SMI312) immünohistokimyasal boyama 7 gün (Şekil 3) de miyelin elimden edilmiş aksonlar gösterir. 14 gün, birçok aksonlar remiyelinizasyon oluşumunu göstermektedir MBP-pozitif halkalar ile çevrilidir. Oligodendrosit soy (PDGFRα, Olig2, CC1) hücreler için boyama, 7 gün, hem de OPC kıyasla olgun oligodendrosit dağılımı ile karşılaştırıldığında 14 gün hücrelerin toplam sayısı açısından önemli bir artış (Şekil 4) . Buna paralel olarak, toluidin mavisi ile lekelenmiş de yarı ince kesitler, bu i remyelinated belirten nadiren 7 gün sonra (Şekil 5) tespit edilir 14. günlerde ince miyelin kılıflarının varlığını ortaya çıkarmaknternodes.
Prosedür hayvanlar arasındaki yüksek tekrarlanabilir. Ağır solunum durağan konumunu değiştirir zaman varyasyon meydana kılcal-bu genellikle yeterli sedasyon ile ilgili bir sorun değil. Akson hasar modeli 1 erken kullanımı beri tarif edilmiştir lezyon, çok merkezi hariç, en az olduğu görülmektedir. Biz PBS kontrolleri enjekte da gözlemlenebilir olduğu gibi bu, cam kapiller gelen mekanik yaralanma olduğuna inanıyorum. Bununla birlikte, değişkenlik, küçük olma eğilimindedir, ve ve benzer bir prosedür kullanılarak, diğerleri grup başına 15 4 kadar az hayvan deney koşulları arasındaki farklar tespit ettik.
Enjekte şırınga Şekil 1. Meclis. (A) enjekte şırınga somun t üzerine dişli onların çiftleşme kilidi biter 2 ferüle böyle izledi cam kılcal düz uç. Kılcal sıkıca konik yüksük içinde rahat sonra, montaj sıkı enjekte şırınga ucuna elini vidalanır. (B) astar şırınga bağlı metal göbek iğne ile lastik diskin merkezi Piece ve aşağı doğru kaydırın Baz. (C) emişli şırınga içine çözüm lisolesitin çekin. (D) yavaşça lizolesitin ilk damla iğne ucu görünür kadar. (E) hazırlama şırınga basınız enjekte varil içine astar şırınga yerleştirin kauçuk disk ile bir firma mühür, şırınga. Bu kılcal sonuna kadar bitene kadar yavaşça çözüm basın. Enjekte şırınga içine hava kabarcıkları tanıtan olmadan metal göbek iğneyi çıkarmak için piston üzerindeki baskıyı korurken dikkatlice hazırlama şırınga çekme./ 52.679 / 52679fig1large.jpg "target =" _ blank "upload> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Eriochrome cyanine ile lekelenmiş lezyon lisolesitin Şekil 2. Örnek. Seri kesitler eriochrome cyanine ile boyanmış 14 gün değerinde bir karakteristik lisolesitin lezyon (400 um aralıklı) miyelin (mavi) görselleştirmek için. Bu demiyelinizasyon ventral beyaz cevher ile sınırlıdır Not ve lezyon rostral / kaudal yönde yaklaşık 3 mm açıklıklı söyledi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Aksonlar ve miyelin içindelisolesitin modeli. (A) sahte (PBS) 7 gün omuriliği enjekte miyelin halkalarla çevrelenmiş sağlıklı aksonlar göstermektedir. 7 gün lezyon bozulmuş miyelin yanı sıra aksonlar soyulmuş gösterir lisolesitin (B). (C) 14 gün sonra, bir akson (beyaz ok başları ile gösterilen örnekler) oranı miyelin halkaların yeniden ortaya çıkma ile ilişkilidir. Ölçek çubuğu = 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil lisolesitin modelinde 4. oligodendrosit kökenli hücreler. (A, C) 7 gün sonra, CC1 + oligodendrositler (kırmızı çubuklar) için daha büyük bir PDGFRα + OPC gösterimi (beyaz çubuklar) göreli vardır; barlar içinde sayıları yüzdelerini temsil ederler. Olig2 için problanmıştıroligodendrosit soy hücrelerinin boyama teyit etmektedir. (B, C) 14 gün sonra, var 7 gün (p <0.05, iki-kuyruklu t-testi ile karşılaştırıldığında oligodendrosit soy hücrelerinin toplam sayısında belirgin bir artış olduğunu, grup başına n = 4 ). 7 gün (p <0.0001, Fisher'in kesin testi) göre 14 gün OPC için oligodendrositlerin dağılımında önemli bir artış vardır. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Her alan 60X orijinal büyütme yakalanır. Değerler ortalama ± SD bulunmaktadır. * P <0.05 belirtir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Lisolesitin modelinde Şekil 5. remiyelinizasyon. (A) hea ventral beyaz cevher bölümüne yarı ince boyanmış bir kesit toluidin mavisilthy fare (B), 7 gün sonra., ilgili miyelin kalınlığında kalibreli, geniş bir aralıkta aksonlar gösterir miyelin kılıflarının eksikliği (sağ alt) bir etkilenmemiş alanına bitişik görülmektedir. 14 gün sonra (C) ince miyelinli kılıflar ( Kırmızı ok uçları ile gösterilir örnekler) remyelinated kesimleri gösteren lezyon boyunca görünür. Ölçek çubuğu = 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Hayvan modellerinde çok sayıda MS, en tanınabilir deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modeli üzerinde geliştirilmiştir. EAE olarak, kemirgenler, bir miyelin peptid bir parçası aşısı ve artan felç tezahür inflamatuar lezyon gelişimini tabi olan. Yarı veya ultra ince için doku işlerken Öncelikle, inflamatuar lezyonların yeri biraz rastgele ve lezyon yerini: Bu model, bağışıklık MS ilaçların klinik öncesi testler için yararlı olsa da, bu üç ana nedenden dolayı yeniden miyelin oluşumunu incelemek için ideal değildir bölümler zor olabilir. İkinci remiyelinizasyon belirli bir zaman boyunca oluşur ve tek bir EAE lezyonun kesin yaşı sürekli non-invaziv manyetik rezonans görüntüleme olmadan bilinen edilemez olduğunu. Üçüncü remiyelinizasyon ilacın birincil sonucu olmayabilir EAE ilaç tedavisi sonrasında doğal olarak oluşan kemirgenler fenomen ve remiyelinizasyon kanıt olduğunu, amainflamasyonu azaltarak bir ikincil fenomen yerine.
Demiyelinasyon üretilmesi için bir başka genel yöntem diyet bakır kenetleyici cuprizone sokulması ile elde edilir. Bu özellikle korpus kallosum olarak, yaygın demiyelinizasyon sonuçlanır. Öncelikle, akson çapları (ve dolayısıyla miyelin kalınlığı) Diğer MSS bölgelere göre daha küçüktür ve bu nedenle ince remyelinated kılıflar demiyelinize asla olduğunu ayırt edilemez olabilir: Aşağıdaki nedenlerden dolayı remiyelinizasyon bir site olarak korpus kallosum okuyan sınırlamalar vardır. Fare korpus kallosum>% 70 miyelinsiz aksonlar 16 içerdiğinden İkincisi, bir remyelinated bölüm 17 normal meydana yetişkin, hasarlı miyelin veya de novo sentezi miyelin gerçek onarım olup olmadığı belirsiz olabilir.
Bu yeniden miyelin oluşumunu incelemek için en iyi model toksinlerin direkt enjeksiyon, ya lisolesitin, ethid olduğunu, bizim inanç olduğunukaudal serebral peduncles 18 veya spinal kord beyaz cevher içine iyum bromür, ya da diğerleri. önceki konum sadece hassas 3 boyutlu stereotaktik enjeksiyon ile elde edilir, ve bağlı serebellar pedinküllerin küçük boyutuna göre daha büyük kemirgenlerde (sıçan) ile sınırlıdır. Bu De- ve yeniden miyelin oluşumunu okuyan transgenik farelerin geniş kaynak dışlar. Spinal kord, ancak, kolay erişilebilir cerrahi birçok büyük beyaz cevher yolları içerir. Rostral torakal segmentte omurları arasındaki alanlarda kaudal torakal cerrahi prosedürlerde gerekli bir adımdır bir laminektomi, gerek kalmadan omuriliğin maruz sağlar. Özellikle ventral beyaz maddeyi hedef bir avantajı aksonlar remiyelinizasyon ölçümü yaparak, dorsal beyaz cevher daha eşit daha büyük olduğunu daha az belirsiz görev benzer korpus kallosum ile ilişkili zorluklar. Ayrıca, ventral beyaz madde çok daha büyük bir t yaparenjekte alanı HEDEF; Aynı sapma ventral hala önemli bir demiyelinizan lezyon üretecektir ise yanal sırt bölgesinde birkaç yüz mikron, sütunun dışında kılcal yer olacaktır. Bazı protokoller dorsal ve aynı hayvan 19 ventral sütunlar hem içine enjekte lisolesitin. Bu doğru kılcal yerleştirme olasılığını ve daha az hayvanlarda ölçülebilir lezyonların sayısını hem de artırabilir. Sunulan mevcut veri işlem sırasında 8-10 haftalık hayvanlardan iken, biz de remiyelinizasyon 4 belirgin yavaş olarak açıklanan 8-10 aylık fareler, aynı prosedürü kullanarak başarı vardı.
Remiyelinizasyon Niceliklendirilmesi önemsiz bir girişim değildir. Bir santral dogma remyelinated kesimleri sağlıklı muadillerine göre ortalama uzunluğu kısa ve incedir ve kesit yarı o böylece g-oranı hesaplamaları (akson çapı akson + miyelin çapı bölü) olduğunu öne sürenr ince kesitler standart prosedür haline gelmiştir. Ancak, remyelinated segmentler zaman üzerinde 2 kalınlaştırmak ve remiyelinizan oligodendrositlerin bir transgenik muhabiri kullanarak yeni bir çalışma, birçok internod sonunda kontrol 20 ayırt edilemez hale düşündürmektedir bilinmektedir. Lezyon içindeki olgun oligodendrositlerin sayısı belirleme oligodendrositler internod geniş sayıda yapabilen gibi, onarım ölçmek için dolaylı bir yoldur ve remiyelinizasyon-bağlı modeline önemli bir bölümü kullanılmış olabilir Schwann hücrelerinin 3 den oluşur. Remiyelinizasyon saltatory iletim 21 restorasyonu ile bağlantılı olduğu gibi tabii ki, onarım nihai metrik nörolojik defisit fonksiyonel iyileşme olacaktır. Remiyelinizasyon bazı türlerde 22,23 fonksiyonun geri kazanım ile ilişkilendirilmiştir edilmiş olmakla beraber, bu sıçangil lisolesitin çalışmalarda standart bir prosedür olmamıştır. Bu durum, açık Gözlem eksikliğinden dolayı büyük olasılıklaBöyle EAE ve hatta cuprizone olarak daha sağlam demiyelinizasyon modelleri ile karşılaştırıldığında dorsal veya ventral ya lezyonlardan mümkün açıkları. Biz remiyelinizasyon ile enjeksiyon, ve sonraki kurtarma lisolesitin kaynaklanan fonksiyonel açıkları, sadece ince Sensorimotor işleyişi hassas testler kullanılarak gözlemlenebilir olacağına inanıyoruz.
Bir kaba metodolojik bir yaklaşım olsa, yukarıda sıralanan hayvan modellerinde iki yanında "remiyelinizasyon" A PubMed arama, EAE (188) ve cuprizone (197) ile karşılaştırıldığında (109) lisolesitin için daha az arama hit gösterir. Demiyelinizasyonu lisolesitin yeniden miyelin oluşumunu incelemek için üstün bir yaklaşım olduğunu, bizim argüman, neden ise en az tartışılan? Belki de bu yöntemi kullanarak bir yakalama cerrahi işlemi gerçekleştirmek teknik zorluk, bir inanç kaynaklanmaktadır. Aslında, bu prosedür tüm, Ticaret malzemeleri gerektiren, hızlı, uygun maliyetli ve hiçbir rutin doku diseksiyonu daha zorolarak mevcut. Bu protokol miyelin onarım heyecanlı ve genişleyen alanı çalışmak için kendi repertuarına bu güçlü modeli eklemek istediğiniz olanlar için yararlıdır kanıtlıyor bizim umudumuz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R. Myelination of the mouse corpus callosum. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
