Abstract
Calcium ist ein wichtiger Regulator von vielen physiologischen Prozessen in vaskulären Geweben. Esten Endothel- und glatten Muskelfunktionen hängen stark von Änderungen der intrazellulären Calcium ([Ca 2+] i) und Stickstoffmonoxid (NO). Um zu verstehen, wie [Ca 2+] i, NO und Downstream-Moleküle werden durch ein Blutgefäß in Reaktion auf Vasokonstriktoren und Vasodilatatoren behandelt, eine neue Technik, die Kalzium-Kennzeichnung gilt (oder No-Kennzeichnung) entwickelten wir Farbstoffe mit zwei Photonen-Mikroskopie Kalzium Handhabung (oder NO-Produktion) in isolierten Blutgefäße zu messen. Hier beschrieben ist eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die, wie man eine Aorta einer Ratte, Etikett Calcium oder NO in den Endothelzellen oder glatten Muskelzellen zu isolieren und Bild Calciumtransienten (oder NO-Produktion) mit Hilfe eines Zwei-Photonen-Mikroskop folgenden physiologischen demonstriert oder pharmakologische Reize. Die Vorteile der Verwendung des Verfahrens sind mehrfach: 1) es ist möglich, gleichzeitigely messen Calciumtransienten sowohl in Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur als Antwort auf verschiedene Stimuli; 2) es erlaubt, Bild Endothelzellen und glatten Muskelzellen in ihrer Muttereinstellung; 3) Diese Methode ist sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calcium oder keine Änderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen; und 4) beschriebene Vorgehensweise kann auf die Messung von anderen Molekülen, beispielsweise reaktive Sauerstoff-Spezies angewandt werden. Zusammenfassend Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie Laseremission zu Calciumtransienten und NO-Produktion in den Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Blutgefäß hochwertige quantitative Daten zur Verfügung gestellt und förderte unser Verständnis der Mechanismen, die Gefäßfunktion zu überwachen.
Introduction
Calcium ist ein Grund second messenger in vaskulären Zellen wie Endothelzellen und glatten Muskelzellen. Es ist der primäre Stimulus für die vaskuläre Kontraktion und spielt eine wichtige Rolle bei der Gefäßerweiterung, einschließlich der Auswirkungen unverErzeugung innerhalb des Endothels. Aufgrund der Beschränkungen von Imaging-Technologien, hat es praktisch unmöglich gewesen, Kalzium Handhabung innerhalb des intakten Schiffes zu beobachten. Die Entwicklung der Zwei-Photonen-Imaging-Systeme und die Schaffung neuer Calcium oder keine Kennzeichnung Farbstoffe, macht bei einer ausreichenden Tiefe und Auflösung es möglich, Bild zu beginnen, um Kalziumdynamik und NO-Produktion innerhalb des Gefäßsystems zu verstehen.
Zwei-Photonen-Mikroskopie hat vor kurzem in Gewebe, Organe und sogar ganze Tierstudien wegen seiner überlegenen Fähigkeit, tief Gewebe mit geringer Hintergrundfluoreszenz und hohe Signalempfindlichkeit eindringen angewendet. 1,2 Der schmale Spektrum des Zwei-Photonen-Anregung bei der illuminatIonen Brennpunkt und die Verwendung nichtdescannten Detektoren sind die Gründe, warum zwei Photonen-Mikroskopie ist den herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Konfokale Mikroskopie kann qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen an der notwendigen Gewebetiefe aufgrund der Autofluoreszenz und die Streuung von out-of-focus Licht in die konfokale Lochblende. Folglich haben wir ein Verfahren unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskop zur Messung von [Ca 2+] i-Signalisierung und die NO-Produktion in intakten, einzelnen Zellen von Blutgefäßen mit hoher Auflösung und niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis entwickelt.
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Protocol
Die im folgenden beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am Medical College of Wisconsin genehmigt und waren in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Isolierung von Rattenaorta,
- Betäuben Ratten mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) oder einem anderen IACUC genehmigten Methode.
- Legen Sie die Ratte in Rückenlage. Um die Bauchorgane aussetzen, einen kleinen ventralen Mittellinie Schnitt durch die Haut und das Unterhautgewebe Bauch. Verwendung Gazekompressen leicht abzulenken den Darm, die Aorta und die Vena cava freizulegen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Kurz, stumpf sezieren die Aorta vom Bindegewebe und aus der Vena cava. Verwendung Naht, binden Sie die Aorta so nah wie möglich an die Nieren. Sezieren etwa 1-2 cm von Aorta und legen Sie sie in einem 15 ml konischen tusein enthält normale physiologische Kochsalzlösung (PSS; in mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl 2, 2 CaCl 2, KCl 4,5, 6 Glucose, 10 HEPES) auf Eis.
- Sobald der Aorta wird isoliert, das Tier einschläfern nach anerkannten IACUC Protokolle. Bei Beendigung aller nicht-Überlebens Verfahren einschläfern tief narkotisierten Tiere durch Thorakotomie induzieren Pneumothorax, um die humane Ableben des Tieres zu gewährleisten. 3
- Mit Hilfe eines Dissektionsmikroskop, spitzen Pinzette und Mikroschere sezieren das Fett und Bindegewebe aus der Aorta. Sobald der Aorta ist sauber, schneiden Sie die Aorta in Längsrichtung und legen Sie sie in PSS auf Eis für später.
2. Dye Loading und Incubation
- Pipette 7 ul 1 mM Fluo-4.00 Farbstoff, der in DMSO basierenden Lösung zugeführt wird, in einzelne 500 ul Röhrchen, die mit Aluminiumfolie bedeckt worden. Lagern Sie im Gefrierschrank bei -20 ° C, um die Farbstoffeigenschaften mit der Zeit zu bewahren. Hinweis: Diese aliquotiert sosungen sollte für mindestens sechs Monate stabil sein.
- Vor dem Einsatz, damit die Farbstofflösungen zum Aufwärmen auf RT vor dem Öffnen. Bereiten Sie Arbeitslösungen unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die verdünnte Reagenz für die spätere Verwendung.
- In 7 ul fertiger 1 mM Fluo-04.00 Farbstoff in DMSO-Lösung zu 450 ul der PSS, die kein Calcium aufgelöst. Dann werden 40 & mgr; l DMSO nicht anhand 10% Pluronic Säurelösung zu der Lade Cocktail um die Dispersion der Acetoxymethyl- (AM) Ester und verbessern Beladung des Calcium-Farbstoff.
- Legen Sie die seziert Aorten in die 500 ul Röhrchen, die das Laden Cocktail (wie in 2.3) für 1 h. Decken Sie alle Rohre mit Folie und Platz auf einem rotierenden Schüttler bei RT.
- Um die NO-Produktion in das Gefäßsystem zu überwachen, verwenden Sie DAF-FM-diacetat Farbstoff. Inkubieren der Aorta in einer Lösung, die 450 ul PSS 40 ul Pluronsäure und 5 ul 10 mM DAF-FM-diacetat. Ähnlich wie bei der Kalzium Inkubationsprotokoll (in 2.3), legen Sie die Aortain einem 500 ul Röhrchen mit dem in der Folie und auf einem rotierenden Schüttler für 30 min bei 4 ° C, gefolgt von nächsten 30 min bei RT, abgedeckt NO-Farbstofflösung.
- Wenn die NO-Produktion gemessen wird, verwenden Sie die endotheliale NO-Synthase-Blocker, L-NAME, um die NO-Produktion als ein Steuerungsblock, wie in 4B gezeigt. Für dieses Verfahrens in den Cocktail (Stand 2.5 beschrieben), 100 nM L-NAME für die letzten 30 Minuten Inkubation (bei RT).
3. Laser Scanning Zwei-Photonen-Mikroskopie Protocol
- Nach 1 h Inkubation, Waschen der Aorta 2 - 3 mal in saubere PSS an extrazelluläre Farbstoff zu entfernen.
- Übertragen die Aorta in eine silikonbeschichtete Schale, die entweder normal PSS oder Ca 2+ -freiem Puffer (abhängig von der experimentellen Protokoll). Pin die Aorta nach unten auf die Silikonbeschichtung mit der Adventitia in Kontakt mit dem Silicon (dh endothelial Lumen zu der Schale Öffnung freigelegt) mit μ-förmigen Stiften. Alternativ können Sie einen Slice-AnchorGitter oder Klebstoff, um das Gewebe zu reparieren.
Anmerkung: Um Stress und mögliche mechanische Artefakte, Übertragung zu reduzieren und zu beheben Aorta in Ca 2+ -freien Lösung und warten Sie 5 - 10 min vor dem Start des Experiments. - Verbinden eine peristaltische Pumpe oder eine Spritze zu der silikonbeschichteten Platte für die automatische oder manuelle Anwendung von Arzneimitteln oder zur Veränderung der extrazellulären Lösung.
- Die Schale unter dem Mundstück des aufrechten Zwei-Photonen-Mikroskop, und installieren Sie und positionieren Sie eine 25 × (NA 1,05 und Arbeitsabstand 2 mm) Wasser-Immersions Objektivlinse über der Probe. Hinweis: Wenn diese spezifische Linse nicht verfügbar ist, verwenden Sie ein Objektiv speziell für Zwei-Photonen-Imaging hergestellt, weil es Signalauflösung drastisch im Vergleich zu einem regulären Ziel zu erhöhen.
- Aktivieren Sie die Zwei-Photonen-Laser mit Hilfe der Software (der Laser beginnt zu pumpen und schalten Sie). Tune die Laseranregung zu 820 nm.
- Verwendung Epifluoreszenz, suchen Sie die Aorta und konzentrieren sich auf das Ziel,die endotheliale Oberfläche mit Grobeinstellung.
- Schaltet das Mikroskop in zwei Photonen-Laser-Scanning-Modus, so dass die Anregungslaser-Modus gesperrt ist, die nichtdescannten Detektoren aktiviert, und die entsprechenden mit dem erwarteten Emissionsspektren Emissionsfilter installiert sind. Hinweis: Hier wird die FV10-MRL / R (495-540 nM) wurden verwendet.
- Starten Sie Live-Scannen mit ca. 5% der Laserleistung und fein fokussieren das Ziel, um die Endothelzellen zu visualisieren.
Hinweis: Die Endothelzellen ein starkes Fluoreszenzsignal aufweisen, wenn sie in normalen PSS inkubiert. Dies wird deutlich schwächer sein, wenn die Schiffe in calciumfreien Puffer inkubiert. Die Endothelzellen auf der Oberseite der geöffneten Aorta und die glatten Muskelzellen unterhalb der Endothelzellen (siehe Figur 2) zu sehen ist anwesend sein wird. Da die Blutgefäße sind weder glatt noch einmal, wird es Orte, an denen sowohl glatten Muskelzellen und Endothelzellen vorhanden sind. </ Li> - Sobald die Zellen im Fokus sind, programmieren Sie die Mikroskop-Software aufeinanderfolgenden Bildern in Fast-Scan-Modus (Raster-Scan, 512 x 512 Pixel-Fenster mit einem Rahmen Sammlung Frequenz von 1,1 s) zu sammeln. Parallel Fluo-04.00 Fluoreszenz, sammeln, um Veränderungen in der Gefäßkontraktion zu erfassen und die Versuchsbedingungen besser sichtbar zu Durchlichtbilder.
- Nach der Erfassung der grundlegenden Signalbilder, ändern Sie die Ca 2+ Ionen-Konzentration in der Außenlösung oder langsam gelten pharmakologischen Reiz Agenten mit Hilfe der Schlauchpumpe, während Bildgebung. Beobachten Sie das Fluoreszenzsignal Anstieg innerhalb der beladenen Zellen.
Hinweis: Die Endothelzellen reagieren auf Änderungen der Strömungs, empfiehlt es sich daher, um laminare Nieder Anwendungen und Fahrzeugtests vor der Anwendung von pharmakologischen Aktivatoren von Ca 2+ oder keine Signalisierung zu verwenden. Um intrazellulären Calcium zu nM Konzentrationswerte in Gefäße mit Fluo-4 (Dissoziationskonstante für Fluo-4 i geladen wird neu berechnets 345 nm) konnten Fluoreszenzintensität bei der Grundlinie und nach der Zugabe von Ionomycin und MnCl 2 aufgezeichnet. 4
4. Bildverarbeitung und Berechnungen
- Downloaden und installieren Sie Fiji Bildverarbeitungspaket.
- Öffnen Sie die Bilddatei in Fidschi. Nach dem Importieren der Datei, teilen Sie die Kanäle (Durchlicht und Fluoreszenzsignal), wenn Sie dazu aufgefordert. Verwenden Sie nur das Fluoreszenzsignal für die Datenanalyse.
- Innerhalb der Fiji-Programm, klicken Sie auf der Registerkarte Analyse und unten scrollen, um die Option Tools. Unter der Option Tools, finden Sie auf die Registerkarte, die ROI-Manager sagt, und klicken Sie darauf; Ein neues Fenster wird angezeigt.
- Danach klicken Sie auf Set-Messungen auf der Registerkarte Analyse. Wählen Sie die spezifischen Messungen von Interesse. Für die Kalzium transienten Messungen, verwenden Sie den mittleren Grauwert-Option.
- Mit der Kreis Trace-Tool, damit beginnen, die Regionen von Interesse (ROI) zu verfolgen und klicken Sie auf "Hinzufügen" auf der ROI-Manager-Bildschirm für jeden ROI. Sobald alle Zellen von Interesse verfolgt worden, in der Manager-Fenster ROI, wählen Sie Multi Measure unter der Registerkarte "Mehr". Denken Sie daran, entweder speichern Sie die Messungen direkt oder Kopieren und Einfügen alle diese Messungen in eine Tabellenkalkulation.
- Öffnen * .txt-Datei oder Excel-Tabelle aus Fidschi und übertragen Sie die Zahlen auf ein neues Origin-Arbeitsblatt. Hinweis: Alternativ können Sie ein beliebiges Programm wie Sigma Plot oder Prism für die weitere Analyse.
- Innerhalb der Origin-Programm verwenden Plot → Line + Symbol-Menü, um einen Überblick über alle vorübergehenden Reaktionen zu beobachten. Deaktivieren Sie die nicht reagierenden Zellen.
- Neu berechnen Spurennummer Zeitskala (X-Achse), verwenden Spalte → Spaltenwerte errechnen und multiplizieren Sie die Spur-Nummer Spalte, um die Fotosammlung Frequenz (in unserem Fall 1,1 s).
- Verwenden Sie Analysis → Zeilenstatistik für alle ausgewählten Aufnahmen auf Mittelwert (Y-Achse) und Standardfehler Spur zu berechnen. Plot endgültige Graph zur aktuellen Gruppe von Zellen Plot → Line + Symbol.
- Die MEAn Calciumtransienten Berechnung wird beschrieben, wie gefolgt.
- Für Gesamtcalciumfreisetzung innerhalb des Origin-Programm, klicken Sie auf Graph, dann verwenden Sie Menü → Analysis Infinitesimalrechnung → integrieren. Gesamtintegral der Fläche unter der Kurve erscheint im Ergebnisprotokoll.
- Für transiente Kinetik, klicken Sie auf Graph, dann verwenden Menü: Analyse → Nichtlineare Kurvenanpassung → Wählen Sie Data Set (wählen X-Achse reichen von maximal bis zum Ende der Übergangsfunktion). Starten Fitting → Select Function → Exponential Decay 1 → Done.
Hinweis: Exponential Einbau in Grafikfenster angezeigt und Ergebnisprotokoll. Erhaltenen Daten (Werte), die den Gesamtcalciummenge freigegeben wird, und die Kinetik der Kanäle vermittelt das Einschwingverhalten.
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Representative Results
Um genau zu beurteilen, den Beitrag von Calcium zu vaskulären Physiologie (Vasodilatation und Vasokonstriktion) wurde ein Protokoll entwickelt, um Calcium-Farbstoffe in beiden Endothelzellen und glatten Muskelzellen in isolierten intakten aortae laden. Die allgemeine Versuchsanordnung in 1 dargestellt ist, zeigt die grundlegende Strategie für die Isolierung und Herstellung des Schiffes vor der Bildgebung. Kurz gesagt, nach der Isolierung der Aorta der Ratte, sollte es von Fett und Bindegewebe gereinigt und in Längsrichtung geschlitzt sein. Die geöffnete Aorta sollte dann in einem folienbedeckten 500 ul Röhrchen, das den Stand der vorbereiteten Lade Cocktail wie in dem Protokoll für 1 h mit winklige beschrieben und bei RT inkubiert platziert werden. Nach der Inkubation sollte die Aorta gewaschen werden, nach unten auf ein mit Silikon überzogen Platte mit der Adventitia nächsten zu dem Silikon und Lumens nach oben gesteckt und in eine aufrechte Zwei-Photonen-Mikroskop für die Bildgebung übertragen.
Once die Aorta wurde am Mikroskop gelegt und der Behälter ist im Fokus, sollten die Endothelzellen einfach, durch ihre starke Fluoreszenzemission (2A) zu lokalisieren. Die Endothelzellen wird auch das erste Objekt in den Fokus gerückt, weil das Lumen des Gefäßes, die in erster Linie von Endothelzellen besteht, sollte nach oben zeigen, wenn der Behälter festgenagelt werden. Zusätzlich zu Endothelzellen Abbilden, wird es dort, wo glatte Muskelzellen sichtbar (Figur 2B) ist. Also sowohl Endothel- und glatten Muskelzellen könnte innerhalb des gleichen Bildfeld (2C) identifiziert werden. Mit der Fähigkeit, Bild sowohl vaskulären Zelltypen innerhalb des gleichen Bildfeld zu einem besseren Verständnis, wie diese Zellen gemeinsam, aber unabhängig, auf verschiedene Agonisten und Reize führen.
Um die Nützlichkeit dieses Verfahrens zu demonstrieren, Messungen der Aorta Zellen Ansprechen auf die Zugabe von acetylcholine (ACh), ein potenter Vasodilator, der spezifisch verursacht Änderungen im Endothel, wurde bestimmt. Wie in 3A gezeigt, können die Endothelzellen leicht gesehen werden, während in der normalen PSS inkubiert. Nach der Zugabe von ACh (3B), was darauf hinweist Endothelzelle Fluoreszenz steigt dass die intrazelluläre Kalziumgehalt nimmt ebenfalls zu. Die Quantifizierung der emittierten Fluoreszenz der ROIs oder Endothelzellen, ist in 3C gezeigt. Nach der Zugabe von ACh, die intrazellulären Calciumgehalt erhöht kehrt erst schnell und dann langsam wieder auf den Ausgangswert. Die Erhöhung der Calcium in den Endothelzellen als Reaktion auf ACh stimmt mit früheren Berichten. 5,6
Ähnlich wie Calcium Studien ist dieses Protokoll für den Nachweis der endothelialen NO-Produktion. Für diese Experimente wurden Endothelzellen aus der Aorta mit DAF-FM-diacetat Farbstoff beladen, wie dargestellt auf4A. Dieser Ansatz wurde kürzlich verwendet, um zu zeigen, dass die NO-Produktion erhöht sich in einer Ca 2+ -abhängigen Weise in Reaktion auf ACh Stimulation. 6 ist wichtig, dass nach der Behandlung mit L-NAME, eine endotheliale NO-Synthase-Inhibitor, war diese Reaktion blockiert (4B).
Ein weiteres repräsentatives Beispiel für diese Technik, um die intrazelluläre Calcium messen zu können ist im Video 1, wobei Calcium enthaltende Lösung wurde in einen Behälter, der an Kalzium freien Puffer inkubiert wurde gezeigt. Wenn Aorta werden zunächst in der Calcium freien Puffer inkubiert (zu Beginn des Videos) werden die Endothelzellen schwach fluoreszierenden Anzeige niedrigen Calciumspiegel in den Zellen. Jedoch nach der Zugabe von normaler PSS, wobei die Zellen durch eine Erhöhung von [Ca 2+] i-Konzentration und hoher Intensität emittierende Fluoreszenz sofort reagieren. Dieses Experiment zeigt, dass die Zellen am Leben sind undals Reaktion auf externe Stimuli. Dieses Experiment bestätigt auch die Lebensfähigkeit dieses Verfahren mit seiner Ausbeute von qualitativ hochwertigen Daten.
Abbildung 1. Aorta Isolation und Versuchsaufbau. 1) Nach Betäubung der Ratten, einen Einschnitt in den Bauch und zu isolieren, die Aorta aus dem Bindegewebe und die Hohlvene. 2) Nach der Extraktion der Aorta, reinigen Sie den Behälter von Fett und Bindegewebe und öffnen Sie den Behälter durch Schneiden in Längsrichtung. 3) Inkubieren des Gefäßes in der Fluo-04.00 Farbstoff für 1 h bei RT unter leichtem Schaukeln. 4) Nach der Inkubation, waschen Sie die Aorta, stecken Sie es auf einen mit Silikon beschichteten Platte, Lumen nach oben zeigt, und überträgt es auf der Bühne eines aufrechten Zwei-Photonen-Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Imaging glatten Muskelzellen und Endothelzellen. Nach ausreichender Belastung des Calcium-Farbstoff, ist es möglich, Bild sowohl glatten Muskelzellen und Endothelzellen. (A) nach oben, ist ein Beispiel für Fluo 4 Fluoreszenz von Endothelzellen in einem isolierten Rattenaorta. Bottom, ist ein Fluoreszenzbild verschmolzen mit Durchlicht-Ansicht (in ähnlicher Weise für B und C). (B) ist ein Beispiel für Fluo 4 Fluoreszenz der Zellen der glatten Muskulatur in einer isolierten Rattenaorta. (C) aufgrund der ungleichmäßigen Dicke der Aorta, ist es auch möglich, Bildbereiche, in denen sowohl der glatten Muskulatur und Endothelzellen vorhanden sind. Maßstabsbalken angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendiese Zahl.
Abbildung 3. Mess Calciumtransienten in Endothelzellen in Reaktion auf ACh. (A) Die Aorta wurde zunächst hergestellt und in normalen PSS-Puffer für die Baseline-Aufnahmen inkubiert. (B) Nach der Zugabe von Acetylcholin (ACh), das Fluoreszenzsignal von den Endothelzellen (ROIs) verbesserte Anzeige zunehmende Mengen an Calcium in den Zellen emittiert wird. Maßstabsleiste angezeigt. (C) Die Calciumtransienten der Endothelzellen als Reaktion auf Ach wurden unter Verwendung Origin-Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Imaging Stickstoffmonoxid in den Endothelzellen. (A) Nach dem Laden der Aorta mit dem DAF-FM-diacetat Farbstoff und stellen Sie es auf der Bühne eines Zwei-Photonen-Mikroskop, ist es möglich, Bild-Nr Ebenen innerhalb der Endothelzellen Verwendung emittierte Fluoreszenz. (B) Nach der Inkubation mit der endothelialen NO-Synthase-Inhibitor, L-NAME, verringerte sich die Gesamtfluoreszenz innerhalb der ROIs, was reduzierte Mengen an NO in den Zellen. Maßstabsleiste angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Video 1. Beispiel für Endothelial Cell Reaktionsfähigkeit auf Veränderungen der Calcium Concentration. Nach der Herstellung und Inkubation in Fluo-4.00 Farbstoff wurde die Aorta mit Calcium-freien Puffer gewaschen und auf der Stufe eines Zwei-Photonen-Mikroskop gelegt. Wenn der Behälter in der Calcium-freien Puffer eingesetzt werden, sind die meisten der Endothelzellen schwach fluoreszierend. Nach der Zugabe von normaler PSS die Endothelzellen reagiert durch Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration und Emittieren eines starken Fluoreszenzsignal.
Video 2. Beispiel der NO-Produktion in Endothelzellen isoltated Rattenaorta. Nach der Herstellung und Inkubation in DAF-FM-diacetat Farbstoff wurde die Aorta auf der Stufe eines Zwei-Photonen-Mikroskop gelegt. Nach Zugabe von Ach um Badlösung, die Endothelzellen reagiert durch Erhöhung der intrazellulären NO Produktion und Emission eines starken Fluoreszenzsignal. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
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Discussion
Experimental Übersicht. Um besser zu verstehen, vaskuläre Physiologie des Beitrags von Kalzium und NO wurde eine neuartige Methode zur Messung entwickelt [Ca 2+] i und NO in glatten Muskelzellen und Endothelzellen isolierter intakter Aorta. Zusammen, dieses Protokoll besteht aus diesen kritischen Schritte: 1) Mechanische Isolierung und Herstellung (nicht enzymatische Verdauung) des Schiffes. Es ist wichtig, das Gewebe gesund und intakt, so viel wie möglich, um eine optimale physiologische Aufzeichnungen erhalten bleiben. 2) Inkubation in der Calcium-Markierungsfarbstoff oder NO-Markierungsfarbstoff mit Pluronsäure kritisch ist, jedoch ist für andere Gefäße Typen, muss eine andere Pluronsäure und Inkubationszeit geprüft werden. 3) Die richtige Fixierung der Aorta zu dem Silikon beschichteten Schale mit dem Gitter und der Stifte eine stabile Sicht während der Bildgebung mit der Zwei-Photonen-Mikroskop bereitzustellen. Da das Schiff zu verengen und erweitern, ist es wichtig, um sicherzustellen, dass das Schiff propeRLY an der Schale befestigt ist, um Bewegungsartefakte zu vermeiden, die entstehen können. 4) Die Quantifizierung der Ergebnisse. Bitte beachten Sie, dass Übergangsamplitude kann nicht immer die beste Parameter, um die physiologischen Eigenschaften der Zellen zu vergleichen. Das Integral der transienten kann eine bessere Unterschied wegen der insgesamt [Ca 2+] i oder NO-Freisetzung zeigen.
Wenn die Versuche richtig ausgeführt werden, ist es möglich, zur Überwachung der [Ca 2+] i (oder keine Stufen) sich in Reaktion auf Reize wie in den 3 und 4 gezeigt und Video 1 und 2. Die Kombination aus einer ex vivo Herstellung und Die Verwendung von zwei Photon Imaging kann eine bessere Signalauflösung und präzise Messungen der intrazellulären Prozessen in vaskulären Geweben. Hier wurden diese Technologien in Kombination mit der klassischen nicht-ratiometrische Ca 2+ und keine Indikatoren (Fluo-4 Uhr und DAF-FM-diacetat, respectively), anzuwendenmessen Calciumtransienten und NO-Produktion in einzelnen Zellen eines isolierten ganze Aorta. Wir glauben, dass diese Technik wird dazu beitragen, unser Wissen über die Mechanismen, die zu übermitteln [Ca 2+] i und NO-Spiegel innerhalb der verschiedenen Gefäßzelltypen.
Änderungen und Fehlersuche. Die grundlegenden Prinzipien des Messens Ca 2+ Signalisierung in einzelnen Zellen der glatten Muskulatur mit empfindlicher Ionophore wurde zunächst in 1985 veröffentlicht am 7. Die meisten der bisherigen Verfahren zum Abbilden Ca 2+ -Spiegel in einzelnen vaskulären Zellen eine Laser-Scanning-Konfokalmikroskop und isoliert eingesetzt oder kultiviert Zubereitungen. Für dynamische Gewebe wie Blutgefäße, ist es schwierig, Calcium oder keine Ebenen in vivo unter Verwendung von Mikroskopie-basierte Techniken zu messen. 2 Die wichtigste Einschränkung dabei ist, dass nahezu alle Blutgefäße auf der arteriellen Seite des Kreislaufs eine innere elastische Lamina, die dazwischen liegt die endotHelium und die innerste Schicht von glatten Muskelzellen. 8 Weiterhin ist der größte Teil der extrazellulären Material zwischen der glatten Muskulatur und Adventitiaschicht Kollagen. 8 Elastin und Kollagen sind eine Hauptquelle von Auto-Fluoreszenz mit hoher Intensität und einen weiten Bereich von Anregungswellenlängen . Die starke Hintergrundfluoreszenz bei konfokale Abbildung mit erhöhter Lichtstreuung gekoppelt erzeugt Low-Signal-Auflösung und daher reduziert Nachweis von Calcium-Signal oder NO-Produktion. Der limitierende Faktor der Belastungsfluoreszenzsonden in vaskulären Zellen in ausreichender Konzentration, um aussagekräftige Messungen durchführen kann unter Verwendung eines ex-vivo Herstellung, eine Zwei-Photonen-Mikroskop sowie unter Anwendung einer neuen Klasse von Ionophoren wie Asante Red, die Fluoreszenz bei langen emittiert gelöst werden Wellenlängen, in denen es weniger Störung von der Autofluoreszenz des Bindegewebes und Fasern. Allerdings ist eine der wichtigsten Einschränkungen dieses Verfahrens, dass es difrigeren, zwei oder mehr Farbstoffe während der Bildgebung zu kombinieren. Die Anregungsspektren für die meisten der verfügbaren Farbstoffe für zwei Photon Imaging haben breite polymodale Verteilungseigenschaften, die es zur Messung von zwei verschiedenen Ionophoren gleichzeitig erschweren. Jedoch könnte geräuscharm werden hybride Detektoren verwendet werden, um die erfassten Emissionsspektren unter der Annahme, dass die Ionophore emittieren Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen zu verengen. Beispielsweise wird in diesem beschriebenen Verfahren ist es nicht möglich, sowohl die NO-Produktion und Ca 2+ Konzentrationsänderungen zu messen, da die Emissionsspektren überlappen.
Vaskulären Endothelzellen, die in direktem Kontakt mit dem Blutfluss sind, um eine Fluidscherbeanspruchung ausgesetzt und regulieren vaskulären Homöostase. 9 Das gegenwärtige Verfahren kann auch angewendet werden, um strömungsinduzierte Calciumtransienten und NO-Produktion in Endothelzellen ex vivo zu überwachen. Darüber hinaus kann diese Methode erfolgreich zu studieren Ca 2+ Konzentrationen angewendet werden,tion Veränderungen in glatten Muskelzellen der kleinen Widerstands Arterien aus der Niere extrahiert. In diesem Fall sollten die seziert kleinen Widerstand Arterien in Ca 2+ -freien Lösung inkubiert werden, um glatte Muskelzellschäden durch Ca 2+ eine Überlastung zu vermeiden. Diese Modifikation kann auch auf die Aorta eingesetzt werden, um den Zelltod zu reduzieren.
Perspektiven. Fluoreszenzbasierte Bildgebung wurde in großem Umfang verwendet, um die Zellphysiologie in vitro zu studieren; Allerdings tun isolierten Zellmodelle nicht immer wiederholen physiologischen Prozesse, die, wenn die Zellen in ihrer natürlichen Umgebung vorkommen. Dies hat die Anwendbarkeit von Zelllinien, um translationale Forschung beschränkt. 10, wie hier beschrieben, die Verwendung von ex vivo Vorbereitungen hat uns die Möglichkeit, Zellverhalten in frisch isolierten Gewebe überwachen gegeben, wo alle lokalen physiologischen Prozesse und die Interaktion mit anderen Zelltypen sind immer noch auftritt . Mit der wachsenden Anzahl von genetischen engineering verfügbaren Technologien und die Entwicklung von Modellen, die menschliche Krankheiten zu rekapitulieren, ex vivo Vorbereitungen wird ein nützliches Werkzeug für die translationale Forschung sein. Für die hier beschriebenen Studien wurde die Dahl Salz-Sensitive (SS / JrHsdMcwi) hypertensiven Rattenstamm verwendet wird. Der SS-Ratte ist ein natürlich vorkommendes Inzucht genetische Modell der salzsensitiven Hypertonie, die viele Aspekte der fortschreitenden menschlichen Bluthochdruck rekapituliert. Dieses Modell wird intensiv genutzt und hat wichtige Einsichten in die Mechanismen, die Salzempfindlichkeit und vaskuläre Dysfunktion. 11-13 Mit diesem Rattenmodell vorgesehen ist, haben die Forscher in der Lage, den Beitrag der wichtigsten Mechanismen, um komplexe Erkrankungen (wie Bluthochdruck) Test mit ZFNs , Talens, und CRISPR / Cas-basierte Gen-Bearbeitungstechnologien. 6,14-17 Mit der hier zusammen mit diesen Gen-Bearbeitungsressourcen beschriebenen Versuchsdurchführung ist es nun möglich, beginnen die Prüfung der Beteiligung von Kalzium und andere wichtige Faktoren, um Salz -sensitivenBluthochdruck und Gefäßstörungen in vielen verschiedenen Tiermodellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Dr. William Cashdollar, und der Northwestern Mutual Foundation Imaging Center an der Blut-Research Institute of Wisconsin für die Hilfe bei den bildgebenden Untersuchungen. Wir danken auch Dr. Daria Ilatovskaya für die kritische Durchsicht des Manuskripts und hilfreiche Diskussionen. Diese Studie wurde vom National Institutes of Health Grants HL108880 (AS) und DP2-OD008396 (AMG) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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