Summary
Organización celular de los huesos craneofaciales mucho tiempo se ha planteado la hipótesis pero nunca visualizada directamente. Etiquetado de células multi-espectral y en vivo vivo imágenes permite visualizar el comportamiento celular dinámico en el maxilar inferior del pez cebra. Aquí, detallamos el protocolo que manipulamos Zebrabow peces transgénicos y observamos directamente intercalación celular y los cambios morfológicos de los condrocitos en el cartílago de Meckel.
Abstract
Desarrollo de las estructuras craneofaciales vertebrados requiere una coordinación precisa de la migración celular, la proliferación, adhesión y diferenciación. Patrones del cartílago de Meckel, un primer arco faríngeo derivado, implica la migración de las células de la cresta neural craneal (CNC) y la división progresiva, la proliferación y la organización de los condrocitos diferenciados. Varios estudios han descrito la migración CNC durante la morfogénesis inferior de la mandíbula, pero los detalles de cómo los condrocitos alcanzar organización en el crecimiento y la extensión del cartílago de Meckel sigue sin estar claro. El SOX10 restringido y químicamente inducido Cre recombinasa recombinación mediada genera permutaciones de proteínas fluorescentes distintas (RFP, YFP y PPC), creando de este modo un etiquetado multi-espectral de células progenitoras y su progenie, lo que refleja poblaciones clonales distintas. Usando confocal fotografía time-lapse, es posible observar los condrocitos behavio durante el desarrollo del cartílago de Meckel el pez cebra.
Etiquetado celular multiespectral permite a los científicos para demostrar la extensión de los condrocitos de Meckel. Durante la fase de extensión del cartílago de Meckel, que prefigura la mandíbula, los condrocitos se intercalan para efectuar la extensión, ya que se apilan en una fila en capas de una sola célula organizada. El fracaso de este proceso de intercalación organizado para mediar en la extensión de células proporciona la explicación mecanicista celular para mandíbula hipoplásica que observamos en las malformaciones de la mandíbula.
Introduction
Desarrollo craneofacial requiere, interacciones celulares y tisulares moleculares complejas para impulsar la proliferación celular, la migración y la diferenciación 1,2, 3. Este proceso estrechamente regulado y complejo está sujeto a perturbaciones genéticas y ambientales, de tal manera que las deformidades craneofaciales se encuentran entre las malformaciones congénitas más comunes 1-9. Si bien las intervenciones quirúrgicas siguen siendo la base del tratamiento de anomalías craneofaciales, la comprensión de la base del desarrollo es esencial para innovar terapias futuras. Por lo tanto, el estudio de la morfogénesis y los mecanismos en la convergencia y la extensión y la integración de células proporciona nuevos conocimientos sobre la formación del esqueleto craneofacial 1.
Craneal migrar y la cresta neural pueblan el primer arco faríngeo, procesos mandibulares luego formar pares que se extienden para formar el cartílago de Meckel, que prefigura la mandíbula. Morfogénesis of cartílago de Meckel requiere organización condrocitos mediante la proliferación de dirección, la polarización celular y 1,10 diferenciación. Sin embargo, la complejidad de la organización de los condrocitos en el crecimiento y la extensión del cartílago de Meckel sigue siendo poco clara. Comprender el comportamiento celular dinámica es fundamental para comprender las malformaciones congénitas que afectan al tamaño de la mandíbula, como fenotipos mandíbula hipoplasia 11.
Embriones de pez cebra ofrecen muchas ventajas del desarrollo y genéticos para el estudio detallado de los cartílagos morfogénesis de Meckel. Su maleabilidad genética, la transparencia, la ex vivo y el rápido desarrollo son poderosas ventajas de préstamos bien para la observación del movimiento celular y la organización de imágenes en vivo 6. El uso de herramientas de trazado de linaje, como SOX10: línea transgénica Kaede, nosotros y otros han delineado los orígenes de la cresta neural del esqueleto craneofacial embrionaria 1,5. Using del SOX10: ERT2-Cre con el ubi: línea transgénica Zebrabow-M, ahora es posible explorar los detalles de los movimientos celulares durante el desarrollo craneofacial. El Zebrabow-M, es una línea transgénica diseñado con el promotor de ubiquitina de conducir la expresión de diferentes fluoróforos, cada uno flanqueado por sitios lox 8. El fluoróforo predeterminado Zebrabow-M es rojo, expresando RFP. Después de la inducción de la expresión de Cre, la Zebrabow-M construir recombina y células expresan una combinación de diferentes fluoróforos (RFP, CFP y YFP) la creación de expresión multi-espectral en el embrión. Todas las células hijas que dividen a partir de las células marcadas después del evento de recombinación son entonces clonalmente etiquetados, de modo que las poblaciones de células que se derivan de diferentes progenitores yuxtapuestas están etiquetados clonalmente. Por este etiquetado celular clonación, la proliferación de células y la migración con la resolución clonal pueden ser seguidos (Figura 1 y 2).
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Protocol
Cuidado y Uso Comité Hospital General de Massachusetts Institucional Animal (IACUC) aprobó todos los procedimientos previstos en el número de protocolo # 2010N000106. Esto está de acuerdo con la Asociación para la Evaluación y Acreditación de directrices Laboratorio Animal Care International (AAALAC).
1. Los reactivos y materiales de preparación
- Preparar 1 l de 50X medio E3 embrión (Ver Tabla 1) y preparar 1 L de medio embrión 1X E3 (Ver Tabla 2).
- Preparar medio de embrión E3 con N-feniltiourea (PTU) mediante la adición de 30 mg de PTU a 1 L de 1X E3. Stir O / N para asegurar que el PTU se haya disuelto completamente. Guarde a temperatura ambiente.
- Para preparar la solución de pronasa, diluir 150 ml de pronasa (0,5 mg / ml) con 15 ml de 1X E3. Esta cantidad es suficiente para un plato de Petri 1. Utilizar inmediatamente.
- Prepare la solución de metilcelulosa.
- Preparar la solución E3-tricaína mezclando 75 ml de 0,2% con 25 ml tricaínade 1X E3. Hervir 3 g de metilcelulosa en 75 ml de la solución E3-tricaína.
- Completar el volumen final a 100 ml con solución E3-tricaína. La solución de metilcelulosa al final es viscosa y opaca con un tinte amarillento. Almacenamiento: RT protegido de la luz.
- El tamoxifeno acción y solución de inducción
- Preparar 5 mM solución madre tamoxifeno por disolución de 4-hidroxitamoxifeno en etanol 100%. Tienda de stock a -80 ° C.
- Preparar la dilución fresca de tamoxifeno a la concentración deseo en 1X E3 para obtener la solución de inducción. ¡CUIDADO! Por favor, consulte la hoja antes de su uso.
- Preparar 1 L de 0,2% tricaína según la Tabla 3.
- Obtener diapositivas confocal. Pega cuatro cubreobjetos (18 x 18) juntos para formar un bloque a continuación, colocar los bloques en un 2 x 24 60 cubreobjetos 2 cm entre sí para permitir el montaje del embrión en el centro.
2. Preparación de embriones
- Las líneas transgénicas.
- SOX10: ERT2-Cre
NOTA: Generar el vector dirigido pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre usando métodos de clonación molecular estándar y obtiene comercialmente recombinación tecnología de clonación.- Combinar 5 'clon de entrada (pENTR5'- sox10p) que contiene el promotor de 7.2Kb SOX10, un clon media Gateway (PME-ERT2-Cre), y un 3' clon de entrada (pENTR3'-poliA) en una reacción LR con destino lente vector pDestTol2- α-cristalina: YFP.
- Purificar constructo pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. Co-inyectar la construcción purificada (100 ng / l) con Tol2 ARNm transposasa (50 ng / l) en embriones WT (F0) en la fase de una célula.
- Pantalla fundadores F0 adultos para la transmisión de la línea germinal basan en una fuerte fluorescencia amarilla en embriones F1.
- SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
- Outcross la Zebrabow-Mlínea (2.1.1) con el SOX10: línea transgénica ERT2-Cre.
- Seleccionar embriones que presentan una fuerte expresión RFP ubicua y el marcador lente YFP y crecer hasta los adultos.
3. Embryo Collection
- Configurar varios pares de SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M pez cebra transgénico 17:00-18:00 del día 1.
- Al día siguiente, tire de los divisores de la mañana y recoger los huevos alrededor del mediodía.
- Transferirlos a cápsulas Petri y añadir 15 ml de la solución de pronasa a dechorionate los embriones.
- Incubar los embriones de 1 a 5 minutos hasta aproximadamente el 60% de los embriones han sido dechorionated. Detener la reacción por decantación la solución de pronasa y lavar los embriones 3-4 veces con medio fresco E3.
- Incubar los embriones dechorionated en E3 a TA O / N y dejar que ellos desarrollan para alcanzar la etapa 10 somitas. Incubar 50-60 embriones por el embrague para evitar diferente crecimiento del desarrollo. 4. Tratamiento
- Compruebe la etapa de desarrollo de los embriones en un microscopio de campo claro para asegurar que están en la etapa de 10 somitas.
- El uso de un microscopio de fluorescencia con una proteína fluorescente (RFP) filtro rojo, aislar a los embriones de color rojo brillante.
- Proceder a la inducción de la recombinación Cre-mediante la adición de 10 mM de solución hydroxytamoxifen a la placa de Petri e incubar los embriones aislados en 28,5 ° C durante 3 hr.
- Decantar la solución tamoxifeno y lavar los embriones varias veces con el E3.
¡CUIDADO! deseche la solución tamoxifeno en un recipiente especial desechos biológicos. - Incubar los embriones a 28,5 ° CO / N.
- Cuando los embriones son aproximadamente los 28-29 etapa somitas (alrededor de 24 horas después de la fecundación), incubar los embriones a 28,5 ° C en el E3-PTU solución de aquí en adelante.
NOTA: PTU es aquí utilizado para inhibir la formación de melanóforos en los embriones en desarrollo. Este tratamiento es necesarioevitar la distorsión de la señal de fluorescencia por melanóforos auto-fluorescente. - Incubar los embriones a 28,5 ° C
- Para visualizar las estructuras craneofaciales plenamente desarrollados, seleccione los embriones a los 4 días después de la fecundación de la intensidad de la señal roja y Cre positividad marcador expresión (amarilla en la retina).
- Anestesiar al embriones con solución E3 / 0,015% tricaína. La anestesia se confirma cuando no hay movimientos activos o actividad de la aleta se observa cuando pinchar suavemente el embrión.
- Transferir el embrión seleccionado para la imagen en una placa de Petri que contiene una gota de metilcelulosa y embalsamar suavemente el embrión con metilcelulosa.
- En una diapositiva confocal limpia, coloque una gota de metilcelulosa fresco y montar el embrión dentro de la gota usando una punta microloader. Posición embrión teniendo dorsal precaución de no tocarel embrión directamente.
- Cubrir el embrión montado con un cubreobjetos de 25 x 25 y ajuste la posición del embrión si es necesario mediante la manipulación del cubreobjetos.
- El embrión está ahora listo para la imagen.
- Utilice el objetivo 20x seca lente (apertura numérica 0,75; tamaño del agujero de alfiler 2,0 micras) para enfocar el embrión.
- Pulse el botón L100 en el microscopio y seleccionar los canales en el software.
- Seleccione el botón de configuración confocal y haga clic en 'auto' y seleccione los siguientes canales antes de cerrar la ventana: Ch1: PPC, Ch2: GFP, Ch3: RFP o mCherry
- Encienda CH2 y CH3 antes de hacer clic en el botón "eliminar interlock '. Haga clic en "juego" para comenzar la exploración.
- Concéntrese en estructura de interés, que es mejor hacerlo iniciando con marco ½ / seg y de alto voltaje (HV) 150 y luego ajustar la configuración en consecuencia hasta que la calidad de imagen deseada es achieved. En el PP sería más brillante que otros colores, por lo tanto, ajustar el HV. Cambie la posición de Z a encontrar tanto YFP y células positivas RFP.
- Una vez configurado con los ajustes, la captura de la imagen de su embrión. Guarde su imagen en el formato confocal formato de software de imagen y TIFF para el procesamiento de imágenes en cada canal de división.
- A continuación, para obtener imágenes de la PPC, apague CH2 y CH3 y encienda Ch1. Re-ajustar la configuración como en el paso 5 sin cambiar el área de enfoque.
NOTA: PPC puede ser muy difícil de detectar debido a la señal de fondo en el canal azul que pueden ser eludidas mediante el ajuste del tamaño del agujero de alfiler. Un tamaño del agujero de alfiler grande permite una mejor detección de la fluorescencia mediante la reducción de ruido de señal / fondo. Sin embargo, un agujero de alfiler grandes reducirán efecto confocal, comprometer la calidad de imagen. Por lo tanto, se requiere un ajuste cuidadoso de los ajustes para lograr la calidad de imagen deseada y la intensidad. - Captura de la imagen y guardarla en el formato tanto (software confocal y TIFF) para procesamiento de imágenes. Las imágenes pueden ser procesados utilizando el software común de procesamiento de imágenes para fusionar capas y mejorar los ajustes de color como se describe por Pan y sus colegas 8.
Selección 5. Embriones
6. Montaje del Embrión en Metilcelulosa
7. Análisis por microscopía de fluorescencia
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Representative Results
Visualización cartílago tradicional por enteros manchas azules montaje Alcian ha sido muy valioso para observar el desarrollo de cartílago de Meckel y de uso común para la visualización definitiva celular organización 12 (Figura 1). A fin de analizar los condrocitos en desarrollo las horas extraordinarias, el linaje de rastreo utilizando SOX10: Kaede líneas transgénicas nos ha permitido estudiar la migración celular, la convergencia y la extensión en embriones vivos 2,12 (Figura 1B). Sin embargo, la organización de los condrocitos en la estructura del esqueleto craneofacial sigue siendo poco conocida. Por imágenes en vivo, la línea transgénica Zebrabow-M es capaz de revelar el proceso de intercalación de condrocitos y la elongación que media la extensión y el crecimiento del cartílago de Meckel (Figura 1C-G).
En este protocolo, ubi: Zebrabow-M; SOX10: embriones ERT2-Cre fueron tratadas con tamoxifeno a 10 somitas y chondrocitos en la mandíbula inferior se visualizaron en diferentes momentos durante el desarrollo (de 3 a 5 dpf dpf). La mandíbula inferior está mejor representado ventralmente para permitir una visión clara de cartílago de Meckel sin la interferencia de la placa y neurocranium etmoidal dorsal. Los colores mantienen establemente heredados y permiten una fácil localización y el linaje de células CNCC suerte de cartografía como se indica por las flechas negras en la Figura 2A-2D. La célula azul sola parece migrar y intercalar con sus células vecinas. A continuación, se alarga a lo largo del eje anterior-posterior para formar una forma de condrocitos uniformemente manteniendo así la forma global del cartílago de Meckel medida que se extiende en sentido anterior.
Esta técnica permite el estudio de las malformaciones de crecimiento de la mandíbula inferior en el nivel celular y de órganos en condiciones tales como la secuencia de Robin donde micrognatia es una de las características prominentes descritos. El fracaso en la proliferación, la extensión o la intercalación se puede visualizar de manera efectiva en t él creciente condrocitos con el tiempo.
| NaCl | 14,61 g |
| KCl | 0,65 g |
| CaCl 2 | 1,83 g |
| MgSO 4 | 1,99 g |
| Desionizada H 2 O | 1.000 ml |
| * Almacenamiento: RT | |
| ** Añadir 1 gota de azul de metileno como un anti-hongos | |
Tabla 1. 50X E3 embrionario medio receta
| 50X E3 | 20 ml |
| Desionizada H 2 O | 980 ml |
| * Almacenamiento: RT | |
| 1M Tris-Cl (pH 9,5) | 9 ml |
| tricaína | 2 g |
| Desionizada H 2 O | Completar hasta 1 litro |
| * Almacenamiento: RT | |
Tabla 3. 0,2% receta tricaína
Figura 1. (A) el cartílago de la fluorescencia Meckel de SOX10:.. GFP (B) el cartílago de disecado Meckel de un embrión de 4 dpf Tübingen manchada con Alcian azul (C) líneas de pez cebra transgénicos ubi: Cruz Zebrabow-M con SOX10: ERT2-cre. (DG) ubi: Zebrabow-M; SOX10: ERT2-Cre imagen en el RFP (D), YFP (E), PPC (F) canales y fusionar (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. (AD) Timelapse fotografía de Zebrabow-M: SOX10: ERT2-Cre en 3dpf (A), 3.5dpf (B), 4dpf (C) y 5dpf (D). Las flechas negras señalan el mismo clon individual. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Líneas transgénicas azules y fotoconvertible Alcian como se ha descrito anteriormente complementa entre sí para definir el intrincado proceso de cartílago y desarrollo de los huesos. Sin embargo, la migración celular en vivo y la organización durante la organogénesis mucho tiempo se ha planteado la hipótesis e indirectamente demostrado pero nunca visualizó. Línea transgénica Zebrabow-M junto con un cartílago Cre específica permite la observación en vivo simultánea de todos estos eventos distintos implicados en la formación de hueso y cartílago. Esta técnica permite el estudio de defectos de crecimiento de la mandíbula inferior en el nivel celular y de órganos en condiciones tales como la secuencia de Robin donde micrognatia es una de las características prominentes descritos. El fracaso en la proliferación, la extensión o la intercalación se puede visualizar de manera efectiva en los condrocitos que crecen con el tiempo.
Optimización de la diversidad de color
Optimización de los niveles de Cre valorando la concentración de 4-hidroxitamoxifeno puede controlar la extent de la recombinación y la diversidad de color sin dar lugar a letalidad embrionaria. El estrógeno es crítico para el desarrollo normal de la retina y por lo tanto, dosis más altas de tamoxifeno (> 25μM) puede inducir la degeneración retina, las tasas de mortalidad altas (~ 60 a 80%), malformaciones craneofaciales y retrasos en el desarrollo. Además, 4-hidroxitamoxifeno se diluye en etanol, que en sí mismo es tóxico durante el desarrollo embrionario 13. Por lo tanto, es importante para determinar la mejor concentración y la duración de la exposición para obtener una buena tasa de recombinación, pero limitar la toxicidad para los embriones.
La concentración deseada de 4-hidroxitamoxifeno ha sido optimizado en este protocolo. Diferentes concentraciones (5-25 mM), puntos de tiempo de inducción (10 somitas, 24, 36 y 48 HPF) y duración (30 min a 6 h) se ensayaron (datos no mostrados). Una dosis baja de tamoxifeno (5 mM) produjo una recombinación limitada, mientras que dosis más altas (de 10 mM a 20 mM) producen simIlar recombinación y la diversidad color. Dosis superiores a 20 M en peligro el desarrollo normal de los embriones y por lo tanto no es adecuado para el estudio de las malformaciones craneofaciales. Duraciones de inducción de menos de 2 horas no eran suficientes para crear recombinación adecuada mientras que más de 6 horas de la toxicidad inducida por la inducción y anomalías del desarrollo de los embriones. La inducción de 3 o 4 horas no fue diferente en la cantidad de recombinación y los resultados finales.
Inducción después de la etapa embrionaria 24 HPF no produce la recombinación deseada y expresión fluorescente. Por lo tanto, el mejor compromiso entre el desarrollo normal y cantidad adecuada de colores sin que se produzca significativamente altos números de mortalidad embrionaria se determinó que era 3 h de inducción a 10 somitas con una concentración de 10μM de tamoxifeno.
Calidad de la imagen
La obtención de imágenes de calidad consistentes y altos puede ser un reto. Si un solo campo de view es incapaz de visualizar todo el cartílago de Meckel o estructura craneofacial de intereses, toda la estructura se puede asignar mediante la adopción de Z-pilas. Sin embargo, la obtención de Z-pilas puede ser un reto en las imágenes de embriones en vivo debido a artefactos de movimiento. Por lo tanto, es importante tener un compromiso entre la calidad de la imagen Z-pila, la cantidad de información requerida durante la sesión de formación de imágenes y la prevención de foto-blanqueo inducida por láser durante la exposición de láser más largo plazo.
Otra limitación de esta técnica es que las proteínas fluorescentes no muestran la misma estabilidad durante la exploración. Por ejemplo RFP es una proteína relativamente estable, pero YFP puede ser inestable. Por lo tanto, es importante para determinar la mejor configuración de imagen empíricamente para detectar el número máximo de colores en un embrión dado con una intensidad adecuada.
Además de la estabilidad del color, el microscopio confocal es otra limitación, ya que es incapaz de leer la PPCy canales de YFP juntos. Esto es debido al hecho de que se detecta la emisión de CFP en ambos canales 470 nm y 535 nm. Además, el espectro de emisión de CFP (470-535nm) y el espectro de excitación de YFP (530 nm) se solapan, creando una FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) artefacto. En otras palabras, cuando se detecta la fluorescencia PPC, excita la fluorescencia YFP creando así una señal no específica. Por esta razón, este protocolo contornos escaneando todos los canales de fluorescencia fueron por separado y la fusión de las imágenes individuales por separado utilizando un software común de procesamiento de imágenes. Para sortear las limitaciones del microscopio confocal, un microscopio de dos fotones se puede utilizar como se describe en Pan et papel de Al donde todos los tres expresiones de fluorescencia se pueden leer de forma simultánea permitiendo una mayor diversidad de color 8. Pan et al ha descrito un amplio espectro de la diversidad de colores en sus líneas Zebrabow-M (hasta 30 colores). Siguiendo las condiciones descritas en este protocol, diferentes intensidades de fluorescencia y recombinaciones pueden obtenerse como se muestra en la Figura 2, aunque algunas permutaciones de color podrían haberse perdido durante el procesamiento post-formación de imágenes.
Herencia de color y análisis clonal
Pan et al ha descrito la herencia del color de forma estable mantenido en Zebrabow-M de progenitora a la progenie que permite la asignación de destino 8. Este protocolo se centró en células neuronales CNCC para caracterizar la formación de cartílago de Meckel. El uso de CreERT2 en el pez cebra permite eficiente inducida por tamoxifeno recombinación casete loxP y la capacidad de controlar la aparición de etiquetado linaje CNCC durante el desarrollo craneofacial. Este método se puede adaptar fácilmente para visualizar todos los derivados de la cresta neural, además de cartílago de Meckel. Además, el uso de una línea transgénica reportero diferente para el análisis clonal en diversos sistemas de órganos diferentes destacará diferentes modas de crecimiento de las células durante la organogénesis.
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Acknowledgments
Los autores agradecen a Alex Schier para compartir amablemente la línea transgénica Zebrabow-M, Geoffrey Burns, para el vector pDEST y Renee Ethier-Daigle para un excelente cuidado de las instalaciones y líneas de peces.
FINANCIACIÓN:
Estamos muy agradecidos por el generoso apoyo financiero de NIDCR RO3DE024490 y Hospitales Shriners para niños (ECL) y becas de formación post-doctoral de los Hospitales Shriners para Niños (LR y YK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
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