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方法文章

小鼠主动脉内皮细胞的分离与原代培养

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DOI：

10.3791/52965

⸱

2016年12月19日

 ,  , 
1Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, 2Third Xiangya Hospital and the Institute of Vascular Disease and Translational Medicine, Central South University

本文内容

摘要

血管内皮细胞在许多重要的心血管疾病中发挥着关键作用。本文介绍了一种无需使用特殊设备从小鼠主动脉分离和扩增内皮细胞的简单方法。我们的方案为研究内皮细胞生理病理机制提供了一种有效手段。

摘要

血管内皮在维持正常血管稳态中至关重要，其功能障碍参与多种心血管疾病的发生发展。小鼠是心血管疾病研究的重要模型。本研究展示了一种无需特殊设备即可从小鼠胸主动脉中分离和培养内皮细胞的简便方法。分离内皮细胞时，迅速取出小鼠胸主动脉，去除附着的脂肪组织和结缔组织，将主动脉切成1 mm长的环段。每个主动脉环被切开并以内皮面朝下的方式接种于生长因子减少型基质上。将组织段置于内皮细胞生长培养基中培养约4天，内皮出芽最早可在第2天开始出现。随后移除组织块，继续培养细胞直至融合。使用中性蛋白酶消化收集细胞，并在用于实验前再传代培养两次。免疫荧光染色显示，第二次传代后大部分细胞对Dil-ac-LDL摄取、凝集素结合及CD31染色均呈双阳性，具有内皮细胞的典型特征。建议在第二至第三代之间的细胞用于实验研究 体外 和 体内 用于研究内皮生物学的实验。本方案为识别内皮细胞生理病理学中的特定细胞与分子机制提供了有效手段。

引言

血管内皮不仅是一层分隔血液与组织的屏障，更被视为一个遍布整个血管系统的巨大内分泌器官，其表面积可达400平方米1。内皮细胞的健康状态对维持血管稳态至关重要。功能失调的内皮参与多种心血管疾病的发生发展，包括动脉粥样硬化、血管炎以及缺血/再灌注损伤等等2-4。迄今为止，由于内皮在解剖结构上的广泛分布特性，这些疾病状态下所涉及的具体细胞与分子机制仍不十分清楚。

小鼠是重要的研究模型，因为小鼠的基因操作技术比其他任何哺乳动物都更为成熟。然而，分离原代小鼠主动脉内皮细胞被认为特别困难，因为主动脉尺寸较小，使得内皮的酶消化难以实施。一些已报道的分离和纯化内皮细胞（ECs）的方法需要5-7。

本实验方案旨在采用一种简单的方法，无需使用任何特殊设备，从小鼠主动脉中分离并扩增内皮细胞。在本方案中，新鲜分离的主动脉被切成小段，以内皮面朝下的方向接种于基质上，以促进内皮细胞出芽。待组织段移除后，将内皮细胞在有利于内皮细胞生长的培养基中进行扩增，经过两到三代培养后即可用于实验。该方法的优点在于：1）可从单根主动脉获得数量可观的内皮细胞；2）细胞活力保持良好；3）无需特殊设备或技术。该方法为研究内皮细胞病理生理过程中特定的细胞和分子机制提供了一种有效手段。对于希望研究基因敲除小鼠、基因敲入小鼠或小鼠疾病模型来源的原代培养内皮细胞的研究人员而言，本方案非常实用且易于操作。

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方案

1. 小鼠主动脉的分离

本研究所述所有操作程序均经韦恩州立大学机构动物照护与使用委员会批准。

  1. 将小鼠放入麻醉机的诱导室中。设置异氟烷气流浓度为4%，同时混合25%新鲜空气和75% O2。通过诱导室吸入异氟烷（诱导阶段4%，维持阶段约±1.0%），并辅以25%新鲜空气和75% O2进行麻醉，随后使用专用鼻罩继续麻醉。注意： 异氟烷麻醉可采用75%氧气/25%空气或100%氧气作为载气。 
  2. 每5分钟检查一次小鼠，直至达到适当的麻醉深度（脚趾夹捏无回缩反应）。
  3. 将小鼠从诱导室中取出，并通过连接至麻醉机的专用鼻罩继续吸入异氟烷。将异氟烷气流浓度调至1%以维持麻醉状态。
  4. 在麻醉状态下，将小鼠仰卧置于手术垫上，并用实验室胶带固定四肢。
  5. 使用加热灯为小鼠保温。保持加热灯与小鼠之间的适当距离，避免过热。
  6. 用70%乙醇喷洒胸部区域。
  7. 使用解剖剪沿腹中线切开腹部，暴露腹主动脉。打开胸腔，暴露心脏和肺组织。
  8. 用解剖剪在腹主动脉中段剪断，以释放血液。
  9. 用1 mL注射器（配备25 G针头）吸取1 mL含1,000 U/mL肝素的PBS溶液。将含1,000 U/mL肝素的PBS注入左心室，并灌注主动脉。用镊子在大动脉处向小鼠右侧推动心脏和肺组织，以暴露胸主动脉。
  10. 使用显微解剖镊迅速取出胸主动脉，放入冰上预冷的1×PBS（无菌）中，随后将容器转移至超净工作台。
  11. 将配备25 G针头的1 mL注射器插入主动脉一端，用冰上预冷的PBS轻轻冲洗主动脉以去除残留血液。
  12. 使用显微解剖镊尽可能去除附着的脂肪组织和细小侧支血管。
  13. 立即将主动脉转移至内皮细胞生长培养基中。
  14. 使用无菌手术刀片将主动脉切成1 mm长的环状片段。每根主动脉约收获8–10个环状片段。
  15. 使用一对显微解剖剪将每个主动脉环剪开成开放环状结构。

2. 将主动脉节段接种于基质上

  1. 未使用时，将生长因子减量基质置于 -20 °C 保存，以防止凝固。使用前至少提前一夜将生长因子减量基质置于 4 °C 充分解冻。
  2. 将6孔板和移液器吸头预冷至-20 °C，至少放置10分钟。将6孔板置于冰上，向其中一孔加入1 mL基质液，避免产生气泡。将6孔板放入37 °C培养箱中孵育20分钟，使基质凝固。
  3. 使用无菌显微解剖镊将主动脉组织片段植入已固化的基质中。将组织片段腔面朝下放置于基质上，避免接触内皮细胞。在基质上并列放置3至4个主动脉节段。
  4. 加入适量内皮细胞生长培养基以保持组织块湿润（约 200 µL）。
  5. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 孵育4至6小时。当天结束时，加入适量培养基以完全覆盖主动脉节段。
  6. 在相差显微镜下定期观察主动脉节段的出芽情况。每天检查培养基液面高度及细胞生长状态，必要时补充培养基，以确保主动脉节段始终被覆盖。
  7. 第4天th 每天轻轻移除培养基，并使用无菌针头将主动脉节段从基质中取出，注意不要损伤正在生长的内皮细胞。
  8. 加入2 mL新鲜的内皮细胞生长培养基，使内皮细胞在基质上继续增殖2至3天。

3. 小鼠主动脉内皮细胞的初次传代

  1. 用0.1%明胶包被新的T12.5培养瓶，在37 °C孵育30分钟。
  2. 用无菌的37 °C PBS小心清洗基质板。
  3. 向基质板中加入2 mL中性蛋白酶（50 U/mL），在室温下置于摇床上，偶尔振荡孵育。在相差显微镜下观察细胞，确保大部分细胞已脱落。
  4. 加入2 mL D-Val以灭活中性蛋白酶。
  5. 小心将上清液收集至15 mL离心管中。用2 mL D-Val洗涤培养板，并收集上清液。
  6. 将细胞悬液在室温下以900 × g离心5分钟。
  7. 用4 mL内皮细胞生长培养基重悬细胞沉淀，并接种至经明胶包被的T12.5培养瓶中。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。
  8. 更换培养基。继续在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞，直至细胞融合度达到85%–90%。

4. 小鼠主动脉内皮细胞的传代

  1. 用明胶（0.1%）包被两个新的T12.5培养瓶，在37 °C孵育30分钟。将胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶，0.02 EDTA溶于PBS中）和无菌PBS预热至37 °C约15分钟。
  2. 用37 °C的无菌PBS小心洗涤细胞。
  3. 加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶，0.02 EDTA溶于PBS中），在37 °C孵育约1分钟，或直至大部分细胞变圆。
  4. 加入2 mL内皮细胞生长培养基以终止消化反应。在培养瓶内反复吹打细胞悬液数次。如有必要，使用细胞刮刀收集细胞。
  5. 将细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温下以900 × g离心5分钟。
  6. 将细胞沉淀重悬于4 mL内皮细胞生长培养基中，接种至两个经明胶包被的T12.5培养瓶中。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。
  7. 更换培养基。在37 °C、5% CO2条件下继续培养细胞，直至细胞融合度达到85%–90%。
  8. 在传代2–3次后使用小鼠主动脉内皮细胞。

5. 小鼠主动脉内皮细胞的表征

  1. 重新铺板细胞。
    1. 用0.1%明胶包被6孔板，在37 °C孵育30分钟，然后用PBS洗涤孔板。
    2. 将胰蛋白酶-EDTA和无菌PBS预热至37 °C，约15分钟。
    3. 用无菌PBS洗涤细胞3次，加入0.5 mL胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育约1分钟，或直至大多数细胞变圆。
    4. 加入2 mL内皮细胞生长培养基以终止消化反应。在培养瓶中反复吹打细胞悬液数次。如有必要，使用细胞刮收集细胞。
    5. 将细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温下以900 × g离心5分钟。
    6. 弃去上清液，用内皮细胞生长培养基重悬细胞，以3 × 105/孔的密度接种至明胶包被的6孔板中。
    7. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜，使细胞贴附于培养表面。
  2. Dil-ac-LDL摄取及Ulex-凝集素结合实验。
    1. 将1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）储存于-20 °C。染色前将Dil-ac-LDL置于冰上解冻。Dil-ac-LDL储备液浓度为1 mg/mL。将FITC标记的Ulex europaeus凝集素（Ulex-Lectin，1 µg/mL）储存于4 °C。其储备液浓度为1 mg/mL。Hoechst 33342亦储存于4 °C，其储备液浓度为100 µg/mL。
    2. 取10 µL Dil-ac-LDL储备液加入1 mL培养基中，终浓度为10 µg/mL。
    3. 染色前，弃去旧培养基，并用新鲜培养基洗涤各孔细胞。
    4. 弃去新鲜培养基，加入含Dil-ac-LDL的染色培养基。
    5. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
    6. 用无菌1×PBS洗涤细胞3次。
    7. 加入1 mL 10%甲醛固定细胞，室温放置约30分钟。
    8. 用无菌1×PBS洗涤细胞3次，避免光照。
    9. 加入含10 µL Ulex-Lectin的1 mL无菌1×PBS。
    10. 在室温避光条件下孵育1小时。
    11. 用无菌1×PBS洗涤细胞3次，去除Ulex-Lectin。
    12. 加入Hoechst 33342至终浓度1 µg/mL，避光孵育10分钟。
    13. 使用倒置荧光显微镜观察Dil-ac-LDL（红色，激发波长576 nm）、Ulex-Lectin（绿色，激发波长519 nm）和Hoechst（蓝色，激发波长361 nm）的荧光信号。
  3. CD31、VEGFR2、eNOS、VE-钙黏蛋白和钙调蛋白的荧光染色。
    1. 将FITC标记的抗小鼠CD31抗体、eNOS抗体、VE-钙黏蛋白抗体、FITC标记的抗兔IgG抗体避光保存于4 °C；VEGFR2抗体保存于-20 °C。
    2. 用无菌1×PBS洗涤细胞3次。
    3. 加入1 mL 10%甲醛固定细胞，室温放置约30分钟。
    4. 用无菌1×PBS洗涤细胞3次。
    5. 染色CD31时，加入含10 µL CD31-FITC抗体的1 mL无菌1×PBS。染色VEGFR2、eNOS、VE-钙黏蛋白或钙调蛋白时，分别加入含4 μL相应一抗（VEGFR2、eNOS、VE-钙黏蛋白或钙调蛋白）的1 mL无菌1×PBS。
    6. 在冰上避光孵育1小时。
    7. 用无菌PBS洗涤细胞3次，去除未结合抗体。
    8. 对于VEGFR2、eNOS、VE-钙黏蛋白或钙调蛋白染色，加入含10 μL FITC标记的抗兔IgG的1 mL无菌1×PBS，冰上避光孵育1小时，然后用无菌PBS洗涤3次以去除IgG。
    9. 加入Hoechst 33342至终浓度1 µg/mL，避光孵育10分钟。
    10. 使用倒置荧光显微镜观察CD31、VEGFR2、eNOS、VE-钙黏蛋白、钙调蛋白（绿色，激发波长518–535 nm）和Hoechst（蓝色，激发波长361 nm）的荧光信号。

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结果

内皮细胞出芽

从小鼠主动脉节段开始的内皮细胞自发出芽。将小鼠主动脉节段置于生长因子减少的基质上，并在内皮细胞生长培养基中培养4天。内皮细胞出芽通常在2至4天内出现。第4天拍摄显微照片（图1）。如图所示，大量内皮细胞从节段迁移而出。新形成的芽状结构持续从节段及分支处延伸。

内皮细胞表型

这些细胞在初次传代后呈纺锤形和铺路石样形态（图 2A）。贴壁细胞经 Dil-ac-LDL 和 Ulex-Lectin 孵育标记 1 小时。如 图 2B–2E 所示，大多数细胞对 Dil-ac-LDL 摄取（红色）和 Ulex-Lectin 结合（绿色）呈双阳性。同时，在第二次传代后，超过 95% 的细胞对血小板内皮细胞黏附分子 1（CD31、PECAM-1，图 2F

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讨论

本研究展示了一种无需任何特殊设备即可从小鼠主动脉分离和培养内皮细胞的简便方法。免疫荧光染色结果显示，第二次传代后大部分细胞为内皮细胞。建议使用第二次至第三次传代的细胞进行后续实验 体外 和 体内 研究内皮生物学的实验。

本实验方案的关键要点

该实验流程中有五个关键步骤。第一，使用含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗血管腔，以最大限度减少内皮细胞活化和血栓形成。第二，从心脏停搏到将主动脉节段接种至基质之间的时间对内皮细胞的存活能力至关重要。在清除动脉周围脂肪组织和结缔组织时，应避免牵拉主动脉，并将此步骤操作时间控制在10至15分钟内。第三，主动脉节段接种后，仅需加入足量培养基以覆盖组织片段；培养基过多会导致主动脉节段漂浮。第四，培养基中含有高浓度的内皮细胞生长补充物，可显著加快内皮细胞的生长速度，相较于在内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）中培养更为迅速。内皮细胞的外延生长将抑制其他细胞类型（如平滑肌细胞和成纤维细胞）的生长。第五，从基质上移除主动脉节段的时机对...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国心脏协会科学家发展奖13SDG16930098和中国国家自然科学基金青年奖81300240（项目负责人：Wang）资助。我们感谢韦恩州立大学的Roberto Mendez协助准备本稿件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4周或6周龄小鼠杰克逊实验室#000664
无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco#10010-023
含 1,000 U/mL 肝素的无菌 1x PBSSigma AldrichH3149
内皮细胞生长培养基（Dulbecco's’ 改良型伊格尔培养基’s 中等 [DMEM] 含 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032]，补充100 μg/mL 牛神经组织内皮细胞生长补充剂 [ECGS, Sigma, #2759]，10% 胎牛血清 [FBS, Gibco, #10082-147]，1,000 U/mL 肝素 [Sigma Aldrich, H3149]，10,000 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素 [Gibco, #15140-122]
生长因子减少型基质BD 生物科学356231
中性蛋白酶（Dispase，1 U/mL，Fisher Scientific，#CB-40235）和 D-Val 培养基（D-缬氨酸，0.034 克/升，Sigma，#1255），溶于Dulbecco's’ 改良型伊格尔培养基’s 中等葡萄糖浓度培养基，低糖（Gibco，#12320-032）
1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）Life TechnologiesL3484
FITC标记的 欧洲刺槐 凝集素（Ulex-凝集素SigmaL9006
抗小鼠 CD31-FITC 偶联抗体BD 生物科学553372
抗小鼠血管内皮生长因子受体2抗体细胞信号传导9698
抗小鼠内皮型一氧化氮合酶Abcamab5589
抗小鼠血管内皮-钙粘蛋白Abcam33168
抗小鼠钙调素Abcam700
FITC标记的山羊抗兔IgGSigmaF6005
1 mL 注射器，配有 25 号针头Fisher Scientific50-900-04222
100 mm 培养皿Fisher Scientific07-202-516
六孔细胞培养板Fisher Scientific08-772-1B
T12.5 培养瓶Fisher Scientific50-202-076
剪刀、镊子、显微解剖剪、显微解剖镊、刀片Fine Science Tools, Inc.
配备异氟烷的麻醉机Webster Veterinary Supply07-806-3204
加热灯
离心机
倒置相差显微镜
倒置荧光显微镜

参考文献

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