Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Abstract

Nachweis kleiner Konzentrationen von Molekülen bis zur Einzelmolekül Grenze hat Auswirkungen auf Bereiche wie die Früherkennung von Krankheiten und grundlegenden Studien über das Verhalten von Molekülen. Einzelmoleküldetektionsverfahren verwenden üblicherweise Markierungen, wie Fluoreszenzmarkierungen oder Quantenpunkte sind jedoch nicht immer verfügbar Etiketten, erhöhen die Kosten und die Komplexität und kann stören die Ereignisse untersucht. Optischen Resonatoren als ein vielversprechendes Mittel zur Einzelmoleküle ohne Einsatz von Etiketten erfassen taucht. Derzeit kleinste durch eine nicht plasmonically verstärkte blanke optische Resonatorsystem in Lösung nachgewiesen Teilchen ein 25 nm Polystyrolkugel ^1. Wir haben eine Technik, die als Frequenzverriegelung Optical Whispering Evanescent Resonator (Blume), die in wässriger Lösung ² dieses Limit übertreffen können und erreichen markierungsfreie Einzelmoleküldetektion bekannt entwickelt. Als Signalstärke Waage mit Partikelvolumen, unsere Arbeit für eine> 100x improvement im Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) über den aktuellen Stand der Technik. Hier die Verfahren hinter FLOWER werden in dem Bemühen, ihre Nutzung auf dem Gebiet erhöhen vorgestellt.

Introduction

Einzelmoleküldetektion Experimente sind nützlich für die Verringerung der Menge an Analyt in Biosensoren verwendet wird, für die Früherkennung von Krankheiten und zur Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften von Molekülen ^3. Solche Experimente werden normalerweise mit den Etiketten sind jedoch Etiketten nicht immer möglich, für ein bestimmtes Protein zu erhalten, erhöhen die Kosten, können stören die Ereignisse untersucht und kann unbequem sein, insbesondere für die Echtzeit-Vor-Ort-Versuche oder Point-of- Care-Diagnostik.

Der aktuelle Goldstandard für die markierungsfreien Biosensor ist die Oberflächenplasmonresonanz ^4, aber die kommerziellen Oberflächenplasmonresonanz-Systeme haben in der Regel eine typische untere Nachweisgrenze in der Größenordnung von nM. In jüngster Zeit haben optische Resonatoren als vielversprechende Technologie für markierungsfreie Einzelmolekül Biodetektion ⁵ entstanden. Optischen Resonatoren Arbeit auf der Grundlage der langfristigen (ns) Führung von Licht ^6,7. Licht ist evaneszenttypischerweise über eine optische Faser in diese Geräte gekoppelt sind. Wenn die Wellenlänge des Lichts geht durch die Faser entspricht der Resonanzwellenlänge des Resonators, Licht wirksam koppelt an den Resonator. Dieses gekoppelte Licht vollständig intern reflektiert innerhalb des Resonators Hohlraum Erzeugung eines evaneszenten Feldes in der Nähe des Umfangs des Resonators. Als Partikel in das evaneszente Feld und binden an den Resonator, der Resonanzwellenlänge des Resonators ändert sich proportional zu dem Volumen des Teilchens ^8.

In Bezug auf die Erfassungsfähigkeit, haben Mikrokugelresonatoren früher verwendet worden, um einzelne Influenza-A-Virus-Partikel zu erkennen (100 nm) ^9,10. Kurzem plasmonically verstärkte Mikrokugel optischen Resonatoren sind verwendet worden, um einzelne Rinderserumalbuminmoleküle detektieren ^{11 und 8-mer} Oligonukleotiden ^12, aber dieser Ansatz begrenzt die Partikelfangbereich auf 0,3 & mgr; m ² pro deLaster. Größere Capture-Bereich Biosensoren sind ideal für die Maximierung der Wahrscheinlichkeit des Partikeldetektion. Aktuelle lösungsbasierten markierungsfreien Biosensor-Technologien mit großen (> 100 & mgr; m ²⁾ Capture-Bereiche wurden auf die Erfassung Polystyrol-Partikel ≥ 25 nm beschränkt.

Wir haben einen markierungsfreien Biosensor-System auf Basis von optischen Resonator-Technologie als Frequenzverriegelung Optical Whispering Evanescent Resonator (BLUME) ¹³ (Abbildung 1) bekannt, die in der Lage, zeitaufgelöste Detektion von Einzelmolekülen in Lösung entwickelt. FLOWER verwendet die lange Lebensdauer der Photonen Mikrotoroid optischen Resonatoren in Kombination mit Frequenzsperr Regelung, ausgeglichen Erkennung und Rechen Filterung, um kleine Partikel bis hin zu einzelnen Proteinmoleküle zu erkennen. Die Verwendung von Frequenzverriegelung kann das System immer verfolgen die Verschiebung Resonanz des Mikrotoroid als Teilchen zu binden, ohne die Notwendigkeit zu kehren oder Scannen der Laserwellenlänge übergroße Bereiche. Die Grundsätze der FLOWER verwendet werden, um die Erkennungsfähigkeiten von anderen Techniken, einschließlich plasmonischer Steigerung zu erhöhen. Im Folgenden werden die Verfahren für die Durchführung FLOWER beschrieben.

Protocol

1. Versuchsaufbau und die Probenvorbereitung

1. Herzustellen Mikrotoroide Verwendung der Lithographie, Ätzen und Schmelzvorgang, wie ^{zuvor. 6 beschrieben} Herzustellen Mikrotoroide auf einem Silizium-Wafer (Chip), die typischerweise einen Außendurchmesser von 80-100 um und einem kleineren Durchmesser von 2 um.
2. Entspannen etwa einen Meter von single-mode optische Faser (125 um Verkleidungen, 4,3 um Modenfelddurchmesser) von ihrer Faserspule.
3. In der Mitte des abgewickelten Abschnittes der optischen Faser, Streifen ein kleines Segment (2,5 cm) der Polymerbeschichtung auf der optischen Faser mit Abisolierzange. Anmerkung: Dies ist der Teil der optischen Faser, die evaneszent Licht in Mikrotoroid verwendet wird.
4. Reinigen Sie die abisolierten Faser mit Isopropanol Alkohol und einem fusselfreien wischen.
5. Halten Sie diese Abschnitt der Faser an Ort und Stelle mit einem Faserhalter des Haftmagneten gemacht.
6. Thin das abgestreifte Faser bis ~ 500 nm von Melting und das Ziehen unter Verwendung eines Wasserstoffbrenner und zwei Schrittmotoren gegenläufig in 60 & mgr; m / min. Positionieren der optischen Faser im Inneren des oberen Teils der Flamme, die sein sollte ~ 10 mm hoch. Stoppen Ziehen der Faser, wenn die Übertragung durch die Faser stoppt schwankt, das entweder visuell überwacht werden kann (durch die Beobachtung der Licht, das seitlich aus der Faser Aufblinken gestreut wird und aus) oder durch Verbinden der Faser mit einer Fotodiode, die mit einem Oszilloskop verbunden ist .
7. Spalten einem Ende der optischen Faser und fügen diesen in einer nackten Faser-Adapter. Dieses Ende der Faser in den Eingang des Fotoempfängers.
8. Faser Paar das andere Ende der Faserspule zu dem Laser unter Verwendung eines faseroptischen Kopplers.
9. Legen Sie die Mikrotoroid Chip auf einem Probenhalter (Edelstahl, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) unter Verwendung von entweder Epoxy oder doppelseitiges Klebeband.
10. Montieren Sie den Probenhalter auf einem Positionierungstisch, der aus einem 3-Achsen-Nanopositionierung umfasst (nanocube) Bühne (siehe Geräteliste) auf einem 3-Achsen-Mikrometer. Führen Sie alle Experimente an einem pneumatisch getrennt optischen Tisch, um Vibrationen zu minimieren.
11. Grobposition der Probenchip unter Verwendung des 3-Achsen-Mikrometer.
12. Richten Sie die Mikrotoroid haltigen Chips parallel zu der optischen Faser unter Verwendung der Nano-Positionierer. Hinweis: Richten Sie die Mikrotoroid in einem Abstand von einer Wellenlänge des Eingangslichts (~ 633 nm). Zur Visualisierung dieses Prozesses verwenden zwei Bildsäulen (Rohr mit Objektiv und Kamera siehe Ausstattungsliste) auf der Oberseite und auf der Seite des Chips angeordnet.
13. Optimieren Sie die Polarisation des durch die optische Faser unter Verwendung eines in-line-Polarisationssteuerung gerichtete Laserlicht (siehe Geräteliste) mit einem Drehknopf, um die Polarisation einzustellen. Anmerkung: Die optimale Polarisation erreicht wird, wenn die gemessene Tauch bei der Übertragung von der optischen Faser wird der engste. Beachten Sie diese Dip auf einem Oszilloskop (siehe Schritt 2.2 für weitere Einzelheiten).
14. Konstrukteine Probenkammer durch epoxying einem Deckglas über dem Probentisch mit einem Objektträger aus Glas als Abstandshalter. Hinweis: Ein Plexiglas-Gehäuse, die den gesamten Setup kann nützlich zur Minimierung von Luftströmungen zu sein. Eine kleine Öffnung gelassen werden sollten, um die Lösung zu ermöglichen, sich mit der Rohrleitung gepumpt werden.
15. Thermisch äquilibrieren Partikelsuspensionen oder Einzelmolekül wässrigen Lösungen zur ≥ 1 Stunde in einem Wasserbad RT (~ 500 ml). Anmerkung: Die Proben werden auf die gewünschte Konzentration in Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung der vom Hersteller, beispielsweise PBS oder HEPES spezifizierten assoziierten Puffer verdünnt. Wenn keine Bindungsereignisse detektiert werden, erhöht die Salzkonzentration des Puffers.
16. Vortex Partikelhaltigen Lösungen (1 ml) kurzzeitig für ca. 2 Sek.
17. Injizieren Partikel enthaltenden Lösungen in die Probenkammer bei 1 ml / min unter Verwendung einer 1 ml-Spritzenpumpe.
18. Nachdem die Probenkammer gefüllt hat, schalten Sie die Spritzenpumpe.
19. Warten Sie 30 Sekunden vor Aufnahmedaten zu minimierendie Auswirkungen von mechanischen Schwingungen von Flüssigkeitsströmung, die die Messung beeinflussen können, resultieren.

2. Frequenz Locking

1. Erneute Koppeln des Toroids zu der optischen Faser durch Bewegung des Probenhalters mit dem Positionierer, denn die Kupplung aufgrund der Einspritzung des Fluids gestört werden.
2. Lokalisieren die Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid durch Abtasten des rechnergesteuerten Eingangslaser durch eine Vielzahl von Wellenlängen. Dieser Schritt durch Senden einer Dreieckspannung Signal an ein piezoelektrisches Element innerhalb des Lasercontroller, der die Wellenlänge des Lasers regelt. Experimente durchführen unter Verwendung von sichtbarem Licht (635 nm ± 2,5 nm), da es eine geringe Absorption von Licht in Wasser bei dieser Wellenlänge.
3. Messung der Lichtdurchlässigkeit durch die optische Faser durch Einstecken des Ausgangs der optischen Faser in einem Auto-ausgeglichenen Photoempfänger. Stecker des Ausgangssignals des Photoempfängers in ein Oszilloskop mit einem BNC-Kabel. Beachten Sie on das Oszilloskop, das an der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid, Übertragung durch die optische Faser fällt.
4. Befestigen Sie den Ausgang des Photoempfängers auf den Haupteingang des Frequenzverriegelungsrückkopplungsregler (siehe Geräteliste) über ein Kabel.
5. Führen Sie das Frequenzverriegelungsrückkopplungssteuerung im Autolock-Modus mit top-of-Spitzensperr mit einer Zitterfrequenz von 2 kHz und einer Amplitude von Wellenlängenschwingung von 19 fm. Empirisch setzen die Proportional-Integral-Differential-Einstellungen in der Software-Fenster unter Verwendung von Ziegler-Nichols-Regeln ^14. Anmerkung: Diese Werte sind nur einmal zu Beginn aller Experimente eingestellt werden.
6. Auto-Lock, die Wellenlänge des Lasers auf die Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid. Führen Sie diesen Schritt nach dem Füllen der Probenkammer. Hinweis: Wenn die Wellenlängenverschiebung zu groß ist, dann wird die Rückkopplungssteuerung wird Schloss verlieren und automatisch auf Scan-Modus, um die Resonanzwellenlänge Standort lokalisieren zu wechseln. Diese ocKöter für Wellenlängenverschiebungen größer als etwa eine Linienbreite (mindestens 600 fm für alle Systeme hier untersucht).
7. Aufzeichnen des Ausgangs des Rückkopplungsreglers auf 20 kHz unter Verwendung eines 24-Bit-Datenerfassungskarte. Exportieren Sie die Daten als Textdatei über Datenerfassungssoftware.

3. Datenverarbeitung und Analyse-

1. Fourier-Transformation der Daten in MATLAB.
2. Low übergeben Sie die Daten mit Hilfe eines "Backsteinmauer" Filter mit einer Grenz bei 1 kHz, um die auferlegten Zitterfrequenz von 2 kHz zu entfernen (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 1).
3. Rechnerisch Notch-Filter, die Daten mit Hilfe einer Fenstergröße von 16 Hz. Hinweis: Dies geschieht, um bekannten Quellen von Rauschen zu entfernen, in diesem Fall, elektronische Leitungsrauschen 60 Hz und deren Oberwellen, sowie 100 Hz (aus dem Lasertreiber) und ihre Oberschwingungen (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 1).
4. Inverse Fourier-Transformation die Daten zurück in den Zeitbereich.
5. Medianfilter die Daten unter Verwendung eines FenstersGröße von 1.001 Proben (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 2).
6. Finde Schritt Veränderungen in der Resonanzwellenlänge mit der Schritt-Suchalgorithmus von Kerssemakers et al. ^15.
7. Erzeugen Histogramme der Amplitude von jedem Bindungsschritt.
8. Berechnen Partikelgröße unter Verwendung von Gl. (1) (siehe Diskussion).

Representative Results

Partikelbindungsereignisse eindeutig als stufenartigen Änderungen in der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid über die Zeit (2A) ersichtlich. Die Höhen dieser Schritte sind als Histogramm in Figur 2B gezeigt. Die Abbildungen 2-4 zeigen repräsentative Spuren aus der Bindung von Exosomen (nanovesicles), 5 nm Silikonkügelchen, einzelne menschliche Interleukin-2-Moleküle sind. Die Tatsache, dass die stufenartigen Ereignissen Skala mit Teilchengröße zeigt, daß das Verfahren korrekt durchgeführt wurde. Dies kann durch Erzeugen eines Histogramms von Stufenhöhen (2B) und das Vergleichen der theoretischen Voraussagen beobachtete maximale Stufenhöhe analysiert werden, wie unten diskutiert.

Abbildung 1. Blockschaltbild des toroid-Sensing-System. Das Licht von einem abstimmbaren Diodenlaser ist gespalten w ith eines Teils durch die optische Faser, die Paare in dem Toroid und der andere Teil direkt in einen Eingang eines selbst ausgeglichenen Photoempfänger gesendet Licht gesendet. Der Ausgang der optischen Faser wird in den zweiten Eingang des Auto ausgewogen Photoempfänger gesendet. Der Ausgang des Photoempfängers wird mit dem Rückkopplungsregler, der das Laserlicht auf den Wert der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid lokalisieren moduliert gesendet. Als Teilchen zu binden, um den Ringkern, die Resonanzfrequenz verschiebt. Der Unterschied zwischen der Wellenlänge des Lasers und der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid wird einem Proportional-Integral-Differential-Regler, der den Laser auf die Wellenlänge des Toroids schnellst übereinstimmen und möglichst reibungslos ermöglicht gesendet. Hier klicken a zu vergrößern Version dieser Figur.

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Abbildung 2. Resonanzwellenlängenänderung über die Zeit, wie 20 nm Kügelchen auf die Oberfläche des Mikrotoroid binden. (A) Verschiebung der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid Laufe der Zeit als 20 nm Kügelchen binden an die Oberfläche. (B) Histogramm der Höhen (Amplituden) der einzelnen Resonanzwellenlänge Schritt Veranstaltung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Resonanzwellenlängenänderung über die Zeit als Einzel Exosomen zur Oberfläche des Mikrotoroid binden. Einzelne Bindungsereignisse als diskrete Veränderungen (Schritte) in der Resonanzwellenlänge über die Zeit gesehen."> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4 Resonanzwellenlängenänderung über die Zeit als 5 nm Siliciumdioxidperlen binden an die Oberfläche des Mikrotoroid. Partikel an den Mikrotoroids Oberfläche haften über passive Adsorption. Partikelbindungsereignisse als diskrete Schritte in der Resonanzwellenlänge des Torus über die Zeit gesehen. Desorption eines Teilchens wird als ein Schritt nach unten zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5. Resonanzwellenlänge der Zeit ändern, wie IL-2-Moleküle binden an die Oberfläche des Mikrotoroid. Makromolekulare Bindungsereignisseals diskrete Schritte in der Resonanzwellenlänge über die Zeit gesehen. Diese Schritte ähneln denen in 4 als die beiden Arten von Teilchen von etwa gleicher Größe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Als ein Teilchen gebunden ist, die Resonanzwellenlänge (λ) der Toroid zunimmt. Wenn ein Teilchen tatsächlich freigegeben wird, die Resonanzwellenlänge nimmt entsprechend ab (ein Untersetzungsereignis). Der Partikeldurchmesser (d) kann durch Histogramme der Amplitude jeder Wellenlänge Schritt bestimmt werden. Die Höhe jeder Wellenlänge Schritt variiert je nach Größenvariationen des gebundenen Teilchen und durch die Lage auf der Mikrotoroid wo das Teilchen bindet. Die maximale Änderung der Resonanzwellenlänge (Stufenhöhe) tritt auf, wenn Teilchen an den Äquator des Mikrotoroid wo das elektrische Feld (E _{0, max)} maximal zu binden. Diese maximale Stufenhöhe (Δλ) ist im Zusammenhang mit Partikeldurchmesser durch Gl. ⁽¹⁾ 8, wobei a der Partikelradius ist, D eine Dielektrizitätskonstante basierend auf dem Brechungsindex des gebundenen Teilchen und ihrer umgebenden Medien ist, V _m die Modenvolumen light im Mikrotoroid durch Finite-Elemente-Simulationen ² bestimmt, und _E 0 (r _s) die Amplitude des elektrischen Feldes an der Partikel Äquator auch durch Finite-Elemente-Simulationen ermittelt:

Umkehren Gl. (1) zeigt, dass die Signalstärke (Δλ) skaliert mit Partikelvolumen ^(a 3). Unsere dielektrischen Verlustfaktor ist definiert als:

wo der Brechungsindex des umgebenden Mediums, und der Index Brechung des Teilchens. Theoretische Abschätzungen für die Partikelgröße auf der Grundlage der Gleichung (1) sowie zusätzliche Histogramme und Größe calnungen sind in ^{2 dargestellt, 16.}

BLUMEN kann für schnellere Verfolgung durch Erhöhen der Frequenz, bei der die Frequenzverriegelungsrückkopplungsregler bildet die Wellenlänge des Mikrotoroid modifiziert werden. Das Datenverarbeitungsverfahren kann unter Verwendung eines gleitenden Mittelwerts anstelle eines Medianfilters verändert wird, und Bindungsereignisse immer noch wiedergewonnen werden, jedoch ist die Medianfilter bewirkt Schritt Kanten besser konserviert. Einschränkungen dieser Technik gehört die Tatsache, die Wellenlängenverschiebung des Mikrotoroid auf Partikelbindung hängt davon ab, wo auf dem Resonator der Partikel landet. Somit Bestätigung der Bindung eines einzelnen Teilchens beruht auf der Erzeugung eines Histogramms der vielen diskreten Bindungsereignisse. Wenn keine spezifische Bindungsereignisse detektiert werden, die Erhöhung der Salzkonzentration des Lösungsmittels beiträgt.

Die Bedeutung dieser Technik im Hinblick auf die bestehenden Verfahren ist, dass keine Etiketten sind erforderlich, um das Zielmolekül zu befragen.Selektive Bindung erfordert jedoch Funktionalisieren des Sensors mit Antikörpern. Andere Vorteile schließen die Tatsache ein, daß, da Mikrotoroid Resonatoren gegenüber hohen Empfindlichkeit Oberflächenplasmonresonanzverfahren größere Erfassungsbereiche sind eher auftreten Partikelbindungsereignisse. Darüber hinaus, weil FLOWER nicht fluoreszierenden Tags, die photobleach kann verlangen, ist Blume in der Lage ist lang (> 10 sec) Messungen mit schnellen (ms) Zeitauflösung.

Wichtige Schritte im Protokoll enthalten Ausrichten der optischen Fasertaper mit dem Mikrotoroid. Einmal ist die Ringspule in flüssiger, zuviel Bewegung der Faser durch die Flüssigkeit eingetaucht kann bewirken, dass die Verjüngung zu brechen, wodurch die Beendigung des Experiments. FLOWER in seiner derzeitigen Formulierung ist daher für Experimente auf der Zeitskala von Stunden ungeeignet. Darüber hinaus, wenn die Mikrotoroid hat in Flüssigkeit eingetaucht ist und die Partikel zu binden, unwiederbringlich sinkt der Qualitätsfaktor (Q) über eine Zeitskala von Stunden und Peak locking kann schließlich instabil werden. In dieser Situation wird eine neue Vorrichtung benötigt wird. Weil wir zittern unsere Laserfrequenz in einem sehr kleinen Bereich um die Resonanzspitze, FLOWER nicht gleichzeitig über die gesamte Resonanzspektrum Lesen und daher keine Änderungen in Qualitätsfaktor in Echtzeit zu messen, als Partikel zu binden. Mit Blick auf den Qualitätsfaktor vor und nach der Bindung von nur ein paar Partikel, sehen wir nicht signifikante Q-Faktor Abbau. Wir erwarten, dass dies, weil die ursprünglichen unberührten Toroide haben relativ niedrige Q-Faktor (Q geladen in Wasser von ca. 1x10 ⁵ -5x10 ^6).

Wir nehmen zur Kenntnis, dass die laserinduzierte Fluktuation Lärm wird unter Verwendung des Auto-ausgewogen Photoempfänger abgezogen. Wir minimieren Schwankungen der optischen Faser gegen den Ringkern, indem die Faser in direktem Kontakt die Mikrotoroid. Außerdem, wenn PID-Parameter nicht richtig eingestellt sind, Schwankungen auftreten, das heißt, das System nicht schnell und korrektely Spurwellenlängenverschiebungen. Ziegler-Nichols-Regeln verwendet werden, um richtig eingestellt die PID-Einstellungen ¹⁴ werden. Indem Sie die hier beschriebenen Verfahren, sollte es möglich sein, zu erkennen und Größe Nanopartikel im Bereich von mehreren hundert Nanometern bis zu wenigen Nanometern, einschließlich Einzel biologischen Molekülen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tunable diode laser	Newport	TLB-6300
Laser controller	Newport	TLB-6300-LN
Frequency locking feedback controller	Toptica Photonics	Digilock 110
Auto-balanced photoreceiver	Newport	Model 2007
In-line polarization controller	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bit data acquisition card	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm polystyrene beads	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Optical table	Newport	VH3660W-OPT
Objective lens for imaging column	Navitar Machine Vision	1-60228
Imaging column (adaptor tube)	Navitar Machine Vision	1-60228
High-Res CCD camera for imaging column	Edmund Industrial Optics	NT39244