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Neuroscience

प्रांतस्था, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, पार्श्व सेप्टल Nucleus- और स्ट्रिएटम-विशिष्ट Published: January 18, 2016 doi: 10.3791/53303
Automatic Translation
1, 1
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

Introduction

तीन स्वतंत्र समूहों 1-3 से 2001 में पहली वर्णन के बाद से मैं n utero electroporation कृंतक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मानक उपकरण बन गया है। लगातार सुधार तकनीक, अभी भी समय और पैसे की वजह से अपनी सादगी के लिए, गर्भाशय में इलेक्ट्रोपोरेशन अपील की खपत के बावजूद है, जो पीटा चूहों की पीढ़ी की तुलना में। तो, गर्भाशय में electroporation के तेज और कुशल gain- और नुकसान के समारोह के अध्ययन के 4 सक्षम बनाता है।

मस्तिष्क क्षेत्रों transfect करने के लिए, नकारात्मक आरोप लगाया प्लाज्मिड युक्त समाधान के लिए एक वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया जाता है। बिजली नाड़ी के दौरान, नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए सकारात्मक ध्रुव की ओर migrates और इसलिए ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र सकारात्मक पोल की स्थिति बदलकर बस का चयन किया जा सकता है। यह बार बार केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई क्षेत्रों टा हो सकता है कि दिखाया गया है3,5-8 rgeted। उदाहरण के लिए, हाल ही के अध्ययन हिप्पोकैम्पस, piriform प्रांतस्था या स्ट्रिएटम 9-11 के विशिष्ट transfections दिखा। हालांकि, उचित पदों के बारे में जानकारी अक्सर ही शायद ही मानकीकृत कर रहे हैं और हमेशा अलग माउस उपभेदों के लिए स्थानांतरण करने के लिए आसान नहीं हैं।

कुछ भ्रूण चरणों के अभिकर्मक तुच्छ से दूर है। Utero electroporation में विशिष्ट के लिए सेट-अप का चयन करते समय बहुत से प्रभावित करने वाले कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, बेहतर संबंधित भ्रूण चरणों transfect करने के लिए, उचित voltages के बारे में ज्ञान की जरूरत है। कम वोल्टेज अभिकर्मक दक्षता 2,3,12 को कम जबकि उच्च वोल्टेज, जीवित रहने की दर में कमी। इसके अलावा इलेक्ट्रोड चप्पू के आकार, एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता कम हो विशिष्टता में बहुत बड़ी परिणाम हैं या कारण दिल ताल 4,12,13 के स्नेह के लिए मौत का कारण बन सकता है कि इलेक्ट्रोड paddles का उपयोग करते हैं। लागू कियावोल्टेज और आकार और इलेक्ट्रोड चप्पू की स्थिति पर विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं, लेकिन डीएनए समाधान के एप्लाइड राशि की तरह, इलेक्ट्रोपोरेशन के परिणाम को प्रभावित करने के लिए आगे कारकों को भी देखते हैं।

हम C57BL 6 / माउस 12 के विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के तेज और कुशल अभिकर्मक सक्षम बनाता है जो एक विस्तृत प्रोटोकॉल विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल में voltages के बारे में विस्तृत जानकारी का उपयोग किया जा करने के लिए और बढ़ाया विशिष्टता के लिए इलेक्ट्रोड चप्पू के आकार प्रदान की जाती है। इसके अलावा, निलय के बारे में जानकारी प्लाज्मिड समाधान की राशि और इलेक्ट्रोड के पद के लिए सिफारिशें की आपूर्ति की है के साथ भरा जाना है। एक नक्शा और इन पदों के आगे दृश्य में विस्तृत स्थिति की जानकारी के संकेत retrosplenial कॉर्टेक्स, मोटर कॉर्टेक्स, somatosensory प्रांतस्था, piriform प्रांतस्था, टी के utero electroporation में सीधा विशिष्ट और कुशल सक्षम बनाता हैवह एम्मोनिस 1-3, दांतेदार गाइरस, स्ट्रिएटम, पार्श्व सेप्टल नाभिक, चेतक और हाइपोथेलेमस Cornu।

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Protocol

आचार कथन: चूहों और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की हैंडलिंग जानवरों की देखभाल के लिए, यूरोपीय राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित की गई।

1. में utero electroporation

नोट: पहले 12,14 प्रकाशित utero electroporation में प्रदर्शन किया गया था। इसलिए, विधि निम्न (चित्रा 1) में संक्षेप में वर्णन किया ही जाता है।

  1. तैयारी
    1. पहले से 12 के रूप में वर्णित (1,5 pCAGGS युक्त) फास्ट ग्रीन रंग का endotoxin मुक्त उन्नत अभिकर्मक ग्रेड प्लाज्मिड समाधान तैयार है।
    2. इंजेक्शन के लिए (35 डिग्री कोण) borosilicate ग्लास केशिकाओं (0.8-0.9 व्यास) खींचो और पीस।
    3. उपकरणों जीवाणुरहित।
  2. शल्य-चिकित्सा
    1. सर्जरी शुरू करने से पहले दर्दनाशक दवाओं (carprofen, 4 मिलीग्राम / किग्रा वजन, अनुसूचित जाति, 24 घंटा डिपो) में कम से कम 30 मिनट के प्रशासन।
    2. की लंबाई रखें(- शल्य संज्ञाहरण के मंच guedel 15 के अनुसार - स्टेज III अधिक से अधिक 25-30 मिनट) 35-45 मिनट की एक अधिकतम करने के लिए संज्ञाहरण।
    3. (: मुखौटा के माध्यम से 2.8%, सर्जरी: 2.5% प्रेरण एक कक्ष में) isoflurane के साथ समय पर गर्भवती चूहों anesthetize। पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए unresponsiveness द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
    4. संज्ञाहरण के दौरान आंख सूखापन को रोकने के लिए आंख मरहम लागू करें।
    5. 7.5% Providone-आयोडीन के घोल के साथ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र जीवाणुरहित और उजागर केवल शल्य चिकित्सा के क्षेत्र के साथ (0.9% बेंजाइल अल्कोहल खारा समाधान के साथ नम) बाँझ धुंध के साथ माउस को कवर किया।
    6. (: 1.5-2 सेमी, मांसपेशियों में चीरा: 1-1.5 सेमी त्वचा चीरा) एक छुरी के साथ पेट की गुहा खोलने के कट।
    7. पशु चिकित्सा कर्मचारी या समिति द्वारा निर्देशित के रूप में गरम 0.9% बेंजाइल अल्कोहल खारा समाधान या अन्य बाँझ isotonic समाधान के साथ moistening से बाहर सुखाने से खोला उदर गुहा को बचाना।
    8. ध्यान से उंगली से गर्भाशय नहीं टिकते, अंगूठी संदंश का उपयोग गर्भाशय सींग (उद्धरणएस)।
  3. डीएनए और electroporation इंजेक्शन। नोट: विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए सटीक विवरण धारा 2 में संकेत कर रहे हैं।
    1. तैयार borosilicate केशिकाओं के माध्यम से चित्रा 1 और धारा 2 में संकेत के रूप में धीरे धीरे वेंट्रिकल में रंगीन डीएनए समाधान इंजेक्षन।
    2. इसी भ्रूण चरण के लिए उचित वोल्टेज लागू (जैसे। E14 के लिए, 36-38 वी) विशेष संदंश प्रकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड (अंतराल चक्र लंबाई 50 मिसे, अंतराल ठहराव 950 मिसे) के माध्यम से। गर्भाशय की दीवार के नुकसान को कम करने के लिए वोल्टेज के आवेदन के दौरान इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल नाड़ी।
  4. पोस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन / पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल
    1. ध्यान से उदर गुहा में गर्भाशय सींग की जगह।
    2. मांसपेशियों और अलग से त्वचा चीरा सीवन।
    3. वसूली के लिए एक थर्मल समर्थन डिवाइस पर माउस आराम करते हैं।
    4. वसूली के दौरान माउस (व्यवहार, चारा पर्यवेक्षण औरपानी की खपत), 4 घंटा, 24 घंटा और सर्जरी के बाद 48 घंटे के। यदि आवश्यक हो, आगे 2 दिनों के लिए अतिरिक्त दर्दनाशक दवाओं (carprofen, 4 मिलीग्राम / किग्रा वजन, 24 घंटा डिपो) लागू होते हैं।

विशिष्ट सेरेब्रल क्षेत्रों 2. अभिकर्मक

नोट: सकारात्मक पोल की स्थिति डीएनए समाधान (सही या तीसरे निलय) और सकारात्मक पोल की स्थिति के साथ भरा वेंट्रिकल के माध्यम से खड़ी centerline के बीच के कोण के रूप में दिखाया गया है। बाएं वेंट्रिकल भरते समय पदों दर्पण उल्टे कर रहे हैं। चित्रा 4 में कान मौलिक के पदों पर महत्वपूर्ण संदर्भ अंक प्रदान है, जो दिखाए जाते हैं।

  1. Cortical क्षेत्रों के अभिकर्मक (2A चित्रा, 1 टेबल)।
    1. धारा 1.2 में वर्णित के रूप में सर्जरी प्रदर्शन। Cortical क्षेत्रों में utero electroporation के लिए E14 भ्रूण का उपयोग करें।
    2. सही पार्श्व वेंट्रिकल में 4 ग्राम डीएनए युक्त डीएनए समाधान μl 1.5-2 इंजेक्षनतैयार borosilicate केशिकाओं के माध्यम से।
      1. ध्यान से पंचर साइट से ऊपर नहीं दिखाई वाहिकाओं देखते हैं कि इतने अंगूठी संदंश का उपयोग करके भ्रूण की स्थिति।
      2. धीरे धीरे lambdoidal सिवनी से लगभग 0.75 मिमी राज्याभिषेक और बाण सिवनी (चित्रा 3) से 0.5 मिमी पार्श्व डीएनए समाधान इंजेक्षन। प्रविष्टि गहराई 1.2 मिमी (गर्भाशय की दीवार से मापा E14,) है कि सुनिश्चित करें। एक तेज सीमांकन के साथ एक नीले-हरे रंग के लिए जाँच करें।
    3. विशेष संदंश प्रकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से वोल्टेज (अंतराल चक्र लंबाई 50 मिसे, अंतराल ठहराव 950 मिसे) को लागू करें।
      1. एक 3 या 5 मिमी इलेक्ट्रोड चप्पू का उपयोग करें।
      2. 36-38 वी से लेकर एक वोल्टेज का उपयोग
      3. इलेक्ट्रोड कान primordia की बस पूर्वकाल के केंद्र में रखें।
      4. मोटर कोर्टेक्स 0-40 ° transfect करने transfect करने के लिए, somatosensory प्रांतस्था 40-95 ° transfect करने के लिए, 330-0 ° से retrosplenial कोर्टेक्स उपयोग कोण transfect करने के लिएpiriform प्रांतस्था 95-110 ° (2A चित्रा)।
    4. धारा 1.4 में वर्णित के रूप में पद इलेक्ट्रोपोरेशन / पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल प्रदर्शन करते हैं। चूहों बलिदान और धारा 3 में वर्णित के रूप में electroporation (E18) के बाद भ्रूण को 4 दिन का विश्लेषण।
  2. हिप्पोकैम्पस (चित्रा 2 बी, 1 टेबल) के अभिकर्मक।
    1. धारा 1.2 में वर्णित के रूप में सर्जरी प्रदर्शन। हिप्पोकैम्पस गठन के गर्भाशय में electroporation के लिए E15 भ्रूण का उपयोग करें।
    2. तैयार borosilicate केशिकाओं के माध्यम से सही पार्श्व वेंट्रिकल में 4 ग्राम डीएनए युक्त डीएनए समाधान μl 2 इंजेक्षन।
    3. विशेष संदंश प्रकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से वोल्टेज (अंतराल चक्र लंबाई 50 मिसे, अंतराल ठहराव 950 मिसे) को लागू करें।
      1. एक 3 या 5 मिमी इलेक्ट्रोड चप्पू का उपयोग करें।
      2. 38-40 लेकर एक वोल्टेज का प्रयोग करें।
      3. नकारात्मक पोल कान उत्स का सिर्फ पूर्वकाल के केंद्र और केंद्र ओ रखेंकान उत्स के बीच में सकारात्मक पोल च।
      4. दांतेदार गाइरस सीए 1 250-275 ° (चित्रा 2 बी) transfect करने के लिए, सीए 2 230-250 ° transfect करने के लिए, कोर्नु एम्मोनिस (सीए) 3 210-230 ° transfect करने के लिए, 190-210 डिग्री से कोणों का उपयोग transfect करने के लिए।
    4. धारा 1.4 में वर्णित के रूप में पद इलेक्ट्रोपोरेशन / पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल प्रदर्शन करते हैं। धारा 3 में वर्णित के रूप में (जन्म, P21 के बाद) पूरा हिप्पोकैम्पस गठन के बाद विश्लेषण करते हैं।
  3. पार्श्व सेप्टल नाभिक और स्ट्रिएटम के अभिकर्मक (चित्रा -2 सी, 1 टेबल)
    नोट: कोणों हिप्पोकैम्पस transfecting के लिए उन लोगों के साथ ओवरलैप। प्रभावी रूप से पार्श्व सेप्टल नाभिक और अवांछित हिप्पोकैम्पस अभिकर्मक पहले भ्रूण चरणों (E12) के बिना स्ट्रिएटम transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है।
    1. धारा 1.2 में वर्णित के रूप में सर्जरी प्रदर्शन। पार्श्व सेप्टल नाभिक और striat की में utero electroporation के लिएउम E12 भ्रूण का उपयोग करें।
    2. तैयार borosilicate केशिकाओं के माध्यम से सही पार्श्व वेंट्रिकल में 4 ग्राम डीएनए युक्त डीएनए समाधान μl 1 इंजेक्षन।
    3. विशेष संदंश प्रकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से वोल्टेज (अंतराल चक्र लंबाई 50 मिसे, अंतराल ठहराव 950 मिसे) को लागू करें।
      1. एक 0.5 मिमी इलेक्ट्रोड का प्रयोग करें।
      2. 33 वी का उपयोग करें
      3. कान primordia के स्तर पर इलेक्ट्रोड के केंद्र में रखें।
      4. स्ट्रिएटम 170-240 ° (चित्रा -2) transfect करने के लिए, 100-170 डिग्री से पार्श्व सेप्टल नाभिक उपयोग कोण transfect करने के लिए।
    4. धारा 1.4 में वर्णित के रूप में पद इलेक्ट्रोपोरेशन / पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल प्रदर्शन करते हैं। चूहों बलिदान और धारा 3 में वर्णित के रूप में electroporation (E18) के बाद भ्रूण को 6 दिन का विश्लेषण।
  4. चेतक और हाइपोथेलेमस के अभिकर्मक (चित्रा 2 डी, 1 टेबल)
    1. धारा 1.2 में वर्णित के रूप में सर्जरी प्रदर्शन। यू में लिएचेतक और हाइपोथेलेमस उपयोग E12-E13 भ्रूण के टेरो इलेक्ट्रोपोरेशन।
    2. तैयार borosilicate केशिकाओं के माध्यम से पार्श्व वेंट्रिकल (बाएं या दाएं) में 4 ग्राम डीएनए युक्त 1-1.5 μl डीएनए समाधान इंजेक्षन। समाधान तीसरे वेंट्रिकल में दूर तक फैला हुआ है, जब तक 2-3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। वैकल्पिक रूप से सीधे तीसरे निलय में इंजेक्षन।
      नोट: इस विशिष्टता को बढ़ाता है, लेकिन एक कम जीवित रहने की दर (क्षति के उच्च जोखिम) का कारण बन सकता है।
    3. विशेष संदंश प्रकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से वोल्टेज (अंतराल चक्र लंबाई 50 मिसे, अंतराल ठहराव 950 मिसे) को लागू करें।
      1. एक 0.5 या 3 मिमी इलेक्ट्रोड का प्रयोग करें।
      2. 33-35 वी से लेकर एक वोल्टेज का उपयोग
      3. सिर्फ कान primordia पीछे इलेक्ट्रोड के केंद्र में रखें।
      4. हाइपोथेलेमस 90-180 ° (चित्रा 2 डी) transfect करने के लिए, 25-40 डिग्री से चेतक उपयोग कोण transfect करने के लिए।
    4. देस के रूप में पद इलेक्ट्रोपोरेशन / पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल प्रदर्शन करनाधारा 1.4 में cribed। चूहों बलिदान और धारा 3 में वर्णित के रूप में electroporation (E18) के बाद भ्रूण को 6 दिन का विश्लेषण।

3. छिड़काव फिक्सेशन

  1. तैयारी
    1. गर्म 4% paraformaldehyde (पीएफए) 37 डिग्री सेल्सियस तक।
    2. पीबीएस के साथ एक 50 मिलीलीटर सिरिंज (4 डिग्री सेल्सियस) और गरम पीएफए ​​के साथ एक दूसरे सिरिंज भरें। बुलबुले से बचें।
    3. एक तीन तरह पानी निकलने की टोंटी को सीरिंज कनेक्ट करें। एक पंख संचार सेट (तितली) के तीसरे अंत कनेक्ट।
    4. पीबीएस के साथ पंखों वाला संचार सेट फ्लश।
  2. छिड़काव
    1. गहराई से चमड़े के नीचे ketamine हाइड्रोक्लोराइड के आवेदन (60 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (7.5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ (गर्भवती या प्रसव के बाद ट्रांसफ़ेक्ट) चूहों anesthetize।
    2. पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए unresponsiveness द्वारा शल्य सहिष्णुता चरण की पुष्टि करें।
    3. सिर्फ रिब पिंजरे के नीचे उदर गुहा खोलें।
    4. ध्यान से डायाफ्राम काटा।
    5. ध्यान से ई पर एक कटौती के माध्यम से रिब पिंजरे खोलनेहंसली अप करने के लिए ACH साइट।
    6. (दिल के शीर्ष से शुरू) बाएँ दिल के चेंबर में तितली की नोक डालें।
    7. छोड़ दिया आलिंद उपांग कट।
    8. धीरे धीरे पीबीएस (लगभग 10 एमएल) के साथ माउस छिड़कना।
    9. तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी स्विच।
    10. 5-10 मिलीलीटर 4% पीएफए ​​के साथ माउस छिड़कना।
    11. कैंची का उपयोग माउस सिर काटना और रंध्र मैग्नम में शुरुआत मस्तिष्क काटना। पहले से 16 के रूप में प्रकाशित विच्छेदन प्रदर्शन।
    12. 4% पीएफए ​​में 2 दिनों के लिए मस्तिष्क Postfixate। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर दिमाग रखें।

4. Immunohistochemistry

  1. (एक vibratome साथ जैसे,) 70 माइक्रोन वर्गों उत्पन्न करता है।
  2. वैकल्पिक: एंटीबॉडी धुंधला के साथ प्रतिदीप्ति बढ़ाएँ।
    1. आरटी पर 1 घंटे के लिए वर्गों ब्लॉक (0.1-0.2% ट्राइटन X-100, 5% सामान्य बकरी सीरम)
    2. उचित एंटीबॉडी (: 1,000 विरोधी GFP, 1) के साथ हे / एन सेते
    3. धो 30.1 एम फॉस्फेट बफर के साथ -5 बार।
    4. उचित प्रतिदीप्ति संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (: 1,000 एलेक्सा स्त्राव 488 संयुग्मित विरोधी खरगोश आईजीजी, 1) के साथ 3-5 घंटे सेते हैं।
    5. वैकल्पिक: 1 मिनट के लिए (0.1 एम फॉस्फेट बफर में DAPI, 0.2 ग्राम / एमएल) 4-6-diaminodino-2-phenylindole साथ Counterstain।
    6. एक उपयुक्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करें।

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Representative Results

चित्रा 2, retrosplenial कोर्टेक्स में विकासशील क्षेत्रों की utero electroporation में विशिष्ट के लिए उदाहरण से पता चलता है, मोटर कॉर्टेक्स, somatosensory प्रांतस्था, piriform प्रांतस्था, Cornu 1-3 एम्मोनिस, दांतेदार गाइरस, स्ट्रिएटम, पार्श्व सेप्टल नाभिक , चेतक और हाइपोथेलेमस। transfections के परिणामों की सिफारिश कोण (चित्रा 2) के बगल में दिखाए जाते हैं। विवो में कोणों से बेहतर दृश्य के लिए इलेक्ट्रोड (0.5 मिमी) की स्थिति भी (एमनियोटिक थैली में चित्रा 5, गर्भाशय में भ्रूण, भ्रूण, विच्छेदित भ्रूण) एक भ्रूण पर दिखाए जाते हैं। प्रदान करने के लिए एक सिंहावलोकन तालिका 1 विशिष्ट अभिकर्मक के लिए प्रासंगिक तथ्यों संक्षेप।

इसके अलावा, यह इलेक्ट्रोड के आकार विशिष्टता (चित्रा 6) के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि प्रदर्शन किया गया। इलेक्ट्रोड paddles के बड़े आकार ला करने के लिए सुरागअनुकरणीय 6 चित्र में दिखाया गया है rger, क्षेत्रों ट्रांसफ़ेक्ट। इसके अलावा, भ्रूण की बहुत बहुत बड़े कवर कर रहे हैं कि इलेक्ट्रोड, जिससे भ्रूण दिल ताल (चित्रा 7) को प्रभावित करने का जोखिम बढ़ाने। उदाहरण के लिए एक 10 मिमी इलेक्ट्रोड चप्पू पूरे E12 भ्रूण (चित्रा 7) को शामिल किया गया।

आकृति 1
Utero electroporation में चित्रा 1। में utero electroporation के प्रदर्शन के बुनियादी कदम दिखाए जाते हैं। एक hotplate पर रखा माउस पहले से ही isoflurane साथ anesthetized साथ (ए), सर्जरी के पूरे सेटअप पता चलता है। (बी) के शल्य चिकित्सा क्षेत्र की कीटाणुशोधन माउस के उदर गुहा (सी) खोलने से पहले एक महत्वपूर्ण कदम है। (डी) डीएनए युक्त समाधान तेजी जी के साथ रंग का हैसफल इंजेक्शन के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है जो रीन, (ई, एफ)। एक पार्श्व वेंट्रिकल में सफल इंजेक्शन चंद्राकार हाजिर में यह परिणाम है। उचित वोल्टेज संदंश प्रकार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू किया जाता है इंजेक्शन के बाद (जी)। (एच) को ध्यान से शल्य घाव सिलाई की जाती है उदर गुहा में गर्भाशय की जगह के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Murine प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस, पार्श्व सेप्टल नाभिक, स्ट्रिएटम, चेतक में विशिष्ट क्षेत्रों की electroporation और हाइपोथेलेमस के लिए चित्रा 2. कोण-नक्शा। सकारात्मक और नकारात्मक पोल के लिए उपयुक्त पदों, योजनाबद्ध ड्राइंग में संकेत कर रहे हैं। (एसी के लिए एनजी>) के पदों पर सही वेंट्रिकल में डीएनए समाधान इंजेक्शन लगाने के लिए संकेत कर रहे हैं। बाएं वेंट्रिकल में इंजेक्शन के लिए, कोण दर्पण उल्टे कर रहे हैं। विशिष्ट transfections histologically सत्यापित किया गया। (ए) cortical क्षेत्रों transfecting के लिए सकारात्मक और नकारात्मक पोल की स्थिति को दर्शाता (retrosplenial कोर्टेक्स (आरएससी), मोटर प्रांतस्था (एमसी), somatosensory प्रांतस्था (एसएससी) और piriform प्रांतस्था (पीसी)। (बी) से पता चलता है हिप्पोकैम्पस संरचनाओं transfecting के लिए सकारात्मक और नकारात्मक पोल के पदों (Cornu 1-3 (सीए 1, सीए 2, सीए 3) और दांतेदार गाइरस (डीजी)। (सी) स्ट्रिएटम transfecting के लिए सकारात्मक और नकारात्मक पोल की स्थिति को दर्शाता एम्मोनिस (एसटीआर) और Baumgart जे एंड ग्रेब एन 2015 12 से अनुकूलित पार्श्व सेप्टल नाभिक (रास)। (डी) चेतक (ध) और हाइपोथैलेमस (हरियाणा) transfecting के लिए इलेक्ट्रोड का उचित पदों पर दिखाता है।। पुनश्च: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पंचर साइट। डीएनए समाधान के इंजेक्शन के लिए इष्टतम स्थिति है लगभग lambdoidal सिवनी और 0.5 मिमी से राज्याभिषेक 0.75 मिमी बाण सिवनी से पार्श्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
कान उत्स की चित्रा 4. स्थिति। कान उत्स की स्थिति को स्पष्ट रूप से (तीर) में परिभाषित किया गया है।"एन.के.> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5A

चित्रा 5 ब

चित्रा 5C

चित्रा 5 डी
एक भ्रूण पर कोण की चित्रा 5. विज़ुअलाइज़ेशन। बेहतर दृश्य के लिए cortical क्षेत्रों के विशिष्ट transfections (retrosplenial कॉर्टेक्स, मोटर कॉर्टेक्स, somatosensory प्रांतस्था, piriform के लिए सकारात्मक (एक नीले प्लस पर हस्ताक्षर के साथ संकेत) और नकारात्मक पोल के लिए उपयुक्त पदों कोर्टेक्स), हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों (कोर्नु एम्मोनिस (सीए) 1-3, दांतेदार गाइरस (डीजी)),पार्श्व सेप्टल नाभिक, स्ट्रिएटम, चेतक और हाइपोथेलेमस गर्भाशय में भ्रूण पर दिखाए जाते हैं, एमनियोटिक थैली में और एक विच्छेदित भ्रूण (सभी E15,5) पर एक भ्रूण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
इलेक्ट्रोड आकार पर निर्भर करता अभिकर्मक की चित्रा 6 विशिष्टता। इलेक्ट्रोड चप्पू का बढ़ता आकार अभिकर्मक की विशिष्टता कम कर देता है। यह देर से भ्रूण चरणों (E17, नीचे) में विशेष रूप से युवा भ्रूण चरणों (E12, ऊपर) में स्पष्ट है, लेकिन यह भी दिख रहा है। Baumgart जे एंड ग्रेब एन 2015 12 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
एक E12 भ्रूण के आकार की तुलना में इलेक्ट्रोड चप्पू की चित्रा 7. आकार। भ्रूण की बहुत बहुत बड़े कवर कर रहे हैं और इसलिए दिल ताल के स्नेह का खतरा बढ़ जाता है कि इलेक्ट्रोड। उदाहरण के लिए, (सही पर) एक 10 मिमी इलेक्ट्रोड विशिष्टता प्राथमिक लक्ष्य नहीं है, भले ही पूरे E12 भ्रूण को शामिल किया गया है और इसलिए सिफारिश नहीं है। Baumgart जे एंड ग्रेब एन 2015 12 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लक्षित क्षेत्र कोण इलेक्ट्रोड की स्थिति भ्रूण की उम्र डीएनए AmouNT / एकाग्रता वोल्टेज इलेक्ट्रोड का आकार
Retrosplenial कॉर्टेक्स 330 डिग्री - 0 डिग्री कान primordia के इलेक्ट्रोड का केंद्र सिर्फ पूर्वकाल E14 (E11-E17) 1.5 2 μl /
/ Μl 2.7- 2 माइक्रोग्राम 		36 38 3 5 मिमी
मोटर कॉर्टेक्स 0 ° - 40 ° कान primordia के इलेक्ट्रोड का केंद्र सिर्फ पूर्वकाल E14 (E11-E17) 1.5 2 μl /
/ Μl 2.7- 2 माइक्रोग्राम 		36 38 3 5 मिमी
Somatosensory कॉर्टेक्स 40 डिग्री - 95 डिग्री कान primordia के इलेक्ट्रोड का केंद्र सिर्फ पूर्वकाल E14 (E11-E17) 1.5 2 μl /
/ Μl 2.7- 2 माइक्रोग्राम 		36 38 3 5 मिमी
Piriforमीटर कॉर्टेक्स 95 ° - 110 ° कान primordia के इलेक्ट्रोड का केंद्र सिर्फ पूर्वकाल E14 (E11-E17) 1.5 2 μl /
/ Μl 2.7- 2 माइक्रोग्राम 		36-3 8 3 5 मिमी
कोर्नु एम्मोनिस
(सीए) 1 		250 डिग्री - 275 ° कान उत्स के बीच में सकारात्मक पोल का केंद्र (E14-) E15 2 μl /
/ Μl 2 माइक्रोग्राम 		38 40 3 5 मिमी
सीए 2 230 डिग्री - 250 डिग्री कान उत्स के बीच में सकारात्मक पोल का केंद्र (E14-) E15 2 μl /
/ Μl 2 माइक्रोग्राम 		38 40 3 5 मिमी
सीए 3 210 ° - 230 ° कान उत्स के बीच में सकारात्मक पोल का केंद्र (E14-) E15 2 μl /
/ Μl 2 माइक्रोग्राम 		38 40 3 5 मिमी
दांतेदार गाइरस 190 डिग्री - 210 ° कान उत्स के बीच में सकारात्मक पोल का केंद्र (E14-) E15 2 μl /
/ Μl 2 माइक्रोग्राम 		38 40 3 5 मिमी
स्ट्रिएटम 170 डिग्री - 240 डिग्री कान primordia के स्तर पर इलेक्ट्रोड का केंद्र E12 1 μl /
/ Μl 4 माइक्रोग्राम 		33 0.5 मिमी
पार्श्व सेप्टल न्यूक्लियस 100 डिग्री - 170 डिग्री कान primordia के स्तर पर इलेक्ट्रोड का केंद्र E12 1 μl /
/ Μl 4 माइक्रोग्राम 		33 0.5 मिमी
चेतक 25 ° - 40 ° Electodes का केंद्र सिर्फ कान प्राथमिक पीछेmordia E12- E13 1-1.5 μl /
/ Μl 4-2.7 माइक्रोग्राम 		33- 35 0.5- 3 मिमी
हाइपोथैलेमस 90 ° - 180 ° Electodes का केंद्र सिर्फ कान primordia पीछे E12- E13 1-1.5 μl /
/ Μl 4-2.7 माइक्रोग्राम 		33- 35 0.5- 3 मिमी

तालिका 1:। परिणामों का सारांश इस तालिका में शामिल वर्णित cortical क्षेत्रों के विशिष्ट अभिकर्मक के लिए सभी प्रासंगिक जानकारी है। यह लक्षित क्षेत्र, कोण, इलेक्ट्रोड की स्थिति, भ्रूण अवस्था, डीएनए समाधान, वोल्टेज के लागू राशि और एकाग्रता और इलेक्ट्रोड के आकार के बारे में विवरण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Fast Green Roth 0301.1
pCAGGS Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) Wold Precision Instrument Inc. 1B100F-4
Isoflurane (Forene) Abbott PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl) Pfizer GmbH approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) Bayer  PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution Pharmacy
of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen) Hartmann 407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture Ethicon Johnson & Johnson K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm Fine Science Tools 11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm Fine Science Tools 11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm Fine Science Tools 11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm Fine Science Tools 1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm Fine Science Tools 14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm Fine Science Tools 14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm Fine Science Tools 12565-14
Elektroporator CUY21 SC  Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Microgrinder EG-44 Narishige
P-97 Micropette Puller Sutter Instrument Company P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm Nepagene CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm Nepagene CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm Nepagene CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm Nepagene CUY650P10
Anesthesia system Rothacher-Medical GmbH CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate Rothacher-Medical GmbH HP-1M
Temperature Controller 220V AC Rothacher-Medical GmbH TCAT-2LV

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 107, कोण नक्शा C57BL / 6 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र लक्षित जीन वितरण कॉर्टेक्स हिप्पोकैम्पस चेतक हाइपोथैलेमस पार्श्व सेप्टल नाभिक स्ट्रिएटम
प्रांतस्था, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, पार्श्व सेप्टल Nucleus- और स्ट्रिएटम-विशिष्ट<em&gt; गर्भाशय में</em&gt; C57BL 6 / माउस electroporation में
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Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-,… More

Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J. Vis. Exp. (107), e53303, doi:10.3791/53303 (2016).

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