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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Subcellular सीए की प्रतिदीप्ति और bioluminescence इमेजिंग Published: December 1, 2015 doi: 10.3791/53330
Automatic Translation
1, 1, 2
1Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, 2Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

Abstract

Neurodegeneration और ischemia के लिए जुड़े न्यूरॉन कोशिका मृत्यु के लिए संवेदनशीलता निहायत आयु वर्ग के मस्तिष्क में बढ़ रहे हैं, लेकिन जिम्मेदार तंत्र बुरी तरह से जाना जाता है। Excitotoxicity, दोनों अपमान से प्रेरित न्यूरॉन क्षति के लिए योगदान माना एक प्रक्रिया है, सीए 2 बाढ़ और माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 अधिभार को बढ़ावा देता है कि ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की सक्रियता के द्वारा मध्यस्थता है। इंट्रासेल्युलर सीए 2 homeostasis के इंट्रासेल्युलर सीए 2 समस्थिति या remodeling में एक बड़ा परिवर्तन पुरानी न्यूरॉन्स में न्यूरॉन क्षति एहसान कर सकते हैं। बुढ़ापे में सीए 2 पुर्ननिर्माण की जांच के लिए हम इन विवो में न्यूरॉन्स के आयु वर्ग के कुछ पहलुओं में समान है कि चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की लंबी अवधि संस्कृतियों में रहते सेल इमेजिंग का इस्तेमाल किया है। इस अंत के लिए, हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं पहली जगह में, हौसले से नवजात चूहे hippocampi से फैलाया और पोली-डी lysine लेपित, कांच coverslips पर चढ़ाया, कर रहे हैं। तब संस्कृतियों कई दिनों के लिए नियंत्रित मीडिया में रखा या डब्ल्यू कई हैंक्रमशः, जवान और बूढ़े न्यूरॉन्स की जांच के लिए eeks। दूसरा, सभ्य न्यूरॉन्स fura2 के साथ भरी हुई है और डिजिटल प्रतिदीप्ति अनुपात इमेजिंग का उपयोग साइटोसोलिक सीए 2 एकाग्रता के मापन के अधीन हैं। तीसरा, सभ्य न्यूरॉन्स माइटोकॉन्ड्रिया के लिए लक्षित कम आत्मीयता aequorin और GFP की एक मिलकर व्यक्त plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं के अंदर aequorin coelenterazine साथ पुनर्गठन किया जाता है और न्यूरॉन्स माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 एकाग्रता की निगरानी के लिए bioluminescence इमेजिंग के अधीन हैं। इस तीन कदम प्रक्रिया उदाहरण के लिए ग्लूटामेट रिसेप्टर agonist NMDA और इन और अन्य प्रतिक्रियाओं उम्र बढ़ने से प्रभावित रहे हैं कि क्या तुलना के रूप में प्रासंगिक उत्तेजनाओं को साइटोसोलिक और mitochondrial सीए 2 प्रतिक्रियाओं की निगरानी की अनुमति देता है। यह प्रक्रिया कैसे प्रभाव साइटोसोलिक और mitochondrial सीए 2 चयनित उत्तेजनाओं को प्रतिक्रियाओं के साथ ही न्यूरॉन सेल को रोकने के उद्देश्य चयनित दवाओं के परीक्षण उम्र बढ़ने के रूप में नए अंतर्दृष्टि उपज हो सकती हैउम्र से संबंधित बीमारियों में मौत।

Introduction

Excitotoxicity ऐसे ischemia के रूप में मस्तिष्क संबंधी अपमान में neuronal नुकसान और कोशिका मृत्यु के लिए योगदान सबसे महत्वपूर्ण तंत्रों में से एक है, और इस तरह के अल्जाइमर रोग 1 के रूप में कुछ neurodegenerative रोगों में। न्यूरोटॉक्सिटी इस प्रकार का मुख्य रूप से सीए पर ग्लूटामेट अभिनय द्वारा मध्यस्थता है 2 + पारगम्य, आइनोंट्रॉपिक NMDA रिसेप्टर्स (NMDAR) 2। ग्लूटामेट को सभ्य न्यूरॉन्स का एक्सपोजर न्यूरोनल एपोप्टोसिस 4 का कारण बनता है जो excitotoxicity 3, बढ़ सकता है। हम और दूसरों को पहले से NMDA प्रेरित apoptosis के न्यूरोनल भेद्यता इन विट्रो में विकास और 5-8 उम्र बढ़ने के साथ बदल सकता है कि सूचना दी है।

यह व्यापक रूप से साइटोसोलिक मुक्त सीए 2 एकाग्रता ([सीए 2 +] CYT) में वृद्धि की कोशिकाओं सक्रियण की ओर जाता है कि स्वीकार किया जाता है। इस वृद्धि बहुत अधिक है और / या काफी निरंतर है हालांकि, अगर यह कोशिका मृत्यु 9 को गति प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, यह प्रस्ताव किया गया हैकि excitotoxicity माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 तेज 10, ग्लूटामेट प्रेरित कोशिका मृत्यु 11 लोगों के खिलाफ एक माइटोकॉन्ड्रियल uncoupler संरक्षित न्यूरॉन्स के साथ न्यूरॉन्स के इलाज के बाद की आवश्यकता है। माइटोकॉन्ड्रिया सीए 2 बहुत ज्यादा ऊपर ले, तो माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण ताकना के उद्घाटन साइटोक्रोम ग और अन्य समर्थक apoptotic कारक है, और उत्प्रेरण apoptosis की रिहाई के लिए अग्रणी हो सकता है। हमने हाल ही में इस माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 तेज सीधे सीधे एकल हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 5 में NMDA प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 तेज, इस लेख में बताया गया है जो एक विधि को मापने के द्वारा, excitotoxicity करने के लिए उम्र पर निर्भर संवेदनशीलता से संबंधित है कि दिखाया गया है। ऐसी शिक्षा, स्मृति और अन्य संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं 12 के रूप में शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल हिप्पोकैम्पस, उम्र बढ़ने और neurodegenerative विकारों से 13 अत्यधिक संवेदनशील है। यह इन विट्रो में कई हफ्तों के बाद, कि प्रस्तावित किया गया है, सुसंस्कृतहिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स आयु वर्ग के 14 न्यूरॉन्स की विशिष्ट विशेषताओं में से एक नंबर दिखा। तदनुसार, लंबी अवधि के सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स बुढ़ापे में बढ़ाया excitotoxicity के सीए 2 मध्यस्थता तंत्र की जांच करने के लिए एक व्यापक मॉडल उपलब्ध करा सकता है।

प्रस्तुत विधि के समग्र लक्ष्य इसलिए, एक लंबी अवधि के सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में NMDA रिसेप्टर एगोनिस्ट से हासिल अंतर सीए 2 प्रतिक्रियाओं सहित उम्र बढ़ने मस्तिष्क में intracellular सीए 2 समस्थिति या सीए 2 remodeling में महत्वपूर्ण परिवर्तन की जांच करने के लिए है, । विधि क्रमश: चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति का एक विस्तृत विवरण और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में प्रतिदीप्ति और bioluminescence इमेजिंग द्वारा साइटोसोलिक और mitochondrial सीए 2 सांद्रता की निगरानी भी शामिल है। सभ्य न्यूरॉन्स में साइटोसोलिक सीए 2 की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एक मानक प्रक्रिया है। हालांकि, इस विधि उप लिए कम विश्वसनीय हैसेलुलर सीए माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 सहित 2 + माप। इस के लिए कारण भी मिमी स्तर को कम माइक्रोन के स्तर से माइटोकॉन्ड्रिया में परिवर्तित हो सकता है कि सीए 2 सांद्रता के लिए सिंथेटिक जांच के उचित लक्ष्य-निर्धारण और अनुचित आत्मीयता की कमी शामिल है। उदाहरण aequorin के लिए के रूप में प्रोटीन के आधार पर सीए 2 जांच के उपयोग, subcellular अंगों का लक्ष्य रखा है और विशिष्ट सीए 2 बाध्यकारी साइटों 15 की कमी अलग coelenterazines या उत्परिवर्तित जांच का उपयोग विभिन्न डेरिवेटिव सीए 2 समानताएं के उपयोग की अनुमति दी है। इस तरह, माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित aequorin व्यक्त कोशिकाओं के bioluminescence इमेजिंग व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 सांद्रता की निगरानी की अनुमति हो सकती है। फिर भी, इस प्रक्रिया bioluminescence इमेजिंग 16-18 के लिए फोटॉन गिनती कैमरों या ultrasensitive सीसीडी कैमरों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। अधिक establ में पुष्टि की जानी चाहिए कि उपन्यास परिणाम हो सकता है इस विधिउदाहरण के लिए के रूप में दंडित मस्तिष्क उम्र बढ़ने के मॉडल, पुराने पशुओं से मस्तिष्क के स्लाइस।

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Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं यूरोपीय कन्वेंशन 123 / यूरोप की परिषद और निर्देशक 86/609 / EEC के साथ समझौते में वैलेडॉलीड विश्वविद्यालय पशु आवास सुविधा द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत नियंत्रित किया गया है।

चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की 1. छोटी और लंबी अवधि संस्कृति

  1. पाली-डी-लाइसिन की तैयारी, 12 मिमी कांच coverslips लेपित।
    1. कम से कम 24 घंटे के लिए इथेनॉल में 12 मिमी व्यास कांच coverslips जीवाणुरहित। उन्हें बाँझ शर्तों के तहत सूखे की अनुमति दें।
    2. एक पेट्री डिश में parafilm की एक पट्टी पर coverslips बांटो। 1 मिलीग्राम / एमएल पाली डी lysine के 200 μl के साथ प्रत्येक coverslip की सतह को कवर। हे / एन के इलाज की अनुमति दें।
    3. अगले दिन बाँझ शर्तों के तहत 90 मिनट के लिए दोहरा आसुत बाँझ पानी के साथ हर 15 मिनट coverslips धोने।
    4. Neurobasal मध्यम संस्कृति के 500 μl के साथ एक चार अच्छी तरह multidish थाली भरें प्रति अच्छी तरह से। Neurobasal मध्यम संस्कृति के साथ पूरक होना चाहिए10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 B27%, 1 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन और 2 मिमी एल glutamine।
    5. Multidish प्लेट में coverslips रखें। उपयोग करें जब तक एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में उन्हें बनाए रखना।
  2. नवजात चूहों से hippocampal न्यूरॉन्स के अलगाव।
    1. बाँझ शर्तों के तहत एक शीशी (20 μl / एमएल) में 1.8 मिलीलीटर papain समाधान (सीधे खरीदा) तैयार: 20 μl के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए / 1.8 मिलीलीटर हांक प्लस 0.6% BSA में लगभग 40 μl papain जोड़ें एमएल (μl गणना की जानी चाहिए ) आपूर्तिकर्ता की स्थिति पर निर्भर करता है। हांक 0.6% बीएसए 4% गोजातीय सीरम albumin के 15 मिलीलीटर साथ HBSS माध्यम के 85 मिलीलीटर के मिश्रण से तैयार किया जाता है (बीएसए, 100 मिलीलीटर HBSS में बीएसए की 4 जी सुलझाने तैयार)। एक बाँझ हुड में यह तैयार करें।
    2. उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हांक प्लस 0.6% BSA में papain सेते हैं। उपयोग करने से पहले एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर।
    3. है Dulbecco जोड़कर हाम एफ 12 के माध्यम से तैयारदोहरा आसुत बाँझ पानी की 900 मिलीलीटर में ईगल मध्यम पाउडर (एल प्रति 13.5 ग्राम) के संशोधित। फिर 6 ग्राम HEPES और 336 मिलीग्राम 3 NaHCO जोड़ने और NaOH 4 एन 1 एल समाधान प्राप्त करने और एक 0.20 माइक्रोन polyethersulfone का उपयोग कर इसे फिल्टर करने के क्रम में बाँझ पानी जोड़ें का उपयोग कर 7.42 पीएच को समायोजित (पी इ एस) शीर्ष फिल्टर बोतल। एक बाँझ हुड में यह प्रक्रिया जारी है। अंत में उपयोग करने से पहले बाँझ शर्तों के तहत सीओ 2 के साथ समाधान तर। स्टोर के समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर और उन्हें ठंडा का उपयोग करें।
    4. कत्ल के द्वारा नवजात शिशु (P0) चूहा पिल्ले euthanize और बाँझ एचबीएस माध्यम में सिर धो लें। बाँझ कैंची की मदद से खोपड़ी खोलें। एक रंग के साथ मस्तिष्क को निकालें और हाम एफ 12 के माध्यम में जल्दी से इसे धो लें।
    5. प्रत्येक गोलार्द्ध (चित्रा 1 बी) में एक छुरी की सहायता से एक विकर्ण कटौती करें, और हाम एफ 12 मध्यम युक्त एक पेट्री डिश के लिए इसे ले।
    6. विच्छेदन संदंश की मदद से और एक आवर्धक कांच के तहत ध्यान से त्यागें तानिका।
      7. <ली> आवर्धक कांच का उपयोग प्रांतस्था पर एक विशेषता अवतल स्थान में हिप्पोकैम्पस को पहचानें। फिर, एक सीमा से ध्यान खींच रहा है और आंख कैंची का उपयोग कर अपनी स्थिति से निकालने के द्वारा कोर्टेक्स से हिप्पोकैम्पस अलग।
    7. बाँझ हांक मध्यम सीए कमी 2 + और ​​2 मिलीग्राम + प्लस 0.6% बीएसए से भरा एक 4 अच्छी तरह से थाली करने के हिप्पोकैम्पस ऊतक स्थानांतरण और हिप्पोकैम्पस ऊतक धो लें। हटाने के बिना मीडिया को एक ही आंख कैंची का उपयोग कर छोटे-छोटे टुकड़ों में ऊतक (2 एक्स 2 के आसपास मिमी) काटा।
    8. 1.8 एमएल पूर्व फ़िल्टर किया papain समाधान युक्त एक शीशी हिप्पोकैम्पस टुकड़े स्थानांतरण। तो कभी कभी, कोमल झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं। 15 मिनट के बाद, (अंतिम 50 माइक्रोग्राम / एमएल) DNase मैं समाधान के 90 μl जोड़ने और 15 अतिरिक्त मिनट के लिए सेते हैं।
    9. एक 10 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब ऊतक स्थानांतरण और ताजा Neurobasal मध्यम संस्कृति के साथ टुकड़े धो लें। एक 5 मिलीलीटर की प्लास्टिक रंज के माध्यम से ऊतक टुकड़े गुजर द्वारा सेल निलंबन प्राप्तकैसेट।
    10. 5 मिनट के लिए 160 XG पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन। एक प्लास्टिक बाँझ पाश्चर विंदुक का उपयोग तैरनेवाला निकालें और Neurobasal संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में पिपेट स्वचालित 1 मिलीलीटर के साथ सावधानी से गोली निलंबित।
    11. एक Neubauer गिनती कक्ष का उपयोग सेल घनत्व को मापने। Neubauer कक्ष के ऊपर गिलास coverslip रखो। सेल निलंबन के 10 μl जोड़ें। सेल निलंबन समान रूप से और कोई बुलबुले बनाने कक्ष में प्रवेश करती सुनिश्चित करें। खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की संख्या की गणना और 30 x 10 3 कोशिकाओं से युक्त 40-80 μl का एक उपयुक्त बूंद प्राप्त करने के लिए इसी गणना करते हैं। कोशिकाओं की कुल संख्या प्रयुक्त जानवर की संख्या पर निर्भर करेगा।
  3. अल्पकालिक और चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की लंबी अवधि संस्कृति।
    1. प्रत्येक में 50 μl की एक बूंद में लगभग 30 x 10 3 कोशिकाओं Neurobasal मध्यम संस्कृति के 500 μl युक्त चार अच्छी तरह multidish प्लेट पर पहले से तैयार है और इनक्यूबेटर, प्लेट में रखाअच्छी तरह से एक पाली-डी lysine- लेपित, 12 मिमी व्यास गिलास coverslip युक्त multidish प्लेट की।
    2. संस्कृति को बदलने के बिना प्रयोगों से पहले इन विट्रो में 2-5 दिन (div, अल्पकालिक, युवा संस्कृतियों) या> 15 DIV (लंबी अवधि, वृद्ध संस्कृतियों) के लिए एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्राथमिक हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं को बनाए रखें मीडिया।

साइटोसोलिक सीए 2. प्रतिदीप्ति इमेजिंग 2 + एकाग्रता

  1. प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए परीक्षण के समाधान के लिए तैयार करना।
    1. सोडियम क्लोराइड 145, KCl 5, 2 MgCl 1, 2 CaCl 1, ग्लूकोज 10, सोडियम-HEPES 10 (पीएच 7.42): mm में से युक्त एक बाहरी HEPES बफर खारा (एचबीएस) समाधान तैयार करें।
    2. सोडियम क्लोराइड 146, KCl 5, ग्लूकोज 2 CaCl 1, 10 और HEPES 10 (पीएच 7.42): mm में से युक्त एक बाहरी, मिलीग्राम 2 + मुक्त, HEPES बफर खारा (एचबीएस) समाधान तैयार करें।
    3. एक वित्तीय और प्रक्रियात्मक पहलुओं पर NMDA मिलीग्राम 2 + मुक्त में, HEPES बफर खारा (एचबीएस) का समाधान100 माइक्रोन की एल एकाग्रता और 10 माइक्रोन ग्लाइसिन के साथ पूरक।
    4. (मिमी) को हल करके बजाय NaCl के KCl युक्त एचबीएस समाधान तैयार: KCl 145, 2 MgCl 1, 2 CaCl 1, 10 और HEPES 10 (पीएच 7.42) ग्लूकोज।
  2. फ्लोरोसेंट कैल्शियम जांच fura2 / AM साथ हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं के लोड हो रहा है।
    1. इनक्यूबेटर बंद coverslips युक्त सेल संस्कृति लो और 500 एचबीएस के μl प्रति अच्छी तरह से युक्त एक नया चार अच्छी तरह multidish थाली करने के लिए उन्हें स्थानांतरित करने से आरटी पर एचबीएस के माध्यम से धो लें।
    2. Fura2 साथ कोशिकाओं को सेते / एक अंधेरी जगह में आर टी (25 डिग्री सेल्सियस) पर 60 मिनट के लिए (एक ही एचबीएस माध्यम में तैयार) एएम 4 माइक्रोन।
    3. 60 मिनट के बाद, ताजा एचबीएस मध्यम के साथ coverslips धो लें।
  3. साइटोसोलिक की रिकॉर्डिंग प्रतिदीप्ति छवियों [सीए 2 +] संवर्धित कोशिकाओं में।
    1. दीपक, माइक्रोस्कोप, छिड़काव प्रणाली, प्रतिदीप्ति कैमरा और कंप्यूटर चालू करें।
    2. के लिए एक thermostated मंच में coverslips जगहउलटा माइक्रोस्कोप के मंच पर खुला 12 मिमी कांच coverslips और एक 40x उद्देश्य (1.3 तेल, एनए) का उपयोग कर एक सूक्ष्म क्षेत्र का चयन करें। अभाव या परीक्षण पदार्थों की उपस्थिति में (37 डिग्री सेल्सियस) पूर्व गर्म एचबीएस माध्यम के साथ लगातार कोशिकाओं छिड़कना। / मिनट के बारे में 5-10 मिलीलीटर की दर से प्रवाह को बनाए रखें।
      नोट: जीवित कोशिकाओं के लिए सेल छिड़काव प्रणाली खुले 12 मिमी कांच coverslips के लिए एक thermostated मंच में मुहिम शुरू की है। एक वाल्व नियंत्रक के साथ सुसज्जित 8 लाइनों गुरुत्वाकर्षण संचालित छिड़काव प्रणाली समाधान छिड़कना के लिए इस्तेमाल किया जाता है। एक वैक्यूम पंप किसी भी अतिरिक्त मध्यम दूर करने के लिए जिम्मेदार है। समाधान एक में ट्यूब हीटिंग सिस्टम का उपयोग कर गरम कर रहे हैं।
    3. शटर दोनों उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में बंद के साथ एक पृष्ठभूमि छवि पर कब्जा है।
    4. 340 और 380 एनएम पर बारी-बारी से कोशिकाओं महामारी रोशन। रिकॉर्ड प्रकाश 520 एनएम एक Fura-2 dichroic दर्पण से फ़िल्टर है जो एक प्रतिदीप्ति कैमरा के साथ हर 5-10 सेकंड में उत्सर्जित।
    5. रिकॉर्डिंग की अवधि समाप्त हो गया है, पूरा अनुक्रम ओ की दुकानच छवियों और विश्लेषण के लिए कंप्यूटर में 520 एनएम पर उत्सर्जित।
  4. दर्ज की गई फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण।
    1. प्रयोग फ़ाइल खोलें। Aquacosmos सॉफ्टवेयर का प्रयोग, 'अनुपात' पर क्लिक करें और वांछित अनुपात श्रेणी का चयन करें। अनुपात छवियों का एक दृश्य प्राप्त करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप छवियों में पिक्सेल अनुपात द्वारा पिक्सेल गणना।
    2. 'पृष्ठभूमि उन्मूलन' का समायोजन करके पृष्ठभूमि घटाना। प्रेस 'आरंभ गणना'।
    3. प्रेस 'हर समय अनुक्रम' बटन और ब्याज की प्राचीन क्षेत्रों मिटा (ROIs)। व्यक्ति की कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के लिए इसी ब्याज या ROIs के नए क्षेत्रों की स्थापना। प्रत्येक रॉय और प्रत्येक छवि के लिए इसी प्रत्येक पिक्सेल में औसत सभी अनुपात मूल्यों व्यक्ति ROIs (कोशिकाओं) के लिए अनुपात प्रतिदीप्ति मूल्यों की रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए।
    4. एक रेखांकन progr करने के लिए प्रत्येक रॉय के लिए इसी अनुपात प्रतिदीप्ति मूल्यों निर्यात व्यक्ति रिकॉर्डिंग ग्राफ कोमहिला।
    5. एक उपयुक्त डेटा विश्लेषण का उपयोग कर प्रत्येक उत्तेजना के जवाब में अनुपात fluorescences में उगता के आकार के आकलन और सॉफ्टवेयर रेखांकन के लिए इसी गणना करें।

Mitochondrial सीए 3. bioluminescence इमेजिंग 2 + एकाग्रता

  1. MitGAmut प्लाज्मिड के साथ सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के अभिकर्मक।
    नोट: प्रकोष्ठों पहले एक माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित अनुक्रम और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) से जुड़े हुए एक सीए 2 बाध्यकारी साइट की कमी एक उत्परिवर्तित aequorin युक्त mitGAmut प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। इस निर्माण माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 तेज में बड़े बढ़ जाता है का पता लगाता है और GFP प्रतिदीप्ति द्वारा कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है। प्लाज्मिड विकसित और कृपया पी Brûlet और सह कार्यकर्ता 18 (CNRS, पेरिस) द्वारा प्रदान किया गया।
    1. भ्रूण गोजातीय सीरम कमी, Neurobasal संस्कृति के माध्यम युक्त, Neurobasal टीएफ तैयार करें, B27, gentamicमें और 2 मिमी एल glutamine।
    2. Neurobasal टीएफ के 50 μl प्लस एक शीशी (समाधान क) में 2.5 μl अभिकर्मक अभिकर्मक तैयार करें। 50 Neurobasal टीएफ की μl प्लस 4 माइक्रोग्राम एक शीशी में mitGAmut प्लाज्मिड (समाधान बी) तैयार करें। मिलाते हुए बिना, 20 मिनट के दौरान मिश्रण की अनुमति समाधान ए पर धीरे समाधान बी जोड़ें।
    3. ताजा Neurobasal टीएफ के 200 μl युक्त नया multidish प्लेटों के लिए हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स युक्त coverslips स्थानांतरण।
    4. हर coverslip पर ड्रॉप द्वारा समाधान ए + बी के 100 μl बूंद जोड़ें। 30 मिनट के लिए सेते हैं। मध्यम निकालें। ताजा Neurobasal टीएफ के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें। मूल Neurobasal संस्कृति के माध्यम से coverslips लौटें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% अभिकर्मक के बाद सीओ 2 में एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए संस्कृति न्यूरॉन्स कुशल अभिव्यक्ति और जांच के लक्षित कर की अनुमति है।
  2. Bioluminescence इमेजिंग के लिए परीक्षण के समाधान के लिए तैयार करना।
    1. के रूप में NMDA 100 माइक्रोन या 145 मिमी KCl युक्त एचबीएस समाधान तैयारऊपर (2.1 चरण)। 10 मिमी सीए युक्त 2 + प्लस 100 माइक्रोन digitonin एचबीएस समाधान तैयार है।
  3. Coelenterazine n के साथ माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित aequorin का पुनर्गठन।
    1. एचबीएस के 200 μl युक्त एक चार अच्छी तरह से थाली ट्रांसफ़ेक्ट हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स युक्त स्थानांतरण coverslips।
    2. 4 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए एचबीएस के 200 μl को coelenterazine एन (200 माइक्रोन) के 4 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण। आर टी (25 डिग्री सेल्सियस) पर 2 घंटे के लिए और अंधेरे में सेते हैं।
  4. माइटोकॉन्ड्रियल की रिकॉर्डिंग bioluminescence छवियों [सीए 2 +]।
    1. माइक्रोस्कोप, दीपक, छिड़काव प्रणाली, bioluminescence कैमरा और कंप्यूटर चालू करें।
    2. एक thermostated (37 डिग्री सेल्सियस) छिड़काव चैम्बर को पुनर्गठित coverslips स्थानांतरण और 5-10 मिलीग्राम / मिनट की दर से पूर्व गर्म एचबीएस समाधान के साथ लगातार छिड़कना।
    3. एक 40x उद्देश्य (तेल, एनए: 1.3) का उपयोग करना, एक व्यक्त कोशिकाओं से युक्त एक सूक्ष्म क्षेत्र का चयनFITC फिल्टर का उपयोग हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति के साथ जुड़े प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के रूप में दिखाया poaequorins। एक ठेठ क्षेत्र 1-2 कोशिकाओं हो सकती है। एक सीसीडी कैमरे का उपयोग, GFP प्रतिदीप्ति छवि पर कब्जा है।
    4. माइक्रोस्कोप प्रकाश बंद कर दें। प्रकाश मार्ग में स्थित dichroic युक्त बॉक्स निकालें। उत्तेजना प्रकाश बंद करें और पूरी तरह अंधेरे के लिए अंधेरे-बॉक्स को बंद करें।
    5. के साथ या परीक्षण समाधान 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम बिना एचबीएस माध्यम के साथ 5-10 मिलीग्राम / मिनट पर कोशिकाओं छिड़कना।
    6. फोटोनिक उत्सर्जन छवियों एक छवि प्रोसेसर के साथ संभाला एक फोटोन गिनती कैमरा के साथ हर 10 सेकंड पर कब्जा।
    7. एक प्रयोग के अंत में, शेष सभी फोटोनिक उत्सर्जन को रिहा करने के क्रम में एचबीएस में 10 मिमी में digitonin 0.1 मिमी 2 CaCl के साथ कोशिकाओं permeabilize।
      नोट: ये फोटोनिक उत्सर्जन कुल फोटोनिक उत्सर्जन, सीए 2 सांद्रता में जांच के लिए आवश्यक एक मूल्य के अनुमान लगाने के क्रम में जोड़ा जाना चाहिए <।/ Li>
    8. GFP जुड़े प्रतिदीप्ति छवि के साथ कंप्यूटर में स्टोर bioluminescence छवियों फोटॉन गिनती इमेजिंग से पहले कब्जा कर लिया।
  5. माइटोकॉन्ड्रियल [सीए 2 +] को दर्शाती bioluminescence छवियों का विश्लेषण।
    1. विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फोटोनिक उत्सर्जन यों। फोटोनिक उत्सर्जन माइटोकॉन्ड्रियल मुक्त सीए करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता 2 + एकाग्रता ([सीए 2 +] एमआईटी) Brini एट अल। 15 से वर्णित कलन विधि का उपयोग।
    2. प्रयोग और GFP प्रतिदीप्ति छवि खोलें। प्रयोग की शुरुआत में कब्जा कर लिया प्रतिदीप्ति छवियों के अनुसार कोशिकाओं के आकार ड्राइंग द्वारा विशेष सॉफ्टवेयर की मदद से ब्याज (ROIs) के चुनिंदा क्षेत्रों।
    3. हर छवि पर एक ही ROIs चिपकाएं। प्रत्येक रॉय में कुल फोटोनिक उत्सर्जन समय में प्रत्येक बिंदु पर प्रत्येक कक्ष के लिए चमक उत्सर्जन मूल्य (एल) प्राप्त करने के लिए विशेष सॉफ्टवेयर के साथ गणना कर रहे हैं।
    4. सभी फोटोनिक emiss को जोड़ेंसभी फोटोनिक उत्सर्जन युक्त एक bioluminescence छवि प्राप्त करने के लिए, विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, permeabilization digitonin के बाद प्राप्त लोगों सहित bioluminescence छवियों, में आयनों।
    5. गणना के लिए एक विशेष सॉफ्टवेयर के हित के लिए हर क्षेत्र के लिए फोटोनिक उत्सर्जन के निर्यात मूल्यों। ऐसा करने के लिए, प्रत्येक समय में हर रॉय के लिए bioluminescence मूल्यों की गणना करने के लिए 'ग्राफ' पर क्लिक करें। 'कुल मूल्य' का चयन करें और 'सभी छवियों के लिए वर्तमान लागत पर लाभ का उपयोग करें। प्रेस 'की गणना'। एक वर्कशीट के लिए 'txt.file' और निर्यात डेटा को बचाओ। हर रॉय के लिए, [सीए 2 +] एमआईटी निम्नलिखित कलन विधि का उपयोग कर की गणना है:

      [सीए 2 +] (एम) = [आर + (आर · कश्मीर टीआर) - 1] / [कश्मीर आर - (आर · कश्मीर आर)];

      जहां,
      आर = [एल / (एल कुल λ)] 1 / एन
      एल ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र में माप के समय में उत्सर्जित चमक है।
      एल कुल हैब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए माप के समय में उस समय ऊतकों में मौजूद गिनती के अलावा के बाद शेष कुल luminescence। λ, कश्मीर टी.आर., कश्मीर आर और एन जिनके मूल्यों aequorin के संयोजन पर निर्भर (जंगली प्रकार या उत्परिवर्तित) और coelenterazin इस्तेमाल किया (जंगली प्रकार या एन प्रकार) स्थिरांक के रूप में अच्छी तरह के रूप में रिकॉर्डिंग तापमान 16 हैं। यहां इस्तेमाल संयोजन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, (AEQ और coelenterzine एन उत्परिवर्तित), हम निम्न मान का इस्तेमाल किया: कश्मीर आर = 8.47 10 x 7, कश्मीर टी.आर. = 165.6 x 10 3, एन 1204 और λ = 0138 =।
  6. एक उपयुक्त डेटा विश्लेषण का उपयोग कर प्रत्येक उत्तेजना के जवाब में bioluminescence में उगता के आकार के आकलन और सॉफ्टवेयर रेखांकन के लिए इसी गणना करें।

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Representative Results

यहाँ हम सीए 2 remodeling और साइटोसोलिक और mitochondrial पर NMDA के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन [सीए 2 +] वृद्ध न्यूरॉन्स में। चित्रा 1 को अलग-थलग और नवजात चूहों से hippocampal न्यूरॉन्स के लिए प्रक्रिया की योजनाबद्ध दिखाता है। शुरू करने से पहले, हम बाँझ, पाली डी lysine लेपित, कांच coverslips तैयार करने और एक 4 अच्छी तरह से थाली में उन्हें खोजने की जरूरत है। फिर, नवजात चूहों को मार डाला और मस्तिष्क को हटा रहे हैं। हिप्पोकैम्पस को अलग-थलग करने के बाद, ऊतक ध्यान papain का उपयोग कर छितरी हुई है। अलग कक्षों धोया और लेपित coverslips पर चढ़ाया जाता है। तब कोशिकाओं 2-5 div या क्रमशः युवा या वृद्ध संस्कृतियों, पाने के लिए> 15 DIV के लिए सुसंस्कृत, और सीए 2 इमेजिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

ऊपर रणनीति का प्रयोग, यह परीक्षण करने के लिए एक ही नमूना से जवान और बूढ़े न्यूरॉन्स के लिए संभव है, उदाहरण के लिए, NMDA [सीए 2 +] युवा cultu में साइटोसोलिक पर अंतर प्रभाव लाती है कि क्यापुराने संस्कृतियों में से रिस। 2 NMDA 100 माइक्रोन साइटोसोलिक में बड़े बढ़ जाती है लाती है कि पता चलता है [सीए 2 +] युवा संस्कृतियों में से अधिक पुराने संस्कृतियों में। इसी तरह, NMDA पुराने न्यूरॉन्स में नहीं बल्कि युवा न्यूरॉन्स 5 में कोशिका मृत्यु लाती है। सीए 2 प्रतिक्रियाएं बहुत अधिक हैं जहां मामलों में, इसी तरह के प्रयोगों fura4F 5 उदाहरण के लिए, जैसे डाई संतृप्ति से बचने के लिए सीए 2 के लिए कम आत्मीयता के साथ सीए 2 जांच के साथ किया जा सकता है। इसी तरह, यह साइटोसोलिक के आराम के स्तर [सीए 2 +] अलग कर रहे हैं कि क्या यह जानने के लिए भी संभव है। इसके अलावा, NMDAR सब यूनिटों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ इस प्रोटोकॉल के संयोजन विशिष्ट एंटीबॉडी 5 उपलब्ध हैं, बशर्ते कि NMDA रिसेप्टर सब यूनिटों की अभिव्यक्ति में अंतर के साथ जवाबदेही में सहसंबंधी परिवर्तन की अनुमति दे सकता। साइटोसोलिक की माप [सीए 2 +] अन्य प्रासंगिक paramete का आकलन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकतासीए 2 दुकान सामग्री सहित रुपये, सीए 2 को पारगम्यता आराम कर, सीए 2 निकासी दरों और युवा और वृद्ध न्यूरॉन्स के बीच उनके संभावित मतभेद।

इसी तरह फैशन में, यह माइटोकॉन्ड्रियल पर ऐसे उत्तेजनाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए भी संभव है [सीए 2 +]। चित्रा 3 माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित aequorin साथ ट्रांसफ़ेक्ट हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की bioluminescence इमेजिंग का एक उदाहरण से पता चलता है। उत्तेजना के बाद फोटोनिक उत्सर्जन की रिहाई माइटोकॉन्ड्रियल में वृद्धि का एक समारोह है [सीए 2 +] हासिल की। माइटोकॉन्ड्रियल में है कि NMDA प्रेरित उगता नोटिस [सीए 2 +] NMDA मुश्किल से फोटोनिक उत्सर्जन बढ़ जाती है, जहां युवा हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की तुलना में वृद्ध न्यूरॉन्स में ज्यादा बड़े होते हैं। इन परिणामों के NMDA केवल वृद्ध न्यूरॉन्स में नहीं बल्कि हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं 5 की युवा संस्कृतियों में apoptosis लाती क्यों की व्याख्या करने के लिए योगदान कर सकता है। इसी तरह, यह माइटोकॉन्ड्रियल में अतिरिक्त मतभेद के लिए परीक्षण करने के लिए संभव हैसीए 2 उदाहरण के लिए विशेष रूप से परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया प्रोटोकॉल का उपयोग युवा और वृद्ध न्यूरॉन्स के बीच से निपटने, सीए माइटोकॉन्ड्रिया से 2 + बाहर निकलें, इंट्रासेल्युलर दुकानों से सीए 2 रिलीज से प्रेरित permeabilized न्यूरॉन्स और माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 तेज में माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 तेज। इसके अलावा, इस पद्धति excitotoxicity के खिलाफ neuroprotection के लिए ब्याज की हो सकता है कि माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 अधिभार को प्रभावित करने दवाओं के लिए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1: प्राथमिक चूहा हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए प्रक्रिया (ए) पाली-डी-लाइसिन, 12 मिमी कांच लेपित coverslips एक पेट्री डिश में तैयार किया और अंत में एक 4 अच्छी तरह से डिश के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं।। एक चूहे के मस्तिष्क का (बी) पृष्ठीय दृश्य। काट दिया जाना चाहिए जहां बिंदीदार रेखा इंगित करता है। (सी) के रूप में प्राप्त करने केप्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन कोशिकाओं के uspension। हिप्पोकैम्पस हटाने के बाद, एक सेल निलंबन प्राप्त की है। तब कोशिकाओं पाली डी lysine लेपित coverslips युक्त 4 अच्छी तरह से बर्तन में चढ़ाया जाता है। (डी) संस्कृति में प्राथमिक चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स दिखा उज्ज्वल क्षेत्र छवि। बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। NMDA साइटोसोलिक बढ़ जाती है [सीए 2 +] हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में छोटी और लंबी अवधि सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स fura2 / AM साथ भरी हुई है और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के अधीन थे। चित्र अल्पकालिक (ए) और लंबी अवधि के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र और pseudocolor छवियों (अनुपात F340 / F380) (बी दिखाने 2 +] (pseudocolor तराजू तल पर दिखाया जाता है) को दर्शाते हैं। निशान साइटोसोलिक के प्रतिनिधि, एकल कोशिका रिकॉर्डिंग दिखाने [सीए 2 +] अल्पकालिक (ए) और लंबी अवधि (बी) सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में 100 माइक्रोन NMDA के जवाब में। कि साइटोसोलिक नोट [सीए 2 +] बढ़ जाती है अल्पकालिक सभ्य न्यूरॉन्स की तुलना में लंबी अवधि में ज्यादा बड़े होते हैं। बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। NMDA हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 अधिभार लाती संवर्धित हिप्पोकैम्पस Neurऑन के माइटोकॉन्ड्रिया लक्षित aequorin, GFP के लिए जुड़े हुए 4 माइक्रोन coelenterazine साथ incubated और [सीए 2 +] माइटोकॉन्ड्रियल की bioluminescence इमेजिंग के अधीन है, कम आत्मीयता के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। चित्र प्रतिदीप्ति (GFP) और संचित फोटोनिक उत्सर्जन (aequorin bioluminescence) प्रतिनिधि लघु (ए) और लंबी अवधि (बी) सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की छवियों को दिखाने के। Luminescence तीव्रता (पिक्सेल प्रति 1 से 16 फोटोनिक उत्सर्जन) pseudocolor में कोडित है। रिकॉर्डिंग लघु (ए) में है और लंबी अवधि (बी) सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स (माइटोकॉन्ड्रियल [सीए 2 +] के रूप में व्यक्त) फोटोनिक उत्सर्जन की रिहाई दिखा। NMDA 100 माइक्रोन वृद्धि हुई माइटोकॉन्ड्रियल [सीए 2 +] वृद्ध न्यूरॉन्स में नहीं बल्कि युवा सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में। बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ एक>

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Discussion

उम्र बढ़ने के मस्तिष्क में intracellular सीए के पुनर्गठन 2 + समस्थिति संज्ञानात्मक हानि से संबंधित कर दिया गया है, इस्कीमिक क्षति, excitotoxicity और neurodegeneration के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि हुई। इन विट्रो में इस परिकल्पना की जांच करने के लिए, सीए 2 इमेजिंग प्रक्रियाओं उपलब्ध हैं। दुर्भाग्य से, पुरानी हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की व्यवहार्य संस्कृतियों विश्वसनीय नहीं हैं। हाल ही में, यह देखा गया है कि चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स आरओएस संचय, lipofuscin कणिकाओं, heterochromatic foci के गठन, सक्रियण pJNK की और p53 / P21 रास्ते, कोलेस्ट्रॉल घटाने सहित विवो में उम्र बढ़ने के विशिष्ट पहचान में से वर्तमान में कई और के दीर्घकालिक संस्कृतियों सीए 2 चैनलों का घनत्व परिवर्तन और NMDA 14 रिसेप्टर्स। तदनुसार, चूहे hippocampal न्यूरॉन्स के जवान और बूढ़े संस्कृतियों में सीए 2 इमेजिंग प्रयोगों उम्र बढ़ने मस्तिष्क में सीए 2 remodeling के नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। संवर्धन hippoca के लिए महत्वपूर्ण है कि एक की हालतलंबी अवधि में mpal न्यूरॉन्स दो गुना है। सबसे पहले, यह ऊपर कहा गया है के रूप में एक बहुत कम घनत्व पर कोशिकाओं थाली करने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, कोशिकाओं मध्यम बदलने के बिना पूरक Neurobasal मध्यम में संवर्धित कर रहे हैं। यह दृष्टिकोण glia लेकिन उनकी पीढ़ी विकास से बचने की उपस्थिति की अनुमति देता है। ऐसी संस्कृति के लिए योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है।

सिंथेटिक सीए 2 जांच के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग साइटोसोलिक की निगरानी की अनुमति देता [सीए 2 +] व्यक्तिगत न्यूरॉन्स 19 में। युवा और वृद्ध न्यूरॉन्स में इस दृष्टिकोण का उपयोग संस्कृति में उम्र के साथ प्रतिक्रिया में परिवर्तन की निगरानी की अनुमति देता है। उदाहरण के आंकड़ा के लिए 2 ठेठ उज्ज्वल क्षेत्र और [सीए 2 +] CYT वृद्ध संस्कृतियों से युवा न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स में NMDA से प्रेरित में बढ़ जाती है की सीए 2 छवियों से पता चलता है। वृद्ध न्यूरॉन्स में प्रतिक्रियाओं युवा न्यूरॉन्स की तुलना में काफी बड़े होते हैं जो सूचना है। हालांकि, इस प्रक्रिया [सीए के लिए विश्वसनीय नहीं है 2 +] [सीए 2 +] मिमी स्तर से ऊपर माइक्रोन से नीचे से भिन्न हो सकते हैं, जहां उदाहरण, माइटोकॉन्ड्रिया, के रूप में subcellular अंगों, भीतर माप। उन मामलों में, प्रोटीन आधारित, माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित जांच, उदाहरण के लिए, के रूप में aequorin विकसित किया गया है। सीए 2 के लिए अपने संबंध पतले क्रमश: बहुत कम या बहुत अधिक [सीए 2 +] लोगों में आराम कर रही माइटोकॉन्ड्रिया के अंदर पहुंच गया और उत्तेजित तरह की स्थिति पर नजर रखने के लिए देखते जा सकता है, क्योंकि यह जांच विशेष रूप से दिलचस्प है। विशेष रूप से, यह जंगली प्रकार aequorin या सीए के बिना एक उत्परिवर्तित aequorin 2 + आत्मीयता को संशोधित करने के लिए बाध्यकारी साइटों का चयन करने के लिए संभव है। अलग coelenterazines (जंगली प्रकार, एच, एन) अलग aequorins 17 के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, जब ठीक ट्यूनिंग हासिल की है। सीए 2 इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति का उपयोग बड़े पैमाने पर है, जबकि हालांकि, bioluminescence की निगरानी सीधा नहीं है और गिनती फोटोन कैमरे की आवश्यकता हो सकती है। सौभाग्य से, aequorinजांच, यहां इस्तेमाल एक तरह, सह-एक्सप्रेस के लिए सुधार किया गया है GFP 18 अधिक फोटोनिक उत्सर्जन जारी करने में सक्षम हैं, उन्हें और अधिक स्थिर बनाने और GFP जुड़े प्रतिदीप्ति द्वारा कोशिकाओं की साधारण पहचान की अनुमति। न्यूरॉन्स में bioluminescence इमेजिंग में सफलता का इस्तेमाल फोटॉन गिनती कैमरे की दक्षता पर भी माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित जांच के अभिकर्मक की क्षमता पर ही नहीं निर्भर करता है। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के मामले में, एक साधारण रासायनिक अभिकर्मक एक उच्च संवेदनशील फोटॉन गिनती कैमरा उपलब्ध है, बशर्ते कि काम कर सकते हैं। संस्कृति हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में उज्ज्वल क्षेत्र, GFP प्रतिदीप्ति और युवा और वृद्ध की bioluminescence छवियों के 2 से पता चलता उदाहरण चित्रा। इसके अलावा माइटोकॉन्ड्रियल में बढ़ जाती हैं दिखाया [सीए 2 +] ट्रांसफ़ेक्ट हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में दर्ज NMDA द्वारा प्रेरित किया। NMDA का प्रभाव युवा न्यूरॉन्स की तुलना में वृद्ध सभ्य न्यूरॉन्स में ज्यादा बड़ा है कि नोटिस। अन्य मामलों में, transfec की दक्षताtion के वायरस व्युत्पन्न वैक्टर 16,18 का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन आधारित, subcellular सीए 2 जांच शरण ट्रांसजेनिक चूहों का विकास शायद यह भी विवो में, भविष्य के दृष्टिकोण के लिए एक उभरते विकल्प है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Culture Medium Gibco 21103-049
HBSS medium Gibco 14170-088
Ham's F-12 medium Gibco 31330-038
DNase I (from bovine pancreas) Sigma D5025-15KU
Fetal Bobine Serum Lonza DE14-801E
B27 Gibco 17504-044
Gentamicin Gibco 15750
L-glutamine Gibco 25030-032
12 mm glass coverslips Labolan 0111520/20012
Papain Worthington LS003127
4-well multidish plaques Nunc 176740
Petry dishes JD Catalan s.l. 2120044T
Sterile pipettes Fisher Scientific 431030
Fura2-AM Life Technologies F1201
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-027
Coelenterazine n Biotium BT-10115-2250 uG
Digitonin Sigma D5628
NMDA Sigma  M3262
Glycine Sigma 50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system EXFO
ORCA ER fluorescence camera Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera Hamamatsu
VC-8 valve controller Warner Instruments
SH-27B heating system  Warner Instruments
Aquacosmos Software Hamamatsu Photonics

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 106 excitotoxicity NMDAR साइटोसोलिक कैल्शियम माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स
Subcellular सीए की प्रतिदीप्ति और bioluminescence इमेजिंग<sup&gt; 2 +</sup&gt; वृद्ध hippocampal न्यूरॉन्स में
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Calvo-Rodríguez, M.,… More

Calvo-Rodríguez, M., Villalobos, C., Nuñez, L. Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (106), e53330, doi:10.3791/53330 (2015).

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