Introduction
Une compréhension approfondie des voies de signalisation nécessite des connaissances détaillées sur l'interaction ligand-récepteur. La plupart des méthodes d'évaluation de l'interaction d'un ligand particulier avec son récepteur spécifique sont chers, beaucoup de temps, de main - d'œuvre et nécessitent des équipements et de l' expertise 1 spécifique.
Cet article décrit deux protocoles rapides et fiables point par point pour étudier l'interaction ligand-récepteur basé sur une enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): le ligand-récepteur directe interaction dosage (LRA) et la LRA de la concurrence. ELISA est une technique très sensible, spécifique et facilement disponibles, couramment utilisés dans presque tous les laboratoires. ELISA peut être réalisée et adaptée de diverses façons. Les protocoles présentés sont optimisés pour l'étude de l'interaction entre les différents interférons lambda (de INFLs) et leur récepteur.
La LRA directe permet une quantificatile ligand de liaison au récepteur par rapport à la concentration de ligand et on obtient ainsi une courbe de liaison. En utilisant un modèle approprié pour l'interaction ligand-récepteur, les données peuvent être analysées pour estimer la constante de dissociation (K D).
Dans le protocole présenté, l'équation de Hill couramment utilisée est appliquée au modèle de la liaison ligand-récepteur. Bien que d' autres méthodes telles que la technologie de résonance plasmonique de surface 2,3 permettent de déterminer les affinités de liaison entre les deux protéines, cette technologie est souvent un travail intensif, coûteux et nécessite un équipement de laboratoire spécial.
La LRA de la concurrence permet le criblage de peptides inhibiteurs: La liaison ligand-récepteur est quantifiée par rapport à la concentration de peptide. On obtient ainsi une courbe dose-réponse décrivant l'effet inhibiteur du peptide. Les données peuvent être analysées pour estimer la concentration inhibitrice à demi maximale (IC50
Les deux protocoles ELISA sont faciles à utiliser et peuvent être adaptés à un large éventail de questions de recherche. Les protéines recombinantes de toute nature peuvent être utilisés pour déterminer de manière fiable et rapide des pièces d'interaction. En outre, la LRA de la compétition peut être utilisée pour déterminer des sites d'interaction critiques des ligands et des récepteurs en utilisant des peptides de blocage, qui sont conçus pour simuler le ligand ou le récepteur. Si le peptide bloquant montre l'inhibition efficace et spécifique, le peptide occupe un site critique de l'interaction du ligand (si le peptide imite le récepteur) ou du ligand (si le peptide imite le ligand).
Le premier protocole décrit la détermination de la valeur K D de différents INFLs et la sous - unité alpha de leur récepteur, soit le récepteur de l' interleukine-28 (IL28RA) en utilisant la LRT directe. Ensuite, le second protocole indique comment déterminer la capacité d'un peptide long de 20 acides aminés àinhiber les interactions Infl-IL28RA. Le peptide a été conçu pour rivaliser avec IFNLs à leur site de liaison du récepteur et permet ainsi une bonne compréhension de l'interaction moléculaire. En outre, ce peptide peut être utilisé pour bloquer IL28RA dans des expériences in vitro pour déterminer l'impact sur les effets de signalisation en aval 4.
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Protocol
1. Préparation des réactifs
- Pour préparer un tampon de revêtement de carbonate, on dissout 0,36 g de Na 2 CO 3 et 0,84 g de NaHCO3 dans 100 ml d'eau distillée; filtre stérile le tampon en utilisant un vide poussé de 0,22 um polyéthersulfone (PES) filtre à membrane et stocker à température ambiante jusqu'à utilisation.
- Préparer une solution de lavage par addition de 0,05% v / v de Tween 20 dans du tampon phosphate salin (PBS).
- Préparer un 5% de sérum albumine bovine (BSA) (solution de blocage) dans une solution de PBS en dissolvant 5 g de BSA (≥98%) dans 100 ml de PBS et conserver à 4 ° C.
- Recombinant Receptor, Ligands et Peptides de blocage
- Reconstitutethe sous-unité recombinante humaine récepteur de l'interleukine alpha (IL28RA) et ligands His-tagged recombinantes d'IFN humain (IFNL1-3) selon les instructions et magasin du fabricant à -80 ° C. Synthétiser peptides bloquants et utilisé comme décrit précédemment 4. Utiliser du PBS pour préparer diverses concentrations de ligands et des peptides destinés à être utilisés dans les essais.
- Pour préparer l'anticorps primaire, diluer 6x son anticorps monoclonal de souris dans du PBS avec 0,1% de BSA à 1: 1000 dilution. Pour préparer l'anticorps secondaire, on dilue la peroxydase de raifort (HRP) conjugué chèvre anti-souris IgG (H + L) dans du PBS avec 0,1% de SAB à 1: 10 000 dilution.
- Préparer une solution de TMB en mélangeant les réactifs A et B selon les instructions du fabricant.
- Préparer une solution d'arrêt en ajoutant 5 N d' acide sulfurique (H 2 SO 4) dans l' eau distillée et conserver à la température ambiante.
2. immuno-enzymatique (ELISA Assays)
NOTE: L'interaction ligand-récepteur ELISA direct (LRA directe, figure 1) peut être utilisé pour mesurer la dissociation du récepteur-ligand constante (K D), en tant que mesure de l'affinité de liaison au récepteur-ligand. L'interaction compétition ligand-récepteur ELISA (compétition LRA, Figure 2) toutOWS criblage de peptides (et d'autres composés bloquants), qui agissent de manière à interférer avec l'interaction entre le ligand et le récepteur. Le protocole de base qui a été précédemment publié 5 a été optimisée.
NOTE: Dans les deux ELISA méthodes utilisent une pipette multicanaux pour ajouter des solutions aux puits de plaque de 96 puits dans chaque étape. Dans transvaser de solution ou des étapes de lavage, jeter les solutions directement dans l'évier.
- Direct ligand-récepteur-Interaction Assay (LRA direct)
NOTE: Pour une illustration du flux de travail (voir la figure 1).- Plaque de revêtement avec récepteur recombinant
- On dilue le récepteur recombinant dans un tampon carbonate à une concentration finale de 100 ng / ul. puits Manteau de 96 puits microplaque avec la concentration du récepteur fixe (100 ng / ul) par pipetage 100 pi à chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux. Exclure les murs extérieurs de la plaque pour éviter ainsi l'artefact de pointe. Couvrir la plaque avec un couvercle et laisser incuber laplaque à 4 ° CO / N.
- L'addition de blocage et Ligands
- Le lendemain, retirer la solution de revêtement en inclinant la plaque contre l'évier et laver la plaque 3 fois avec une solution de lavage (PBS + 0,05% v / v de Tween 20).
- Bloquer les sites de liaison aux récepteurs libres dans la plaque revêtue en utilisant 200 pi de solution de BSA à 5% à chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux et incuber la plaque pendant 2 heures à la température ambiante.
- Jeter la solution de blocage (voir l'étape 2.1.2.1.) Et laver la plaque 3 fois avec une solution de lavage.
- Préparer la recombinante marquée par His ligands à des concentrations différentes (par exemple, 8 pg / ml, 4 ng / ml, 2 pg / ml, 1 pg / ml, 0,5 pg / ml, 0,25 pg / ml, 0,125 ng / mL, 0,063 pg / ml 0,031 ug / ml, 0,0 pg / ml) dans du PBS. Ajouter seulement PBS dans les puits vides.
- Ajouter 100 ul de chaque concentration de ligand dans les puits en double et on incube la plaque pendant 2 heures à température ambiante permettant de récepteur-ligandinteraction.
- Incubation avec des anticorps
- Après incubation avec les ligands, laver la plaque 3 fois avec une solution de lavage.
- Introduire à la pipette 100 ul d'anticorps anti-His solution primaire monoclonal de souris d'anticorps (1: 1000) dans chaque puits.
- Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 h; après incubation, jeter la solution d'anticorps (voir étape 2.1.2.1.) et laver la plaque 3 fois avec une solution de lavage.
- Ajouter 100 ul de HRP de chèvre couplés solution d'anticorps secondaire anti-IgG de souris (1: 10000) dans chaque puits. Laisser incuber la plaque pendant 45 min à température ambiante.
- Jeter la solution d'anticorps (voir étape 2.1.2.1.) Et laver la plaque 3 fois avec une solution de lavage.
- Ajout du substrat et le développement
- Apporter les solutions de substrat TMB à la température ambiante et préparer TMB solution substrat A et B au rapport 1: 1. Ajouter 100 pi fraîchement préparés substrat à chaque puits et maintenir la plaque à température ambiante pendant 15-30 min. Après col suffisante ou le développement ajouter une solution d'arrêt de 50 pi.
- La lecture de la plaque et analyse des données
NOTE: Le protocole décrit est basé sur l'hypothèse que le signal mesuré augmente de liaison spécifique. Il pourrait être nécessaire d'estimer la contribution de la liaison non spécifique au signal, mais cela est hors de la portée de ce protocole.- Lire l'absorbance (densité optique, OD) directement à 450 nm.
- Soustraire le signal de fond à partir des valeurs de DO mesurées et les normaliser. Transformer toutes les valeurs de la concentration de ligand à l' échelle logarithmique (base 10, log 10).
- Terrain normalisé et le fond corrigé des valeurs de DO (axe Y, correspond à la fraction des sites occupés de liaison au récepteur) par rapport au logarithme de la concentration de ligand (axe X, log 10 échelle).
- Pour estimer la valeur K D, ajuster les données à la forme de l'équation de Hill suivante:
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NOTE: Ici Y représente la fraction des sites occupés des récepteurs de liaison et Y max la liaison de maximale; [L] désigne la concentration en ligand libre et le coefficient de Hill. S'il n'y a qu'un seul site de liaison pour le ligand, le coefficient de Hill est n = 1. Pour les systèmes avec le site de liaison plus d'un ligand, la présente liaison coopérativité positive si n> 1, coopérativité négative si n <1 et aucune coopérativité si n = 1. la constante de dissociation microscopique est appelée et correspond à la moitié maximale de CE50 concentration efficace 6. La constante de dissociation apparente Kd = a (K D) n. Dans le cas le plus simple où n = 1, la dissociation constante correspond à la concentration de ligand à laquelle la moitié des sites de liaison des récepteurs sont occupés et Kd = Kd. Ce modèle suppose la liaison dans des conditions d'équilibre, ainsi que seule une petite fraction d'action de massele ligand ajouté est lié au récepteur, à savoir, [L] >> [RL].
- Plaque de revêtement avec récepteur recombinant
Figure 1. Direct ligand-récepteur-interaction dosage (LRA direct). Protocole étape par étape pour la LRA direct. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Concurrence Ligand-Receptor-Interaction Assay (Concours LRA)
NOTE:. Pour une illustration du flux de travail voir Figure 2 La procédure de concurrence de la LRA suit les mêmes étapes que la LRA directe (revêtement de la plaque, l' anticorps d' incubation, le développement de la plaque) , sauf pour des changements importants dans le ligand et peptides étape d'addition. contrôles négatifs appropriés sont essentiels pour ce dosage. Dans une étude de dépistage précédente <sup> 4, le peptide bloquant brouillé n'a pas montré d' effets antagonistes.- Blocage - Ajout de Ligands et Peptides de blocage
- Le lendemain, retirer la solution de revêtement et laver la plaque (voir 2.1.2.1).
- Bloquer la plaque revêtue par addition de 200 pl de solution de BSA à 5% à chaque puits et on incube la plaque pendant 2 heures à température ambiante.
- Préparer les ligands recombinantes His-tagged (IFNL1-3) à une concentration fixe (2x-20 ng / ml) dans du PBS.
- Préparer le peptide de blocage (voir tableau 3) à différentes concentrations allant de 10 nM à 100 pM dans du PBS pour garantir une courbe dose-réponse.
REMARQUE: Cela permet une détermination ultérieure de la valeur de CI50 pour le peptide de blocage. Dans les puits témoins, ajouter la concentration de ligand ne fixe sans peptide pour obtenir le maximum (100%) de liaison. Dans l'ébauche, ajouter seulement PBS sans ligand ou peptide. - Ajouter 50 ul des ligands (IFNL1-3) et 50 ul de chaque peconcentration ptide aux puits en double.
- Incuber la plaque pendant 2 heures à température ambiante.
- La lecture de la plaque et les données d'analyse
NOTE: Le protocole décrit est basé sur l'hypothèse que le signal mesuré augmente de liaison spécifique. Il pourrait être nécessaire d'estimer la contribution de la liaison non spécifique au signal, mais cela est hors de la portée de ce protocole.- Lire l'absorbance (densité optique, OD) directement à 450 nm.
- Soustraire le signal de fond à partir des valeurs de DO mesurées et les normaliser. Transformer toutes les valeurs de la concentration de peptide à l' échelle logarithmique (base 10, log 10).
- Terrain normalisé et le fond corrigé des valeurs de DO (axe Y, correspond à la fraction des sites occupés de liaison au récepteur) par rapport au logarithme de la concentration de ligand (axe X, log 10 échelle).
- Pour estimer la valeur IC 50, ajuster les données à l'équation suivante:
Remarque: ici [P] est la concentration du peptide et la pente de Hill. La pente de Hill décrit la pente de la courbe dose-réponse. L'IC 50 correspondant à la concentration d'inhibiteur à laquelle 50% d' inhibition de la liaison entre le ligand et le récepteur est observée.
- Blocage - Ajout de Ligands et Peptides de blocage
Figure 2. Concurrence ligand-récepteur interaction test (compétition LRA). Protocole étape par étape pour la compétition LRA. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Representative Results
Les constantes de dissociation entre INFL1-3 et de leur sous-unité du récepteur alpha IL28RA ont été déterminées par la LRA directe. Les résultats sont présentés sur la figure 3: La fraction des sites de liaison occupés est tracée en fonction du logarithme de la concentration d' IFN respectif. L'intrigue Scatchard des données est affiché dans le coin inférieur droit. Les résultats montrent que la LRA directe donne une courbe de liaison, qui peut encore être analysé pour estimer la valeur K D. La valeur Kd a été déterminée en ajustant les données à l'équation de Hill (équation 1).
IFNL1 a une affinité de liaison la plus élevée, suivie par IFNL2 et IFNL3. Le coefficient de Hill n> 1 suggère une affinité pour des ligands supplémentaires a augmenté après l'interaction ligand-récepteur initial (voir Discussion). Les constantes de dissociation estimées et les coefficients de Hill sont résumés dans le Tableau 1.
Compétitif LRA a été utilisé pour quantifier l'impact d'un peptide bloquant l'interaction entre IFNL1-3 et IL28RA (figure 4). La fraction des sites de liaison occupés, pour une concentration de ligand de 10 ng / ml est tracée en fonction du logarithme de la concentration des peptides. Pour estimer les valeurs IC 50, les données est monté à l' équation 2.
Le peptide inhibe le blocage de l'interaction entre IFNL3 et IL28RA (CI50 = 0,26 pM) dans toute la mesure. L'IC 50 est deux fois plus élevé pour l'interaction IFNL2-IL28RA (IC 50 = 0,50 uM) et un ordre de grandeur plus élevé pour l'interaction IFNL1-IL28RA, indiquant le peptide a été moins efficace à perturber les interactions IFNL1-IL28RA. Les déterminés IC 50 valeurs et pentes Hill sont résumés dans le tableau 2.
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> l' analyse des données est essentielle pour la compréhension de l'interaction ligand-récepteur Les résultats présentés ont été générés à l' aide d' un logiciel graphique scientifique tels que GraphPad PRISM Pour la détermination de la valeur K D.. , les données ont été monté sur le 'Un site - liaison spécifique avec la pente de Hill'. (. correspond à l' équation 1 à Sec 2.2.1) pour la détermination IC 50 de valeur, les données est monté dans le journal de la fonction '(inhibiteur) vs . réponse normalisée -. pente variable '(. voir équation 2 dans Sec 2.2.2) Toutefois, un logiciel pour l'analyse de régression non linéaire peut être utilisé.
Figure 3. Résultats du test ligand-récepteur directe (LRA direct). Les courbes de liaison pour la liaison de IFNL1 (vert), IFNL2 (rouge) et IFNL3 (bleu) à IL28RA. La parcelle Scatchard respective en bas à droitecoin suggère co-opérativité positif de la liaison. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Résultats de l'essai ligand-récepteur compétitif (LRA compétitive). Des courbes dose-réponse présentant une inhibition de la liaison de IFNL1 (10 ng / ml, vert), IFNL2 (10 ng / ml, rouge) et IFNL3 (10 ng / ml, bleu) à IL28RA par le peptide de 20 aa. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: Estimation des constantes de dissociation (K D) Et les coefficients de Hill de IFNL1-3 se liant à IL28RA. L'erreur standard (SE) est donnée pour une taille de quatre répétitions par point de données de l' échantillon.
. Tableau 2: Estimation de la moitié des concentrations maximales d' inhibition (CI50) des peptides de blocage et la pente de Hill de la courbe dose-réponse pour la liaison de IFNL1-3 à IL28RA La concentration d' IFN est de 10 ng / ml. Le nombre de répétitions est de trois.
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Discussion
ELISA est une norme et une méthode bien établie pour de nombreux laboratoires. Nous avons en outre modifié et amélioré une méthode publiée précédemment 5,7. Le protocole montré étape par étape montre comment il peut être utilisé d'une manière simple pour déterminer les valeurs Kd interactions ligand-récepteur. En outre, la CI50 d'un peptide de blocage qui interfère avec l'interaction ligand-récepteur peut être déterminée.
Les principaux avantages sont la configuration rapide, la facilité de préparation de réactifs et de manipulation familier, comme la plupart des chercheurs ont utilisé un protocole ELISA avant. Le protocole LRA directe est très flexible et peut être adapté pour mesurer de nombreuses interactions protéine-protéine. Les protéines recombinantes avec His6- ou alternatives tag doivent être utilisés en tant que partenaire de liaison à un partenaire immobilisé. La LRA de la concurrence peut être exploitée comme un outil de dépistage pour (i) déterminer le potentiel inhibiteur de blocage des composés (peptides, anticorps, ou un petit molecules) et (ii) déterminer les sites d'interaction critiques en utilisant des peptides de blocage conçus pour imiter le récepteur ou le ligand.
Des contrôles négatifs sont indispensables pour une interprétation correcte des essais présentés. Dans une étude de dépistage précédente 4, la séquence embrouillée du peptide bloquant utilisé n'a pas montré d' effets antagonistes. Cependant, d'autres peptides ont montré une capacité de blocage aussi après brouillage, probablement en raison des interactions électrostatiques non spécifiques.
Une limitation potentielle est que cet essai reflète une situation in vitro. En particulier, les récepteurs hétérodimères forment souvent une structure plus complexe. Il est impossible de distinguer si le ligand se lie au récepteur seulement ou que le ligand active également le récepteur en provoquant un changement de conformation ou d'une dimérisation, ce qui entraîne à son tour un signal intracellulaire. Dans l'essai présenté, nous avons utilisé un récepteur recombinant, qui est immobilized à une phase solide. Cette configuration ne fonctionne pas pour tester l'activation ou pour étudier l'interaction des récepteurs qui requièrent l'environnement membranaire ou du cholestérol membranaire tels que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). En outre l'utilisation de la protéine recombinante soulève des mises en garde. Par exemple, la structure tertiaire de pliage et d'une protéine recombinante peut être différente par rapport à une situation in vivo. La liaison du ligand et le récepteur se produit habituellement à la température ambiante, mais chez les humains, la température optimale serait de 37 ° C. Enfin, l'utilisation du ligand recombinant commercial et le récepteur peut se révéler coûteux. Malgré ces limites, ces deux protocoles ELISA montrent un potentiel pour explorer rapidement l'interaction ligand-récepteur.
Les résultats présentés montrent que IFNL1 a une affinité légèrement plus élevée pour IL28RA par rapport à IFNL2, et l'affinité de IFNL3 est trois fois inférieure à IFNL2. Ceci est remarquable compte tenu de la similitude entre IFNLs. IFNL1 et IFNL2 differ à 33 acides aminés tandis que IFNL2 et IFNL3 ne diffèrent que par sept acides aminés 8. L'interaction entre IL28RA et IFNLs implique Helix A et AB en boucle IFNL 9. L' alignement des séquences montre quatre IFNL différences significatives dans l' hélice A et la boucle AB et entre IFNL1 IFNL3 (figure 5A). On affecte le pont de sel Arg54-Glu119. Les résidus d'acides aminés dans cette section sont énumérés selon l'UniProt entrées Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) et Q8IU57 (IL28RA), qui a été trouvé dans la structure cristalline de la IFNL1-IL28R1 complexe (Figure 5B). Alignement structurel montre que Arg57 dans IFNL1 est remplacé par Lys57 dans INFL3, qui est également capable de former un pont de sel avec Glu118 (figure 5C). Conformément à la diminution de l' affinité des IFNL3 et IL28RA, calcul 10,11 et mutationnelle 12 analyses montrent que les ponts de sel Lys-Glu sont en général moins stables que Arg-Glu salt ponts.
Cependant, les différences dans l'hélice A ne peuvent expliquer de façon satisfaisante l'affinité inférieure de IFNL3, étant donné que la séquence d'acides aminés de l'hélice A est identique pour IFNL2 et IFNL3. On pense que la principale différence provient des mutations dans la boucle AB, où arg74 et His76 dans IFNL2 sont remplacés par Lys70 et Arg72 dans IFNL3 8.
De plus, les différences dans la stabilité et la solubilité entre IFNLs peuvent également influer sur le résultat du test. Étant donné que le dosage direct LRA utilise des concentrations de nM à M et la concentration physiologique de cytokines dans le sérum se situe dans la gamme pM à nM, l'agrégation des IFNL ne peut être exclue. On peut supposer que la coopérativité positive observée de l'IFN liaison est provoquée par une augmentation spécifique ou non spécifique en liaison ligand-récepteur, par exemple une dimérisation du récepteur IL28RA recombinant dans une solution ou une liaison d'un second ligand ou un fragment de ligand avec une affinité élevée. However, d'autres études sont nécessaires pour vérifier cela.
Le peptide bloquant utilisé dans les synoptiques de la LRA de la concurrence AB boucle de IFNL3 (Figure 6). Comme décrit précédemment, l'AB-boucle joue un rôle essentiel dans l'interaction entre IFNLs et IL28RA 9, en particulier IFNL2 et IFNL3. La modélisation d'homologie de IFNL3 avec la structure cristalline IL28RA / IFNL1 montre que la région, qui correspond au peptide de blocage se trouve à proximité spatiale à proximité de l'interface d'interaction avec IL28RA (figure 6). Supposé que les blocs de peptide de l'interaction de la boucle AB et de IFNL IL28RA. Les résultats de l'appui compétition LRA ceci: Le peptide a un effet inhibiteur sur la liaison de tous IFNLs, cependant, le peptide est un inhibiteur plus efficace de l'interaction entre IL28RA et soit IFNL3 ou IFNL2 que de l'interaction des IFNL1 et IL28A. Comme on s'y attendait, les blocs de peptides de la liaison de IFNL3 plus efficace puisqu'iloccupe exactement la même poche de liaison que l'AB en boucle IFNL3.
Comme on le voit dans le tableau 3, les boucles AB et de IFNL1 IFNL2 alignés sur les peptides de blocage diffèrent. En accord avec la valeur de CI50 inférieure du peptide pour l' inhibition de l'interaction IFNL1 / IL28RA de douze acides aminés diffèrent entre IFNL1 et le peptide alors , et seulement deux acides aminés diffèrent entre IFNL2 et le peptide. Cela indique qu'il ya légèrement différents modes de liaison pour l'interaction entre les AB-boucles des IFNLs et IL28RA et prédit que des peptides qui imitent IFNL1 seraient plus efficaces pour bloquer l'interaction entre IFNl1 et IL28RA que l'interaction entre IFNL3 et IL28RA.
En outre, le peptide est globalement chargé positivement (quatre arginine et deux résidus de lysine mais seulement deux résidus aspartate) et l'analyse computationnelle montre que le peptide n'a pas de motifs secondaires définis. En raison de sa spiralé, flexible structure le peptide peut également se lier à d'autres régions du récepteur. Cela pourrait bloquer les résidus de glutamate et aspartate , tels que D118, qui forme un pont de sel pour stabiliser le complexe ligand-récepteur (figure 5B et 5C).
Figure 5. Comparaison structurelle des IFNL1 (vert) et IFNL3 (bleu). Les atomes d'oxygène sont indiqués en rouge, des atomes d'azote sont en bleu. (A) Superposition du IFNL1 IL28RA lié et IFNL3 (IL28RA non représenté). L'écart quadratique moyen (RMSD) de tous les atomes alignés est 0,672 Å. chaînes de IFNL3 secondaires qui diffèrent de IFNL1 sont mis en évidence dans la lumière rose. Pont (B) Sel entre Arg54 et D118. (C) IFNL3 aligné à IFNL1 IL28RA lié (IL28RA apparaît en gris). L'alignement montre que le sel bri Arg-Gludge est probablement remplacé par un moins stable Lys-Glu, un sel-pont entre Lys57 et D118. PyMol a été utilisé pour la préparation des chiffres et pour l'alignement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Alignement des IFNL3 et IFNL1-IL28RA complexe (IFNL1 non représenté). IFNL3 est en bleu et le IL28RA en gris. Les régions correspondant aux peptides de blocage sont mis en évidence en violet. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 3:
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
