Aquí describimos un procedimiento para estudiar tejidos vegetales fracturados por congelación. Las muestras de hojas congeladas a alta presión se fracturan por congelación y se recubren de doble capa, lo que produce muestras congeladas hidratadas bien conservadas que se obtienen mediante el microscopio electrónico de criobarrido a grandes aumentos con un daño mínimo del haz.
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Artículo de método
El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido
En este artículo
Resumen
Resumen
microscopía electrónica de Cryo-barrido (SEM) de las muestras de congelación-fractura permite la investigación de estructuras biológicas en condiciones nativas cerca. A continuación, describimos una técnica para el estudio de la organización supramolecular de fotosintéticos membranas tilacoides () dentro de las muestras de hojas. Esto se consigue mediante la congelación de alta presión de tejidos de las hojas, congelación-fractura, recubrimiento de doble capa y, finalmente, formación de imágenes cryo-SEM. El uso del método de recubrimiento de doble capa permite la adquisición de gran aumento (> 100,000X) imágenes con daño haz mínimo para las muestras congeladas hidratado así como los efectos de carga mínimas. Utilizando los procedimientos descritos investigamos las alteraciones en la distribución del fotosistema supramolecular y proteínas antena captador de luz complejos que tienen lugar durante la deshidratación de la planta de la resurrección Craterostigma pumilum, in situ.
Introducción
fotosíntesis oxigénica, originarios de la antigua cianobacterias, fue heredado por las algas y las plantas de la tierra por los acontecimientos que llevaron a endosymbiotic desarrollo del cloroplasto. En todos los oxigénica fototrofas de hoy en día, el transporte de electrones fotosintética y la generación de la fuerza protón-motriz y el poder reductor se llevan a cabo dentro de las vesículas en forma de sacos aplanados denominadas membranas tilacoides ''. Estas membranas albergan los complejos de proteínas que llevan a cabo las reacciones impulsada por la luz de la fotosíntesis y proporcionan un medio para la transducción de energía. Las membranas de los til....
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Protocolo
1. Cryo-fijación de tejidos de hojas por medio de congelamiento de alta presión
Nota: En esta sección se describe cómo llevar a cabo la congelación de alta presión de los tejidos de las hojas para un experimento de congelación-fractura. Por consideraciones relacionadas con muestras de plantas ver 29. Esto se puede adaptar para otros tipos de tejidos o muestras con alguna modificación.
- El uso de la esquina de una hoja de afeitar, rayar la parte inferior de la cavidad de 0,1 mm de una plaqueta de aluminio 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Preparar al menos una docena de plaquetas (6 muestras). Tome la precaució....
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Resultados
La Figura 1 muestra imágenes Cryo-SEM de plaquetas que contienen congelados, trozos de hojas pumilum Craterostigma fracturadas por congelación de alta presión. En algunas muestras, grandes regiones de células fracturadas se obtienen (Figura 1A). En otros, la pieza de la hoja se mantiene fuertemente unido al disco superior y está derribado junto con él (Figura 1B). Sin embargo, incluso en el segundo caso, una parte del tejido de .......
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Discusión
La técnica descrita en este documento permite la investigación de las membranas de congelación-fractura en el contexto de los tejidos vegetales congelados de alta presión bien conservados mediante microscopía electrónica de crio-escaneo. La principal ventaja de la utilización de estos procedimientos es que la preparación de la muestra es puramente físico; no hay pasos que involucran productos químicos o la deshidratación son necesarios. Por lo tanto, permite el estudio de las estructuras biológicas en un estado casi nat.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a Andrés Kaech (Universidad de Zurich) por sus útiles consejos sobre el escaneo de imágenes de microscopía electrónica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de los Estados Unidos e Israel Binacional de Investigación Agrícola y Desarrollo (concesión no. US-4334-10, ZR), la Fundación de Ciencias de Israel (concesión no. 1034/12, ZR), y el Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). Se llevaron a cabo los estudios de microscopía electrónica en el Irving Moskowitz y Cherna Centro de Nano y Bio-Imaging Nano en el Instituto de Ciencia Weizmann.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Etanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| Isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadeceno | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 Plaquetas | Oficina de Ingeniería M. Wohlwend GmbH, Suiza | 241 | Las plaquetas son de 3 mm de diámetro y 0,5 mm de espesor (Tipo A) con cavidades de 0,1/0,2 mm de profundidad (de diámetro 2 mm). Se pueden obtener plaquetas similares de Leica Microsystems. |
| Pinzas de alta precisión | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Suiza) Pinzas estilo Durostar #5; Se puede sustituir por otras pinzas de alta precisión. |
| Máquina de congelación a alta presión | Bal-Tec | HPM 010 | Alternativas de congelación a alta presión: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| Sistema de congelación-fractura | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| Etapa de carga de preparación criogénica | Leica Microsystems | 16770228 | |
| Soporte de muestras para fractura por congelación universal | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Soporte de abrazadera para portadores de muestras de 3 mm |
| de diámetro Lanzadera de criotransferencia al vacío | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| Microscopio electrónico de barrido | Zeiss | Ultra 055 | |
| Etapa Cryo SEM | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| Software de adquisición de imágenes | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| Software de análisis de imágenes | Fiji/Image J, Instituto Nacional de Salud http://fiji.sc/Fiji |
Referencias
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Pro....
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Reimpresiones y permisos
