Summary
Med hjälp av patientgenererade tumörer i en subkutan preklinisk modell är ett utmärkt sätt att studera effekten av nya terapier, prediktiva biomarkörer upptäckt och läkemedelsresistenta vägar. Denna modell, i utvecklingsprocessen läkemedel är viktigt för att avgöra ödet för många nya cancerbehandlingar innan klinisk undersökning.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är en viktig bidragsgivare till dödsfall i cancer i USA. År 2015 fanns det uppskattningsvis 132,700 nya fall av CRC med 49.700 dödsfall 1. Även prognosen för patienter med lokaliserad sjukdom är utmärkt, patienter med avancerad sjukdom har dåliga resultat, vilket gör detta till en viktig prioritering i utvecklingen av nya terapier. Trots standardbehandling kemoterapeutiska regimer och nyare biologiska som distribueras mot denna sjukdom, har det bara varit en stegvis ökning i total överlevnad. Följaktligen finns det en betydande ansträngning för att förstå drivrutinsvägar involverade i att underlätta tumörtillväxt i denna sjukdom. Cancer Genome Atlas Network har nyligen identifierat ett antal huvudvägar som är inblandade i CRC dysreglering och inkluderar: WNT, fosfoinositid 3-kinas (PI3K), RAS, transformerande tillväxtfaktor-β (TGF β) och TP53 2. Tillsammans med undersökningar som beskriver othennes vägar som förstärker tillväxten i CRC har antänts utvecklingen av nyare behandlingar som syftar till att avsevärt förbättra överlevnaden i denna patientgrupp 3-5. Utnyttjar prekliniska modeller inom onkologi läkemedelsutveckling har varit avgörande i denna process för att förutsäga den kliniska aktiviteten av dessa nya föreningar.
Olika prekliniska modeller har använts i läkemedelsutvecklingen. Med tanke på att prekliniska transgena djurmodeller och odödliggjorda cellinjer har tappat målet att bestämma den kliniska aktiviteten av nya cancermedel, till stor del på grund av deras oförmåga att återspegla komplexiteten i mänskliga tumörer, har patient härlett tumör xenograft (PDTX) modeller fastställts. Den största fördelen med denna modell är att tumör heterogenitet förblir intakt och nära återspeglar de molekylära egenskaper och clonality av ursprungs patientens tumör 6-9. PDTX modeller ger ett utmärkt in vivopreklinisk plattform för att studera nya medel, läkemedelsresistens vägar, kombinatoriska strategier och cancer stamcellsbiologi 10.
En allmän översikt över PDTX process illustreras i figur 1. Den börjar i kliniken, samtyckande patienter för att tillåta en del av deras överskjutande tumörvävnaden som skall användas för denna forskning. Därefter, vid kirurgi, är en bit av tumören räknats av en patolog och tas i medier som skall transporteras till forskningspersonal. Omedelbart efter detta, är en sektion av tumören skärs i små bitar och transplanterades in i möss med immunbrist subkutant. När tumören växer, är det passe i olika generationer av möss för att bibehålla tumören 10. Typiskt, efter F3 generationen tumören kan utökas till en behandlingsstudie där nya föreningar och / eller kombinationsterapi utvärderas. Utnyttjar Next Gen Seq (exome Seq, RNA Seq och SNP array) potentiella prediktiva biomarkörer är upptäckaed att underlätta valet av patienter som kan drar nytta av en viss behandling.
De övergripande målen med att använda PDTX modeller är att: 1) utvärdera effekten av nya terapier som monoterapi eller i kombination och 2) identifiera prediktiva biomarkörer för känslighet eller motstånd före klinisk undersökning. I detta manuskript ger vi metodiken i initieringen och upprätthållandet av en CRC PDTX bank och ge fördelar och begränsningar av denna modell inom läkemedelsutveckling upptäckt.
Figur 1. Översikt över CRC PDTX Model protokoll. En patient härlett tumör tas emot från kirurgi och injicerades omedelbart i atymiska nakna möss subkutant. När tumören växer expanderas i kommande generationer och så småningom utvidgas för behandlingsstudier. behandling Responses bedöms och prediktiva biomarkörer identifieras som kan underlätta patientens val. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Patient härrör kolorektal adenokarcinom tumörprover erhölls från samtyckande patienter vid University of Colorado Hospital i enlighet med ett protokoll som godkänts av Colorado Multiple Institutional Review Board (08-0439). Alla djur arbete utfördes under djurprotokoll godkändes av University of Colorado Denver Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC, protokoll # 51.412 (06) 1E och 96813 (04) 1E).
1. Ta emot och förbereda patientblod
- Samla 1 - 2 ml blod i en blod / cellseparations rör innehållande natriumcitrat (rör faser som ingår är plasma, lymfocyter och monocyt band, densitetsgradient vätska, gel barriär och erytrocyter och neutrofiler). Försiktighet, följa blodburna Patogen riktlinjer med blod eller vävnad.
Obs: PBMC och plasma kan användas för framtida studier som kan omfatta: jämföra könsceller genetisk variation med tumör mutationer, isolera cirkulationsting tumörceller, utvärderar cell fritt DNA (cfDNA), undersöker proteiner och mikroRNA, etc. - Centrifugera blod / cellseparations röret vid 2500 xg under 15 min utan någon broms vid RT.
- Samla perifera mononukleära blodceller (PBMC i lymfocyt- och monocyt band av röret) och sattes i en 1,5 ml mikrocentrifugrör (klar, autoklaverbar, DNas, RNas, och pyrogenfria), och fyll till toppen av röret med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Centrifugera vid 2300 xg under 3 min vid RT för att bilda en pellet av PBMC på botten av röret. Därefter avlägsna supernatanten försiktigt. Tillsätt 1 ml steril PBS för att tvätta pelleten och centrifugera vid 3000 xg under 30 sekunder och sedan ta bort supernatanten.
- Använd en pipett för att samla in plasma från blod / cell separationsröret (i plasma fas av rör) i en 1,5 ml steril kryogen flaska (DNas och RNas gratis, ingen mänsklig DNA, endotoxin gratis) och sätta plasma och pellet av PMBC: s till en -80 ° C freezer för lagring.
2. Ta emot och förbereda patienttumörprov
- Förbered antingen RPMI eller DMEM-medium med 1: 100 (10%) av penicillin-streptomycin och icke-essentiella aminosyror, 1: 1000 (1%) Plasmocin, och 10% inaktiverat fetalt bovint serum (fullständigt medium) och tillsätt 20-25 ml till en steril uppsamlingskopp för tumörprov.
- Hämta tumörprov i en steril kopp innehållande komplett medium på is eller hålla vid 4 ° C.
Obs! Tumörprov är en bit av överskott patientens tumörvävnad som avlägsnas genom en kirurg, behandlas av en patolog, och placerades i en steril uppsamlingskopp med komplett medium. Försiktighet, följa blodburna Patogen riktlinjer med blod eller vävnad. Också idealiskt för att injicera fem möss, bör tumören vara cirka 1 cm. - Ta tumörprov till djuranläggningen för injektion i nedsatt immunförsvar möss.
Obs: Det är bäst att behandla tumörprovet så snart som möjligt.- I ett laminärt flöde huva, placera tumörprov i en steril plastskär maträtt från tumören koppen. Använda autoklaveras-liten sax och pincett för att skära in 10-12 ungefär 3 x 3 x 3 mm bitar och placeras i en autoklaverad 1,5 ml mikrocentrifugrör fylld med 300 ul av gelartade proteinblandningslösning. Håll röret på is.
- Som en prioritet injicerar tumör i möss, men om det finns någon tumör kvar, samla flash frysta flaskor (FF), formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) koppar, och en livskraftig tumör flaska.
- För FF, samla små bitar av tumörvävnad från en steril kryogen flaska för vidare analys, såsom protein, RNA, eller DNA-isolering. Placera FF omedelbart till en flytande kväve Dewar och lagra långsiktigt i en -80 ° C frys.
- För FFPE, om det finns tillräckligt med tumör, plats 3 små bitar i en 10 ml 10% formalin cup och processen i paraffininbäddade block när tumören har varit i formalin under minst 24 timmar.
Obs: 24 tim baserasrabatt på våra Histologi Kärn förslag 11. - Slutligen, placera kvarvarande tumör i en kryogen rör. Göra livsdugliga medier genom tillsats av 10% dimetylsulfoxid (DMSO) för att slutföra media. Därefter tillsätts 1 ml till en kryogen rör och lagra på is. Obs: Förvara inte på is under långa tidsperioder.
- Klipp någon överbliven tumör i små bitar som helst kommer att vara tillräckligt för 10 tumörer att injiceras i 5 möss i framtiden. Sedan placera livskraftiga tumör röret på is tills den kan placeras i en Isopropylalkohol frysning behållare (långsamt fryser tumören en ° C i taget) och placerades i -80 ° C frys för att säkerställa att tumörerna inte dör under frysningsprocess.
Obs! För långtidsförvaring tumörerna avlägsnas (efter 2 - 3 dagar) och placerades i en stor flytande kväve Dewar. Observera att viabla rören inte bör tillåtas att tina såvida den håller på att tas ut för att injicera i möss.
- Klipp någon överbliven tumör i små bitar som helst kommer att vara tillräckligt för 10 tumörer att injiceras i 5 möss i framtiden. Sedan placera livskraftiga tumör röret på is tills den kan placeras i en Isopropylalkohol frysning behållare (långsamt fryser tumören en ° C i taget) och placerades i -80 ° C frys för att säkerställa att tumörerna inte dör under frysningsprocess.
3.Injektion av Patient Derived tumörxenotransplantat
- Använd fem 6-8 veckor gamla manliga och / eller kvinnliga atymiska nakna möss (T-cell bristfällig) för varje enskild patients härlett tumör. Injicera totalt 10 tumörer (2 injektioner per mus) subkutant (SQ).
Obs: Den ursprungliga human tumör betecknas som F0 och sedan en gång injiceras i möss nästa generation är F1. Dessutom använder autoklave pincett, sax och trokarer för varje unik explantat. - Last bitar av tumör från den gelartade proteinblandningslösningen till autoklave 12 G trokarer och se till att tumören är helt trycks in i trokaren.
- I en steril huv med laminärt flöde, placera 5 möss i en anestesi låda som är ansluten till en isoflurananestesi maskin (började vid initial hastighet på 5% isofluran, 3-4% syre, och 2-3% isofluran för underhåll av anestesi) och kolfilter (absorberar överflödig gas).
Obs: En erfaren tekniker ska kunna utföra hela proceduren påen bur av 5 möss inom cirka 5 minuter totalt (ca 30 sek per mus). Därför ytterligare termisk stöd och ögon smörjning inte används i allmänhet. För mindre erfarna personer eller under träning, är det starkt rekommenderat att personer antingen utföra proceduren på mindre djur på en gång och / eller använda en uppvärmning pad / ögon smörjning under proceduren om djur ska bedövas längre än 5 minuter. Förfarandet bygger på IACUC standarder på vårt universitet.
- I en steril huv med laminärt flöde, placera 5 möss i en anestesi låda som är ansluten till en isoflurananestesi maskin (började vid initial hastighet på 5% isofluran, 3-4% syre, och 2-3% isofluran för underhåll av anestesi) och kolfilter (absorberar överflödig gas).
- Nyp en mus tå för att se till att musen inte längre svarar, sedan ta musen ur isofluran rutan. Placera musen på en ren område att injicera tumörer på mitten rygghalsregionen och skjuta troakaren ner subkutant tills flanken regionen nås med autoklave 12 G trokarer.
- Leverera en tumör subkutant till varje sida av musens flank. Nyp tumören när trokaren dras ut, se till att tumören kvar i det önskade flankregionen. gElatinous proteinblandning hårdnar med musens kroppstemperatur och kapslar tumören för ungefär en vecka för att hjälpa tumören att växa och fäst den SQ bindväv. Lesionen som gjorts av trokaren är inte större än 4 mm, och det finns inget behov av att stänga huden med häftklamrar.
Obs: Våra veterinärer bestämdes ingen lutningen behov baserat på mycket begränsade storleken på skadan, (minskar mitt rygghalsregionen någon hud spänning eller trimning av skada) snabb läkning tid, inga infektioner noterades, och noggrann övervakning av djuren under denna tidsperiod .
- Leverera en tumör subkutant till varje sida av musens flank. Nyp tumören när trokaren dras ut, se till att tumören kvar i det önskade flankregionen. gElatinous proteinblandning hårdnar med musens kroppstemperatur och kapslar tumören för ungefär en vecka för att hjälpa tumören att växa och fäst den SQ bindväv. Lesionen som gjorts av trokaren är inte större än 4 mm, och det finns inget behov av att stänga huden med häftklamrar.
- Innan musen är helt vaken injicera Meloxikam 2 mg / kg SQ (smärtstillande) från platsen för tumörinjektion. Därefter placera musen i buren och övervaka tills musen är vaken och flytta.
Obs: Lämna inte återhämtar sig djur utan uppsikt tills den är helt vaken. Meloxicam Doseringen är baserad på IACUC standarder på vårt universitet.- Därefter upprepa samma procedur med fyraåterstående möss och övervaka deras andning.
Obs: Observera att detta är en mycket snabb procedur och möss vakna upp mycket snart efter Meloxicam injektion, men justera isofluran som behövs. Varje gång en mus tas ut, stänga ner isofluran. Den Meloxicam varar 24 timmar och skadorna från trokarer kommer helt läka i en vecka.
- Därefter upprepa samma procedur med fyraåterstående möss och övervaka deras andning.
4. Underhåll av patient Derived Tumör xenograft Bank
- Övervaka tillväxt och hälsa hos möss minst en gång per vecka. Använd ett kalkylblad (eller annat system för spårning) för att spåra tumörstorlekar, tumörgenerering, datum för tumörinjektion och hälsa hos möss.
Obs: Om möss har förlorat 15% av sin ursprungliga kroppsvikt, låg kropps skick poäng (≥ 2), har tumör sår, tumörer att nå 2000 mm 3 eller totala tumörer 3000 mm 3, eller sjuklig (böjd, kall, letargi, etc .) på något sätt, är möss avlivades via CO ^ eller sövda följt av cervikal dislokation som somecondary metod. Avliva via anestesi och halsdislokation om att samla tumör, annars möss avlivades via CO och halsdislokation. - När en tumör är ca 1,500-2,000 mm 3 söva möss såsom beskrivits ovan och sedan utföra halsdislokation att avliva.
- Kontrollera att musen har inga hjärtslag. Skära SQ tumören med autoklave sax och pincett.
OBS: Låt tumörer att växa upp till 1 år och om ingen tumör ses sedan avliva möss via CO2, följt av halsdislokation som en sekundär metod. - Passage bäst växande tumör in i nästa generation (aka en ny uppsättning av 5 möss). Använd instruktionerna ovan för att samla in 10 - 12 tumörer för passningar och sedan samla in överblivna tumör som också beskrivits ovan.
Obs: Samla många livskraftiga rör är mycket viktigt i de tidiga generationer (F1 - F8); därför samla flera livskraftiga rör, FF rör och ett FFPE per geneJon. - Håll återstående mössen tills en ny generation av möss har tumörtillväxt på cirka 300 mm 3. När återstående möss har tumörer som är stor, fortsätta att samla in som beskrivits ovan.
- Kontrollera att musen har inga hjärtslag. Skära SQ tumören med autoklave sax och pincett.
- Fortsätt till passagetumörer och samla i varje skede tills F15. Vid denna punkt, ta en livskraftig rör av den tidigaste generationen möjligt av flytande kväve och låt tö på is och följ tumör injicera procedurer som beskrivits ovan.
Notera: Tumörer som växer från livskraftiga rör tar längre tid att växa i möss jämfört med går från generation till generation, så ha det i åtanke när man planerar. Om inte längre behövs en viss PDTX modell som helst passage, avliva och samla tumör, för att säkerställa ett stort antal livskraftiga rör samlas för framtida bruk.
5. Utvecklings Therapeutics med patient Derived tumörxenotransplantat
Obs: De flesta tumörer på F3 generationen har goda tillväxt kinetik (växa snabbare och mer samarbetensistent), därför fortsätta att PDTX läkemedelseffektstudier.
- När den önskade tumören är mycket stor (1500 - 2000 mm 3), följ procedurerna ovan för att samla tumör att expandera till önskad mängd möss.
- Beroende på hypotesen som testas bestämma antalet tumörer som behövs per behandlingsgrupp.
Obs: 1 ml av geléform proteinblandning lösning kan ungefär passa 30 små tumörstycken (beroende på tumör morfologi) för injicering i möss.
- Beroende på hypotesen som testas bestämma antalet tumörer som behövs per behandlingsgrupp.
- Kontrollera möss med tumörer varje vecka och när de flesta tumörer är synligt små (ungefär mellan 50 till 300 mm ^) mäter tumörerna med passare för att bestämma tumörvolymen. Tumörvolymen = [width² (minsta mått) x längd (största mått)] x 0,52.
Obs: Den gelartade proteinblandningslösning omger de injicerade tumörstycken för en vecka, sedan efter en veckas tumörtillväxt kommer att vara korrekt. - Använd tumörvolymer mellan 50 - 300 mm ^ ochn genomsnitt vänster och höger tumörer. Då slumpmässigt in i behandlingsgrupper med 10 tumörer per grupp och en grupp i genomsnitt inom några siffror från varandra. Nästa, sortera mössen i grupper och börja den önskade behandlingsstudien.
- Dosera möss med läkemedel (schema beroende läkemedel), väga och mäta (tumör) två gånger per vecka. Vid slutet av studien, avliva möss via anestesi och halsdislokation och samla tumör för framtida farmakodynamiska analys i labbet.
Obs: Undersökningen varar i 30 dagar beroende på fordonstumörstorlek och hälsa hos möss.
6. Organisation av PDTX bank
- Håll en väl dokumenterad form för att förhindra upprepning av forskning och lämplig användning av djur.
OBS: Detta är nyckeln till en lyckad PDTX bank.- Använda kalkylark för att hålla reda på en tumör från den mänskliga patienten i kliniken, till möss i PDTX banken, behandlingar, data, och vilka uppsamlas. Obs: detta inkluderar frys, flytande kväve DewarsOch FFPE lagring samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Likheterna mellan vanliga mutationer i CRC PDTX modeller och TCGA
Vi undersökte om andelen gemensamma mutationer (KRAS de nationella regleringsmyndigheterna, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 och TP53) i CRC PDTX banken var representativ för mutationsfrekvensen ses i CRC patientgrupp. Såsom visas i figur 2A (TCGA) och B (CRC PDTX bank), frekvensen av mutationer i dessa gener var mycket lika mellan TCGA (n = 276 patienter) och CRC PDTX bank (n = 59 CRC-patienter). Den största skillnaden som observerades var i APC-genen, varigenom en 23% skillnad sågs. Dessa resultat tyder på att vanliga mutationer som observerats i CRC patientgrupp är väl representerat i CRC PDTX modellen.
Utvärdering av stabilitets- av behandlingssvar mellan olikagenerationer
I denna CRC PDTX modell, vi bestämde sig för att avgöra om behandlingseffekter var likartad mellan olika generationer. Tumörer utökades i atymiska nakna möss (10 tumörer / grupp) och effekten av standarden på vårdsmedel såsom cetuximab (0,4 mg / mus IP två gånger per vecka) och irinotekan (15 mg / kg IP gång per vecka) undersöktes i 4 unika CRC PDTX modeller i två separata generationer. Såsom illustreras i figur 3A och B, CRC026 (F3) var mer motståndskraftig mot behandling med cetuximab, medan CRC010 (F6) uppvisade behandlings känslighet. Liknande resultat observerades när dessa CRC explantat behandlades i olika generationer; CRC026 (F9) var resistenta och CRC010 (F7) var känslig för cetuximab. För att bestämma effekten av irinotekan i PDTX modell undersökte vi behandlingseffekter på tumörtillväxt i 2 CRC PDTX modeller. Medan CRC098 (F8) var resistenta mot behandling med irinotekan, CRC036 (F5) uppvisade känslighet (fig 3C och D). Som observerades med cetuximab, behandling med irinotekan i olika generationer inte ändra behandlingssvaret i dessa tumörer; CRC098 (F12) var resistent och CRC036 (F10) var känslig för irinotekan (Figur 3C och D). Även om tillväxt kinetik obehandlade tumörer var ibland annorlunda mellan generationerna, behandlingssvar till irinotekan och cetuximab förblivit densamma, vilket visar stabiliteten av denna modell för att utvärdera anti-cancerterapier.
Undersökning av Stroma Component i CRC PDTX Model
Därefter var vi intresserade av att bestämma om stroma komponenten inom denna CRC Explantation modell bestod av människor och / eller mus härledda celler. Vi använde en tvåfärgad Cot-1 FISH analys som bestod av musCot-1-DNA (grön fluorofor) och humant Cot-1-DNA (röd fluoroforen) för att bestämma mus och humana celler i 10 separata CRC explants mellan F0 och F1 generationer 25. Som visas i figur 4A, i F1-generationen mänskliga stroma ersättas med musen glatta eftersom den mänskliga tumören nu omgiven av alla mus stroma. Dessa fynd var uppenbar i alla 10 CRC explantat som utsattes för Cot-1 FISH mellan F0 och F1 generationer. Förutom Cot-1 FISK, undersökte vi proteinnivåer av mus- och human HGF och VEGF-ligander i F0 och F1 generationer med hjälp av mus och mänskliga ELISA för dessa ligander. Som visas i figur 4B och C, medan alla mänskliga härrör HGF i F0 generationen ersätts med mus HGF i F1-generationen bestod VEGF-liganden av både människa och mus i F1-generationen. Tillsammans dessa experiment tyder på att barnkonventionen PDTX musmodellen att musen stroma övertar mänskliga stroma i the F1-generationen och ligander utsöndrade kan variera med avseende på att vara människa och / eller mus härledd.
Figur 2. Jämförelse av gemensamma Mutationer i CRC PDTX Banken och TCGA. Vi observerade mycket likartade mutationsfrekvenser mellan TCGA (A) och CRC PDTX modellen (B) med avseende på KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 och TP53 . klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Effekterna av cetuximab och irinotekan Behandling på tumörtillväxt. (A) CRC026 visade resistens mot cetuximab när utvärreras i F3 och F9 generationer och (B) CRC010 uppvisade känslighet för cetuximab i F6 och F7 generationer. (C) CRC098 visade resistens mot irinotekan i F8 och F12 generationer, medan (D) CRC036 var känslig för irinotekan i F5 och F10 generationer. Varje datapunkt representerar ett genomsnitt av 10 tumörer per behandlingsgrupp. Möss behandlades med cetuximab (100 | j, l IP 400 | j, g / mus) två gånger i veckan och irinotekan (100 | j, l IP 20 mg / kg) doserades en gång i veckan. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Utvärdering av Mouse och tumörcellkomponenter i F0 och F1 generationer. (A) Dual-color fisk för mänsklig barnsäng-1 DNA (röd) och mus barnsäng-1 DNA (grön) användes för att undersöka skillnader mellan tumörer i F0 och F1-generationen. Human stroma (F0) ersätts med musen stroma (F1) i CRC098 och CR174 (skala = 20x). Nekrotiska celler identifierades genom minskad eller avsaknad av DAPI interkalering och röd fluorescens. Undersökning av mus och human HGF och VEGF-ligand uttryck genom ELISA (mus och mänskliga ELISA) mellan F0 och F1. (B) Human HGF ersattes med musen i F1-generationen och (C) människa och mus VEGF var uppenbart i F1-generationen (pikogram / ml [pg / ml]). Data presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den PDTX läkemedelsutveckling plattform erbjuder en förbättrad modell för bristerna i andra prekliniska modeller som är opålitliga i att förutsäga kliniska aktiviteten av nya föreningar. Viktigt, tumörer i denna modell är biologiskt stabil, behålla metastatisk potential, och uppvisar liknande läkemedel lyhördhet från generation till generation. I denna modell, är patienten härledda tumörer injiceras i atymiska nakna möss, passe, och därefter används vid terapeutisk utvärdering. Det finns flera viktiga steg för en lyckad PDTX bank som inkluderar: 1) en sammanhängande klinisk team för att identifiera / samtycke patienter och för att avlägsna och uppräkning av tumörvävnad för PDTX modellen och 2) en stark forskargrupp med utmärkt laboratorium och djur teknisk färdigheter för injicering av tumörer, organisation och underhåll av PDTX banken och övervaka hälsan hos möss. En stor fördel i våra PDTX modeller är att injicera tumörer med trokar förfarande. Den alternativa metoden för cutting en tumör ficka och sedan suturering eller använda hud klipp är mer tidskrävande för personalen, kräver mer smärtstillande för mössen, och övervakningen av suture eller sår klippt område. Troakaren förfarande kräver mindre utbildning, är mycket snabb, mössen är under narkos för mindre tid och mindre smärtstillande medel behövs. Därför, i vår erfarenhet injicera tumörer med trokarer är den bästa metoden kontra alternativa metoder. Dessa faktorer kommer att avsevärt påverka den totala framgången för den PDTX banken och i läkemedelsutvecklingsprocessen. Även om denna in vivo-modell är betydligt dyrare än att testa medel i cancer cellinjekulturer, PDTX modeller erbjuder en mer kliniskt relevant strategi testa onkologisubstanser.
I CRC PDTX bank, har vi fått 99 tumörprover som injicerades i atymiska nakna möss. Det fanns 68 av 99 (68,7% ta ränta) tumörer som växte i möss och har gått i flera generationer. Detfinns flera skäl till varför vissa tumörer som vi fått inte växa i möss. Till exempel, ibland fick vi endast mycket små bitar av vävnad som endast tillät oss att injicera i endast en mus minskar chanserna att etablera en tumör. En annan fråga var att vi ibland fick patientvävnad som var normalt och inte innehåller tumörceller tydliga på H & E slide. Dessutom kan en del dålig vävnadskvalitet bero på att ta emot redan necrosed tumör där det fanns en patient svar på behandlingen. Därför är det viktigt att ha en pålitlig kirurgisk och patologi laget när uppräkning tumören. Med tanke på några av dessa frågor har vi kunnat etablera ett av de största CRC PDTX banker fullt kommenterade tumörer med avseende på mutationer, genuttryck, och kliniska egenskaper, vilket gör detta en värdefull modell för utvärdering av nya terapier med det slutliga målet att förbättra behandlingsresultat.
Talrika biologiska och kombinatoriskaterapier har undersökts i denna modell med syfte att fastställa effektiviteten, läkemedelsresistensmekanismer, samt behandlingseffekter på cancerstamcellspopulation. Vår grupp har undersökt effekten av ett stort antal nya biologiska pathway inhibitorer använder denna preklinisk modell 12-18, som har gett värdefulla insikter i vidare kliniska utvecklingen av dessa föreningar. Många av dessa studier har identifierat prediktiva biomarkörer 12-14,17,18 som kan hjälpa i patientens val i framtida kliniska prövningar. Dessutom har andra studier bestämdes vidare mekanismer för behandling motstånd med hjälp av denna modell, som har lett till utvecklingen av rationella kombinationer 19-24. Till exempel, Bardelli och kollegor 19 visade att cetuximab behandling inducerad status förstärkning och att Met kan vara en bakomliggande mekanismen behandling motstånd mot cetuximab i CRC. 19 I en separat studie, Bertotti et al. 20identifierade Her2 som ett mål i CRC-tumörer som var resistenta mot cetuximab. Slutligen har vi och en annan grupp visat att behandling med en Notch väg inhibitor i kombination med irinotekan minskat CRC cancerstamcellspopulation och tumörrecidiv efter behandlingen avbröts 25,26. Sammantaget visar dessa studier visar den potentiella kraften i att utnyttja PDTX modeller i utvecklingsprocessen läkemedel som väsentligt kan påverka den fortsatta utvecklingen av nya föreningar.
Trots de stora fördelarna med användning av patient härledda tumörer för att bestämma effekten av nya föreningar, det finns flera begränsningar i denna modell. Såsom visas experimentellt i detta dokument, är den mänskliga stroma från ursprungs tumör (F0) ersätts med musen stroma i F1-generationen i CRC PDTX modellen. Beroende på den speciella läkemedelsmål, kan detta vara ett problem när mus-ligander är oförmögna att aktivera receptorn (erna) på humana tumörceller. för instance, visar vi att i F1-generationen, är HGF härrör från mus stroma och studier har visat att mus HGF är oförmögen att funktionellt aktivera humana c-Met-receptor 27,28. Som ett resultat, kan c-Met-hämmare inte uppvisar antitumörtillväxteffekter i dessa PDTX modeller. I själva verket har humaniserade HGF SCID-möss har utvecklats för att ta itu med detta potentiella problem 28. En annan nackdel med att använda subkutana tumörer är oförmågan att studera behandlingseffekter på den metastatiska potentialen av tumörer. Med hjälp av orthotopic modeller, även om mer tekniskt svårt att etablera och bildtumörtillväxt, kommer sannolikt att ge bättre insikt i behandlingseffekter på metastaser. En slutlig begränsning av denna modell är oförmågan att undersöka rollen av immunsystemet vid potentiering av tumörtillväxt och dess funktion i att underlätta resistens mot behandling. I och med utmärkt aktivitet av immunterapier nyligen visat på kliniken, med hjälp av immunodeficient möss förhindrar undersökning av immun riktade medel. Följaktligen har humaniserade musmodeller har utvecklats för att ta itu med dessa begränsningar, som kan ge värde för att förstå den grundläggande roll som immuntumör interaktioner samt möjliggör för undersökning av immunterapier i kombination med andra nya och godkända föreningar.
Sammanfattningsvis ger vi en metod för att utveckla och upprätthålla en CRC PDTX modell som är ovärderlig för att bestämma terapeutisk effekt, prediktiva biomarkörer och drogresistensvägar nya anti-cancermedel. Även om denna modell har inneboende utmaningar, är nyttan av denna modell som det nära rekapitulerar tumören heterogenitet den ursprungliga tumören, som erbjuder en mer exakt och kliniskt relevant undersökning av nya terapier före klinisk utvärdering. Framtida utvärdering av den kliniska effekten i läkemedelsutveckling av denna prekliniska PDTX modellen kommer i slutändan bestämma kraften i dettamodell för att förutsäga den kliniska aktiviteten av behandlingar i cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI or DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Non-essential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath |
| CPT blood tube | BD vacutainer | 362761 | |
| Microcentrifuge tube | Surelock | A-7002 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | |
| Cyrogenic vials | Cyroking | C0732901 | |
| Plastic tumor cutting dish | Trueline | TR4001 | |
| Scissors | Roboz | RS-5881 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (gelatinous protein mixture) | Corning | 354234 | Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT |
| 10% Formalin cups | Protocol | 032-059 | |
| Liquid Nitrogen Dewar Storage | Thermolyne | CY50900 | |
| Portable liquid nitrogen dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Freezing container: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Isopropyl Alcohol | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Anesthesia machine | Patterson Veterinary | ||
| Anesthesia box | Patterson Veterinary | ||
| Isoflurane | Vet one | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Calipers | Fowler | 54-100-167 | |
| Weight scale | Ohaus | Scout Pro SP601 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487 (7407), 330-337 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. Tumours with elevated levels of the Notch and Wnt pathways exhibit efficacy to PF-03084014, a gamma-secretase inhibitor, in a preclinical colorectal explant model. Br J Cancer. 109 (3), 667-675 (2013).
- Hubbard, J., Grothey, A. Antiangiogenesis agents in colorectal cancer. Curr Opin Oncol. 22 (4), 374-380 (2010).
- van Es, J. H., et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature. 435 (7044), 959-963 (2005).
- Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Res. 75 (15), 2963-2968 (2015).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Julien, S., et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clin Cancer Res. 18 (19), 5314-5328 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Carson, F. L. Histotechnology: A Self-Assessment Workbook. , American Society of Clinical Pathologists Press. Chicago, IL. (1996).
- Arcaroli, J. J., et al. Common PIK3CA mutants and a novel 3' UTR mutation are associated with increased sensitivity to saracatinib. Clin Cancer Res. 18 (9), 2704-2714 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. A NOTCH1 gene copy number gain is a prognostic indicator of worse survival and a predictive biomarker to a Notch1 targeting antibody in colorectal cancer. Int J Cancer. 138 (1), 195-205 (2016).
- Arcaroli, J. J., et al. Gene array and fluorescence in situ hybridization biomarkers of activity of saracatinib (AZD0530), a Src inhibitor, in a preclinical model of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 16 (16), 4165-4177 (2010).
- Lieu, C. H., et al. Antitumor activity of a potent MEK inhibitor, TAK-733, against colorectal cancer cell lines and patient derived xenografts. Oncotarget. 6 (33), 34561-34572 (2015).
- Pitts, T. M., et al. Association of the epithelial-to-mesenchymal transition phenotype with responsiveness to the p21-activated kinase inhibitor, PF-3758309, in colon cancer models. Front Pharmacol. 4, 35 (2013).
- Song, E. K., et al. Potent antitumor activity of cabozantinib, a c-MET and VEGFR2 inhibitor, in a colorectal cancer patient-derived tumor explant model. Int J Cancer. 136 (8), 1967-1975 (2015).
- Tentler, J. J., et al. Identification of predictive markers of response to the MEK1/2 inhibitor selumetinib (AZD6244) in K-ras-mutated colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 9 (12), 3351-3362 (2010).
- Bardelli, A., et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov. 3 (6), 658-673 (2013).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov. 1 (6), 508-523 (2011).
- Davis, S. L., et al. Combined inhibition of MEK and Aurora A kinase in KRAS/PIK3CA double-mutant colorectal cancer models. Front Pharmacol. 6, 120 (2015).
- Morelli, M. P., et al. Preclinical activity of the rational combination of selumetinib (AZD6244) in combination with vorinostat in KRAS-mutant colorectal cancer models. Clin Cancer Res. 18 (4), 1051-1062 (2012).
- Pitts, T. M., et al. Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer. PLoS One. 9 (11), e113037 (2014).
- Spreafico, A., et al. Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (15), 4149-4162 (2013).
- Arcaroli, J. J., et al. ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer. Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).
- Hoey, T., et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).
- Ikebuchi, F., et al. Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species. Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).
- Zhang, Y. W., et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).
