Aquí describimos un procedimiento para capturar imágenes en vivo de la gastrulación de Drosophila. Esto nos ha permitido comprender mejor la constricción apical involucrada en el desarrollo temprano y analizar más a fondo los mecanismos que gobiernan los movimientos celulares durante la modificación de la estructura tisular.
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Artículo de método
Obtención de imágenes de alteración celular de la forma y el movimiento celular en Drosophila Uso de la gastrulación DE-cadherina Reporter moscas transgénicas
En este artículo
Resumen
Resumen
La gastrulación es el primero conjunto de eventos morfológicamente dinámicas que se producen durante el desarrollo embrionario de los animales multicelulares tales como Drosophila. Esta alteración morfológica también es reconocida como transición epitelial a mesenquimal (EMT). La desregulación de EMT está asociado con la fibrosis y la metástasis del cáncer. Hay pruebas de que EMT es controlado por un número de mecanismos moleculares. Como también se conocen tales muchos genes, clave que controlan la constricción apical a ser factores importantes en la EMT observado en la metástasis del cáncer. Como EMT durante la gastrulación Drosophila, las células epiteliales pueden ser inducidas a cambiar su forma y ser reprogramadas para redirigir el destino celular hacia otros diversos tipos de células. Aquí se proporciona un método de formación de imágenes robusta de Drosophila gastrulación para ensayar la iniciación de los movimientos celulares morfogenéticos y la identificación del destino celular durante esta etapa del desarrollo embrionario. Usando este método, identificamos cell reordenación en el momento de la gastrulación y demostrar la importancia de la constricción apical durante la gastrulación usando GFP etiquetados DE-cadherina.
Introducción
La gastrulación es el primero conjunto de eventos morfológicamente dinámicas que se producen durante el desarrollo embrionario de los animales multicelulares tales como Drosophila 1,2. Curiosamente, la evidencia emergente sugiere que este proceso está regulado a través de la interacción entre los mecanismos mecánicos y moleculares 3. Por otra parte, la transición epitelial a mesenquimal (EMT), que es un proceso crucial en la gastrulación, también está implicada en procesos de enfermedades humanas, tales como metástasis de cáncer de 4-8. Como también se conocen tal, muchos genes que controlan la constricción apical ser factore....
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Protocolo
NOTA: Las moscas transgénicas utilizadas en este estudio son las siguientes: DE-cad 10 :: GFP.
1. Preparación de la placa de Apple
- Preparar una mezcla de 12,5 g de agar, 125 ml 100% disponible comercialmente jugo de manzana, 12,5 g de glucosa, y 375 ml de H 2 O. Se calienta la mezcla en el microondas y se vierte en una placa de cultivo celular de 3 cm. Almacenar la mezcla a 4 ° C para uso futuro.
- Después de preparar la placa de manzana, añadir una capa delgada de pasta de levadura amasada en la parte superior de la misma para permitir que las moscas de la puesta de huevos.
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Resultados
Aquí, mostramos los eventos de gastrulación en el embrión de Drosophila y una descripción general del procedimiento de preparación del embrión (Figura 1). Las membranas celulares se marcaron utilizando DE-cadherina :: GFP y formación de imágenes en vivo de movimientos de las células se realiza en el momento de la gastrulación en Drosophila (Figura 2). Desde moscas DE-cadherina GFP nos permiten visualizar las uniones de adherencia celular, somos .......
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Discusión
Aunque hemos informado previamente de un procedimiento similar para capturar imágenes en vivo del proceso de gastrulación en Drosophilla1, el método que describimos aquí es detallado y fácil de rastrear la expresión endógena de cadherina y, por lo tanto, es bastante útil para el cribado genético de factores clave involucrados en la gastrulación. Para maximizar el éxito con este procedimiento de imágenes, es esencial utilizar un portaobjetos con sangría. La presión mecánica a veces causa la muerte embr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la Fundación Astellas para la Investigación de Trastornos Metabólicos (HT), la Fundación de Ciencias Takeda (HT) y el Programa Apoyado por MEXT para la Fundación de Investigación Estratégica en Universidades Privadas (HT).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aceite de halocarbono 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Grasa al vacío Silicona | Beckman | 335148 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Vidrio Matsunami | Espesor No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Botellas de plástico Drosophilla Stock | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin moscas | REF (10) |
Referencias
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M.
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Reimpresiones y permisos
