本研究报道了一种在猪模型中通过内镜进行脂肪组织来源的基质细胞（ADSC）片移植以预防广泛内镜黏膜下剥离术（ESD）后食管狭窄的成功方法。
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摘要
摘要
近年来，细胞片构建物在再生医学领域引起了广泛关注，尤其适用于重建外科手术。将脂肪组织来源的基质细胞（ADSCs）与多种生物材料结合的多样化技术的发展，已成功构建出多种组织工程替代物，例如由啮齿类、猪或人源ADSCs衍生的骨、软骨和脂肪组织。广泛的食管内镜黏膜下剥离术（ESD）是导致食管狭窄形成的主要原因。预防狭窄仍具挑战性，目前尚无有效的治疗方法。既往研究报道了在犬模型及人体中进行黏膜细胞片移植的有效性。ADSCs具有抗炎特性、局部免疫调节作用、促进新生血管形成的能力，并可分化为间充质及非间充质谱系。本项原创性研究描述了一种在猪模型中通过内镜移植ADSC组织工程构建物以预防食管狭窄的方法。该ADSC构建物由两层异体ADSC细胞片叠加组成，并置于纸质支撑膜上。ADSCs用PKH67荧光染料标记，以便通过探头式共聚焦激光内镜显微镜（pCLE）进行监测。在移植当天，实施一段5 cm长且呈半周径范围的ESD操作，该操作已知可诱发食管狭窄。随后立即通过内镜将4个ADSC构建物移植至动物体内。经轻柔贴敷10分钟后，ADSC构建物实现完全黏附。所有动物均成功完成移植。移植后第3天通过pCLE评估确认移植成功。与移植组动物相比，对照组动物出现了严重的狭窄，伴有显著的纤维化组织增生、更频繁的进食困难以及体重增长减缓。在本模型中，于广泛ESD术后移植以双层细胞片形式组织的异体ADSCs是可行的，并且与显著降低的食管狭窄发生率密切相关。
引言
随着新型内镜技术的发展，浅表性食管肿瘤的治疗方式已发生改变。目前，内镜下切除术已成为一线治疗方法。事实上，与外科手术相比，该方法具有更低的并发症发生率和死亡率，同时肿瘤学疗效相当1,2,3。内镜下黏膜切除术（EMR）和内镜下黏膜下剥离术（ESD）是目前应用最广泛的两种技术。对于范围较广的浅表性肿瘤，通常优先选择 ESD。与 EMR 相比，ESD 能够实现无论病灶大小和形状如何的整块切除（en bloc resection）4,5,6。ESD 术后主要的迟发性并发症是食管狭窄的形成，通常发生在切除术后一至两周内。近期发表的研究表明，狭窄的形成与切除范围的大小相关。日本内镜学会建议避免实施切除范围超过食管周径 ¾ 的 ESD，因为此类操作在超过 90% 的病例中会导致狭窄形成，并引发严重的进食困难以及生活质量的显著下降。
预防食管狭窄仍然具有挑战性。目前对狭窄形成所涉及的机制仅部分明确。狭窄的形成似乎源于两种不同机制的共同作用：（1）促炎性细胞的募集；（2）过度纤维化的发生
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方案
所有动物的处理均遵循动物研究伦理委员会（法国农业部指南）的规定。该实验方案已获得巴黎笛卡尔大学（法国巴黎巴黎笛卡尔医学院，注册编号MESR 2035.02）授权的当地伦理委员会批准。
1. ADSC 培养与标记
- 从私人机构获取经确认的脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）。在37 °C和5% CO2条件下，使用含10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素和链霉素）的α最低必需培养基培养同种异体ADSCs。
- 通过标准细胞扩增程序（37 °C和5% CO2），每只动物获取约24 × 106个ADSCs。使用标准胰酶溶液（T150培养皿使用10 mL）收集ADSCs，并用血细胞计数板进行细胞计数。
- 在移植前一天使用下述PKH67染色法进行细胞标记。
注意：染色程序的目的是便于移植后对细胞进行追踪。- 为标记2 × 106个ADSCs，配制溶液A（2 × 106个细胞与100 µL稀释液C混合）和溶液B（4 µL PKH67与1 mL稀释液C混合）。
- 将溶液A和溶液B孵育2分钟，然后加入100 µL胎牛血清孵育1分钟。
- 用300 µL柠檬酸盐RPMI溶液（298.5 µL RPMI和1.5 µL柠檬酸）洗涤，并在1,500 × g下离心5分钟。重复此操作2次。将标记后的细胞保存并避光，直....
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结果
ADSCs 的培养及 ADSC 片的制备过程如图所示 图1. 图2 显示了移植物的构建，该移植物由两层脂肪来源间充质干细胞（ADSC）片层叠加组成，每层均附着于其纸质支撑膜上。ADSCs先前已用PKH67荧光染料标记，以实现后续追踪 体内 使用pCLE进行移植物监测 图3 展示了食管内镜下黏膜下层剥离术的各个扩展步骤，最终形成一条5 cm长的半环周食管瘢痕。 图4 显示内镜下移植手术过程。所有动物在轻柔操作10分钟后均成功完成移植。 图5 显示第3天pCLE评估呈阳性，证实移植手术成功。
随访期允许进行多模式狭窄分析。不同的评估结果如下图和下表所示。与对照组动物相比，移植组动物在第28天时消化系统问题发生频率更低，体重增加更明显。移植组中有一只动物出现严重的食管狭窄，.......
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讨论
在此猪模型中，ADSC片移植在技术上是成功的，且 体内 pCLE评估可用于监测细胞植入情况。临床、内镜、影像学和组织学评估均证实，内镜下ADSC片在预防广泛ESD术后食管狭窄方面具有有效性。
含有靛胭脂染料的脂肪来源间充质干细胞（ADSC）甘油溶液的内镜下移植是再生医学中的一种创新方法。Ohki et al. 首次描述了该内镜移植操作。在他们的研究中，细胞片结构由口腔黏膜上皮细胞片层叠于聚偏二氟乙烯（PVDF）薄膜上构成，后者作为支撑膜使用10,11,19。通过内镜钳夹持支撑膜，并将其小心地放置于溃疡创面。经轻柔按压10分钟后，细胞片即可实现黏附。该操作尚未被其他研究团队成功复现。在本研究中，出于多种考虑采用了双层ADSC细胞片结构进行移植。选择ADSC的原因在于多项研究已证实其具有抗炎能力，尤其在皮肤修复过程中表现显著。已知ADSC可调节角质形成细胞与成纤维细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由 Avenir 基金会（Fondation de l'Avenir，地址：法国巴黎瓦居阿尔街 255 号，邮编 75719，巴黎 15 区）资助和支持。若无阿尔贝·卡庞捷基金会生物外科研究实验室兽医团队的宝贵协助，本研究不可能得以开展。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 透明内窥镜帽 Q180 兼容型 | Olympus Optical Co | ||
| GIF-Q180 胃镜 | Olympus Optical Co | ||
| Exera II 视频内镜系统 | Olympus Optical Co | ||
| 18 G 注射针 | Olympus Optical Co | ||
| ERBE ICC 350 电外科工作站 | ERBE Technology | ||
| 1% 吲哚菁蓝 | Life | ||
| 内镜混合刀 | Life | ||
| Minisonde Z pCLE 绿色探头 | Mauna Kea Technology | 您必须学习如何使用该探头，操作可能较为困难。 | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | 12105C | |
| 胰蛋白酶 | Sigma Aldrich | T146 | |
| α 最低必需培养基 | Thermo Fisher | 22561-021 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| PKH67 荧光染料试剂盒 | Sigma Aldrich | Mini67-KT | |
| 12 孔温敏细胞培养皿 | Upcell Thermo Scientific | 174900 | 接种细胞前 30 分钟，每孔加入 4 mL 标准培养基 |
| 埃索美拉唑 40 mg | Biogaran | ||
| 硫酸吗啡 50 mg/mL | Lavoisier | ||
| 阿莫西林 1 g | Biogaran | ||
| 氯胺酮 250 mg/5 mL | Panpharma | ||
| 丙泊酚 10 mg/mL | Fresenius | ||
| 疏水纸 | Carrefour |
参考文献
- Ono, S., Fujishiro, M., et al. Long-term outcomes of endoscopic submucosal dissection for superficial esophageal squamous cell neoplasms. Gastrointestinal endoscopy. 70 (5), 860-866 (2009).
- Pech, O., May, A., et al.
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重印与许可
