Summary
Ischemisk stroke är en komplex händelse där det specifika bidraget av astrocyter till hjärnregionen påverkas utsätts för syrebrist glukos (OGD) är svåra att studera. Den här artikeln presenteras en metod för att få isolerade astrocyter och studera deras reaktivitet och spridning OGD villkor.
Abstract
Ischemisk stroke är en komplex hjärnskada orsakad av en tromb eller emboli hindrar blodflödet till delar av hjärnan. Detta leder till berövande av syre och glukos, som orsakar energi fel och neuronala dödsfall. Efter en ischemisk stroke förolämpning, astrocyter blir reaktiva och föröka sig runt skadan webbplats som den utvecklas. Enligt detta scenario är det svårt att studera specifika bidrag av astrocyter till hjärnregionen utsätts för ischemi. Därför införs denna artikel en metod för att studera primära Astrocyten reaktivitet och spridning under en in vitro- modell av en ischemi-liknande miljö, kallas syre glukos deprivation (OGD). Astrocyter isolerades från 1-4 dag-gammal neonatala råttor och antalet icke-specifik astrocytic celler bedömdes med hjälp av Astrocyten selektiv markör Glial Fibrillary sura Protein (Fredsgenomförande) och nukleär färgning. Perioden som astrocyter underkastas villkoret OGD kan anpassas, liksom andelen syre som de utsätts för. Denna flexibilitet gör det möjligt för forskare att karakterisera varaktigheten av villkoret ischemisk-liknande i olika grupper av celler in vitro. I artikeln beskrivs de tidsramar för OGD som inducerar Astrocyten reaktivitet, hypertrofisk morfologi och spridning mätt med immunofluorescens använder frodas Cell nukleära Antigen (PCNA). Förutom spridning, astrocyter genomgå energi och oxidativ stress, och svara på OGD genom att släppa lösliga faktorer till cell medium. Detta medium kan samlas och används för att analysera effekterna av molekyler som släpptes av astrocyter i primära neuronala kulturer utan interaktion från cell till cell. I sammanfattning, kan här primär cell kultur modell användas effektivt att förstå rollen av isolerade astrocyter vid skada.
Introduction
Stroke definieras som ”en akut neurologisk dysfunktion av vaskulärt ursprung med antingen plötslig eller snabb utveckling av symtom och tecken, motsvarande medverkan av målområdena i hjärnan”1,2. Det finns två typer av stroke: ischemisk och hemorragisk. När vaskulär dysfunktion orsakas antingen av ett aneurysm eller en arteriovenös fel, tillsammans med försvagning med bakre bristning av en artär, kallas detta hemorragisk stroke3 , som i de flesta fall leder till döden. När en tromb eller emboli hindrar blodflödet, kallas orsakar ett tillfälligt frihetsberövande av syre och glukos till en hjärnregionen, det ischemisk stroke4. Underlåtenhet att ge näring till cellerna runt det drabbade området eller ischemisk core leder till en homeostatiska och metabolisk obalans, energisk dysfunktion, neuronala dödsfall och inflammation5, som kan framkalla en livslång invaliditet för patienter6.
Ischemisk stroke är en multifaktoriell skada som involverar flera typer av celler som reagerar och utöva deras effekter vid olika tidpunkter. Många interaktioner skapar en svår miljö att studera beteendet hos enskilda celler. Så, hur studerar vi bidrag till en viss celltyp under en så komplex miljö? En accepterad i vitro modell av ischemi består av utsätta celler till syre och glukos deprivation (OGD), under en viss period, följt av återställandet av celler till en normoxic miljö. Detta system simulerar en ischemisk stroke följt av blod reperfusion. I denna metod, är celler eller vävnader utsatta för en glukos-fria medier i en miljö som rensas på syre, med hjälp av en specialiserad hypoxisk kammare. OGD inkubationstiden kan variera från några minuter upp till 24 h, beroende på hypotesen att vill testas. Studier har visat att beroende på tiderna av OGD och normoxic miljö, specifika fenotyper av stroke (dvsakut eller Subkronisk) kan uppnås. Primära isolerade astrocyter, utsätts för OGD med bakre återställande till normoxic förhållanden, är en väl studerat cellulära modell att efterlikna stroke in vitro-7. Använda OGD är möjligt att avslöja oberoende molekylära mekanismer för isolerade celler under en stroke-liknande miljö.
Som vår kunskap om Astrocyten biologi ökar, har det blivit uppenbart att de är avgörande för att upprätthålla synapser och upprätthålla neurala reparation, utveckling och plasticitet8. Under normala förhållanden, astrocyter släppa och svara på cytokiner, chemokiner, tillväxtfaktorer och gliotransmitters, att hålla metabolisk balans och homeostas inom synapser5,9. I akut neuroinflammation, såsom ischemisk stroke, kan dessa celler bli reaktiv, Visa en långsiktig överuttryck av Glial Fibrillary sura Protein (Fredsgenomförande) och Visa hypertrofi i deras morfologi5,10, 11 , 12. eftersom det ischemisk infarct framkallar, homeostas som tillhandahålls av astrocyter blir påverkat, angående normal glutamat upptag, Energiomsättning, utbyte av aktiva molekyler och antioxidant aktivitet13.
Återaktiverade astrocyter föröka runt infarct vävnaden medan leukocyter migrera mot den bort område14. Astrocytic spridning kan mätas med hjälp av markörer såsom prolifererande celler nukleär antigen (PCNA), Ki67 och Bromdeoxiuridin (BrdU)15. Detta proliferativ svar genereras i en tidsberoende sätt och det hjälper bildar gliaceller ärret, en rad irreversibelt reaktiva astrocyter längs parenkymet av skadade platsen efter en skada9. En av de ursprungliga funktionerna i detta ärr är att begränsa de immunceller extravaseringen från detta område. Studier har dock visat att ärret blir ett fysiskt hinder för axoner förlänga, som de släppa molekyler att hämma axonal tillväxt, och skapa en fysisk barriär som hindrar axoner utökar runt det skadade område16. Dock finns det vetenskapliga bevis visar att helt förhindra gliaceller ärrbildning efter en ryggmärgsskada, kan försämra regenerering av axoner17. Således det sammanhang där den specifika astrocytic Svaren mäts, måste beaktas vid ramen för den skada som studerade.
Den presenterade metoden kan användas för att studera funktionen individualiserad av astrocyter efter syre glukos deprivation och det kan ändras beroende på de frågor som utredaren vill besvara. Till exempel förutom morfologisk förändring och de markörer som uttryckts vid olika OGD gånger, supernatanterna från astrocyter utsätts för OGD kan ytterligare analyseras för att identifiera lösliga faktorer släpptes av dessa celler, eller används som en betingad media för att bedöma dess effekt i andra hjärnceller. Detta tillvägagångssätt möjliggör studier på Astrocyten reaktivitet som kan leda till förtydligandet av de faktorer som styr och modulera deras svar i ett scenario för ischemisk stroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
postnatal råttor (Sprague Dawley) 1-4 dagar gamla används för att isolera cortices. Metoden för dödshjälp är halshuggning, som godkänts av NIH riktlinjer.
1. beredning av instrument och material för kirurgi
- Sterilize instrument i autoklav (temperatur: 121 ºC, trycket: 15 psi, tid: 30 min) med en stål låda eller en omedelbar tätning sterilisering påse. Se material i Tabellen för material.
2. Slutföra DMEM förberedelse
- i en en liter bägare innehållande 700 mL Ånghärdad vatten, tillsätt Dulbecco ' s ändrad Eagle ' s Medium pulver rumstemperatur.
- Lägga till 3,7 g/L natriumbikarbonat, medan lösningen rörs med en magnetisk omrörare.
- Justera pH till 7,4, med Ånghärdad vatten ta volym upp till 1 L, sedan filtrera. För kultur, komplettera den önskade volymen medier med 10% FBS och 1% Penicillin/Streptomycin, och varma vid 37 ˚C. Se material i Tabellen för material.
Obs: PH justerades till 7,4 via infoga pH mätare elektroden i media. Medierna måste under omrörning, Lägg sedan långsamt till 1 M NaOH med hjälp av en pipett.
3. Primära Astrocyten kultur
Obs: efter sådd, cell media måste ändras varje tre dagar och celler kan odlas upp till konfluens (11-13 dagar). Den tredje dagen, tryck på kolven flera gånger till hiss mikrogliaceller och oligodendrocyte stamceller av kulturen, ta bort alla de ' gamla ' media, tvätta två gånger med 10 mL PBS, aspirera PBS, sedan lägga till färska nya media. Se material i Tabellen för material.
- Dissekering av nyfödda råtthjärna
- utför dissektion i vävnadsodling huva. Få 1-4 dagar gamla nyfödda råttungar (2 rat brains används per 75 cm 2 kolv).
- Förbereda tre 60 mm petriskålar och Pipettera 5 mL komplett DMEM på varje.
Obs: De kan delas upp enligt följande: #1 för varje råtta hjärnan, #2 för alla cortices av hjärnor och #3 för alla de skalade cortices (utan hjärnhinnorna). - Förstå den pup och spray med 70% etanol. Halshugga den och kasta kroppen i en liten biohazard avfallsbehållare.
- Mikro-dissekera pincetten, håll huvudet och skära huden på toppen av huvudet att exponera kraniet.
- Med en annan sax, göra en " T " incision start från baksidan av skallen mot näsan. Använda ett par pincett att varsamt ta bort skallen.
- Bort exponerade hjärnan med en pincett och placera hjärnan i en av de petriskålar som tidigare fylld med medium.
- Använder en annan uppsättning av sterila instrument för de efterföljande stegen.
- Använda mikro-dissekera pincett för att placera försiktigt en hjärna på en 60 mm petriskål inverterad lock. När petriskål placeras på steril gasbinda, är det möjligt att Visa hjärnan tydligt och det är lättare att dissekera.
- Stadig hjärnan med mikro-dissekera pincett och separera hjärnhalva genom försiktigt retas längs mittlinjen sprickan med den vassa änden av mikro-dissekera tången.
- Deflect och skala de cortices, lämnar bakom den vita substansen, och överföra dem till en petriskål, tidigare märkt #2. Upprepa proceduren för alla hjärnor, att kombinera alla de dissekerade cortices i petriskål märkt #2.
- Ta ut hippocampus från under varje cortex och kassera det.
- Mikro-dissekera pincetten och en 60 mm petri försiktigt skala hjärnhinnorna från de enskilda kortikala loberna och placera dem i petriskål märkt #3.
- Vävnad dissociation: Homogenisatorer blender metod
- och häll vävnad/medium suspension (skalade cortices av hjärnan) i steril blender påsen tillräckligt medium för att få den totala volymen i påsen till 5 mL.
- Placera påsen i Homogenisatorer blandaren, lämna ca 2 cm av påsen syns ovan den stängda dörren. Cell dissociation sker under 2,5 min på hög hastighet.
Obs: Alternativt kan detta göras genom att stänga väskan och bultade det försiktigt med en bägare i huven. Se till att använda en trasa mellan påse och bägare för att undvika friktion. - Häll cellsuspensionen i en sikt med maskstorlek på nummer 60 och häll sedan filtrerade flödet genom på nummer 100 sikten, gör det möjligt att filtrera självtryck.
- Med 15 mL rör, Centrifugera cellsuspension vid 200 x g i en klinisk centrifug (helst swing hink rotor) för 5 min.
- Häll bort supernatanten i en bägare, sedan med serologiska pipett återsuspendering och separera pelleten av celler i högst 5 mL media.
- Cell räknar
- med en mikropipett, samla 100 µL cellsuspension i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och tillsätt 100 µL av trypan blå.
- Infoga 10 µL av den insamlade suspensionen i hemocytometer och räkna alla celler som är gångbart i de fyra hörnen av torget.
- Av formler för att beräkna tätheten av cellerna innan du förbereder kolvar är:
- lägga till minst 500 000 celler per 25 cm 2 kolv. Pipettera upp till 5 mL DMEM i varje kolv. Blandningen bör inte nå i kolvens hals. Placera dem i en 37 ° C inkubator på 5% CO 2, 3 dagar, sedan ändra media.
- Astrocyten rening tekniker: media ändrar, mekaniska och kemiska strategier
Obs: ämnesomsättning av astrocyter är hög jämfört med andra celltyper, därför i näringsmässigt berövas villkor, dessa celler Visa låga överlevnaden efter några dagar. Till skillnad från astrocyter, mikroglia påverkas inte av näringsmässiga deprivation och föröka sig i sådana miljöer 18. För att bibehålla ett minskat antal mikrogliaceller, ändra författarna astroglial cell kulturmassmedia efter 3 dagar. Denna ständiga förändring i cell media kommer också att minska befolkningens försök som kan växa ovanpå den astrocytic cell enskiktslager i kolven 19.- Använd en Pasteur pipetten att aspirera media med icke-anhängare mikrogliaceller från kolvarna. Tvätta eventuellt skräp kvar använder sterila-filtrerad PBS till kolvarna på ett droppvis sätt (5 mL/kolv).
- Lägga den sterila-filtrerad DMEM (med antibiotikum och fetalt bovint serum) droppvis till varje kolv (5 mL/kolv). Blanda försiktigt i cirkelrörelser att täcka hela ytan.
- Plats celler i en 37 ° C inkubator på 5% CO 2 för 8-10 dagar tills kolvarna når konfluens (> 95% plattan täckning).
Obs: Flera protokoll har visat att när astrocyter når konfluens, mekaniska metoder, såsom skakningar kulturen från 2 till 24 h, leder till avskiljandet av celler som ligger ovanpå dessa astrocyter, främst mikroglia och föregångare celler 19 , 20. - Icke-astrocytic celler reduceras i kultur genom att utföra orbital skakar vid 180 rpm i 30 min. Efter att ta bort celler i supernatanten, färska media är pipetteras i kolven (~ 15 mL).
- Att eliminera de oligodendrocyte stamceller, öka skakningar hastigheten till 200 rpm för 6 h 21 , 22 , 23, Aspirera supernatanten och Pipettera färska media.
Obs: För att minska förekomsten av mikroglia i kulturer, två kemiska metoder kan användas sekventiellt (inte samtidigt) i primär cell kultur metodik: arabinos cytosin (Ara-C) och L-leucin metyl ester (LME) 24. - Omedelbart när celler nå konfluens (100%), 3-4 dagar efter mekanisk borttagning av mikroglia, dessa celler kan behandlas med µM 8 av de Mitoshämmande sammansatta arabinos cytosin (Ara-C) i DMEM i 5 dagar (ändra till färska Ara-C i DMEM dagligen).
Obs: Tidpunkten att lägga till Ara-C är kritisk eftersom denna förening är ett Mitoshämmande läkemedel, som minskar antalet snabbt delande celler såsom mikroglia 19 , 25 och fibroblaster 26 . I motsats till mikroglia, när konfluenta, astrocyter stoppa allt fler via kontakt hämning 27. - Tillåt 2 dagar för cellerna att återhämta sig från Ara-C behandling.
- Att ytterligare minska mikrogliala smittan, efter celler nå konfluens, använda 50 mM av L-leucin metylester (LME) i DMEM fast vid pH 7.4, för 1 h vid 37 ˚C.
Obs: LME korsar membranet i celler och organeller, och efter att hydrolyserat, den L-leucin produceras ackumuleras i lysosomer av dessa celler. Ansamling av denna aminosyra leder till en osmotisk svullnad och bristning i lysosomer 28 , 29. LME är mycket effektiv på att eliminera mikroglia, jämfört med andra celler 20 , 30.
4. Odla astrocyter i 6-väl plattor
- beläggning coverslips med poly-D-lysin
- sätta ett täckglas i varje 35 mm petriskål, sedan Tillsätt 100 µL utspätt Poly-D-lysin lösningen på varje täckglas och vänta 1 h.
- Bort den Poly-D-lysin och tvätta två gånger med 2 mL sterilt vatten.
- Ta bort vatten och vänta coverslips torka inuti huven. Lagra coverslips vid-20 ° C i upp till två veckor.
Obs: Frysa den utspädda Poly-D-lysin lösningen; Det kan lagras i upp till två veckor.
- Trypsinization
- med pipett Pasteur aspirera på medellång från kolvar. Tillsätt 5 mL/kolv steril-filtrerad PBS att försiktigt skölja cellerna.
- Aspirera av PBS, och tillsätt sedan 5 mL/kolv steril-filtrerad 0,25% Trypsin och 0,5 mM EDTA-lösning. Placera kolven i den 37 ˚C, 5% CO 2 inkubator för 10 min.
Obs: Medan cellerna ruva, värmas 5 mL/kolv av färska komplett DMEM vid 37 ° C. - Efter 10 minuters inkubation, agiterar för att se till att alla celler är lyfte kolven. Snabbt lägga till de 5 mL av varma komplett DMEM till varje kolv, att neutralisera trypsin.
- Pipettera försiktigt cellerna upp och ner flera gånger för att bryta upp någon " klumpar ". Överföra suspenderade celler från två kolvar till en 15 mL koniskt centrifugrör.
- Centrifugera under 5 minuter vid 200 x g att samla cellpelleten. Resuspendera pelleten i 500 µL av medium och fortsätt att placera celler i kolvar.
Obs: Exempel på analyser göras med celler: 1) omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) att analysera genuttryck; (2) Western blot att utvärdera proteinuttryck; (3) Flödesanalys för flödescytometri att kvantifiera antalet neurala stamceller och proteiner av intresse. (4) immunofluorescens att analysera proteinuttryck och localization.
- Seeding astrocyter
- efter behandling av de primära astrocyterna med trypsin (se 4.2), samla in 100 μL av cellsuspensionen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och tillsätt 100 μL av 0,5% trypan blå.
- Tillsätt 10 μL insamlade suspensionen i trypan blå till hemocytometer och räkna alla celler som är bärkraftiga.
- Använda formlerna i steg 3.3 för att beräkna tätheten av cellerna innan du förbereder kolvar.
- Förbereda flera brunnen rätter genom att lägga till en steril, poly-D-lysin belagd täckglas till varje brunn. Överför med pipett 50 000 celler och fyll resten av volymen i varje flera maträtt med färska medium (ca 2 mL).
- Placera flera rätter i 37 ˚C inkubatorn på 5% CO 2, och efter 5-7 dagar, astrocyter kan växa och täcka hela ytan av coverslips.
5. OGD protokoll för primära astrocyter
- OGD medium förberedelse
- tillägg Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium-fri glukos med 3,7 g/L natriumbikarbonat och 1% Penicillin/Streptomycin. Se material i tabell 4.
- Rensa 20 mL glukos gratis medium av bubblande med 95% N 2 / 5% CO 2 för 10 min vid ett flöde av 15 L/min (indikeras med flödesmätaren) genom att infoga en serologisk pipett till gassystemet medium.
Obs: Efter rensning av syre, justera pH på 7,4 (se not på steg 2.1). - Filtrera det renade glukos-fri medium med en 50 mL tub filtersystem.
Obs: Se färska OGD medium för varje experiment, bubblande med 95% N 2 / 5% CO 2 innan du använder, se till att celler utsätts för en miljö som renat syre.
- Experimentell förfarande
- inuti vävnadsodling huven, ta bort Astrocyten media från tidigare beredda coverslips (se steg 4.3.5) och tvätta med cellulära PBS två gånger för att ta bort eventuella glukos i celler.
- Tillsätt 2 mL av OGD media till varje brunn och placera flera rätter inuti hypoxi kammaren med deras lock off.
- Ansluta gasblandningen till ingången ventilen och lämna avsluta ventilen öppen. Spola kammaren med gasblandningen 95% N 2 / 5% CO 2, vid 15 L/min för 5 min.
- Stoppa gasflödet, och först Stäng klämman på exit ventilen, sedan Stäng klämman på gas ingången ventil slangen.
Obs: Se till att det finns ingen gasläckage genom att täcka tätning av kammaren med såpvatten. Om förseglingen är säkert, inga bubblor bör bilda. - Placera hela kammaren i cell kultur inkubatorn vid 37 ° C för 1 h eller 6 h i OGD.
- Efter inkubationstiden är över, aspirera OGD media och noggrant överför med pipett 2 mL av komplett DMEM till varje 4,67 cm 2 bra för normoxic bearbeta 24 h.
6. Protokoll för primära Astrocyten immunofluorescens förberedelse
Obs: för att bedöma Astrocyten renhet, olika hjärncell typer såsom nervceller, mikroglia och oligodendrocyter kan upptäckas av immunofluorescens med annan cell märkpennor. Spridning markörer, PCNA och propidium jodid (PI) kan användas på primära astrocyter utsätts för OGD följt av normoxic villkor. Se material i Tabellen för material.
- Immunofluorescens förberedelse
Obs: detta är ett allmänt immunofluorescens protokoll, mindre ändringar kan utföras för att uppnå en optimal signal (t.ex., det längre inkubation perioder, inkubation temperatur). Varje markör från tabell 1 kan användas enligt tillverkaren ' s-protokollet.- Att utvärdera cellernas viabilitet, celler kan inkuberas i 5 minuter vid 37 ° C med PI (5 µM i komplett DMEM) och tvätta två gånger med 2 mL PBS för 5 min. celler som visar PI färgning är mindre livskraftig.
Obs: Användning cellerna behandlas i steg 5.2.6. - Fixar celler efter PI färgning, tillsätt 2 mL 4% formalin per 4,67 cm 2, under 20 minuter vid 4 ° c. För prover märkta med PCNA, rekommenderad infästning lösningen är metanol i 10 min vid 4 ˚C.
Varning: Formalin och metanol är giftiga.
Obs: Kontrollera alltid specifika antikroppen protokoll från varje företag. - Tvätta cellerna med 2 mL PBS under 5 minuter och upprepa detta 3 gånger.
- Inkubera cellerna i blockering lösning (0,5% icke-jonisk tensid, 10% FBS i PBS) i 30 min i rumstemperatur under varsam skakning.
- Tvätta cellerna med 2 mL PBS för 5 min, upprepa tvätta 3 gånger.
- Inkubera vid 4 ° C, över natten (16 h), med primär antikropp (PCNA, Fredsgenomförande) i en lösning av 1% FBS i PBS.
- Ta bort primär antikropp lösningen, tvätta cellerna med 2 mL PBS under 5 minuter och upprepa detta 3 gånger.
- Inkubera med sekundär antikropp konjugerat med fluorophore i en lösning av 1% FBS i PBS, för 1 h, i rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med 2 mL PBS för 5 min, upprepa detta 3 gånger. Tillsätt 1 µg/mL DAPI (4 ', 6 ' - diamidin - 2-fenylindol) för 5 min att färga cellkärnorna.
- Tvätta cellerna med 2 mL PBS 5 min, upprepa detta steg två gånger och hålla i PBS.
- Förbereda coverslips på ett objektglas med monteringsmedium.
- Att utvärdera cellernas viabilitet, celler kan inkuberas i 5 minuter vid 37 ° C med PI (5 µM i komplett DMEM) och tvätta två gånger med 2 mL PBS för 5 min. celler som visar PI färgning är mindre livskraftig.
- Confocal Mikroskop
- efter inställning av mikroskopet, placera täckglas sidan ner på Mikroskop scenen.
- Med programvaran, Välj en laserstråle på 543nm för Fredsgenomförande-Cy3 konjugerad antikropp.
7. Cell livskraft Assay
- Trypsinize och kvantifiera astrocyterna genom att följa steg 4.3 och 4.4.
- Lägg till 1 x 10 4 celler per brunn till 96 brunnar och odla dem till konfluens.
- Använder metoden från steg 5, exponera odlade 96 brunnar till antingen normoxic 1 h OGD eller 6 h OGD.
- Efter OGD behandling, normoxic media läggs till alla celler för 24 h och lönsamhet mäts med MTT reagens analys (använda som tillverkaren ' anvisningar indikerar).
- Från en 5 mg/mL MTT lösning, lägga till 10% av den totala volymen i varje brunn och Inkubera under 3 timmar vid 37 ° c med MTT-reagenset.
- Ta bort media och resuspendera kristaller använder 200 µL dimetyl sulfoxid. Läs plattan i en spektrofotometer vid 570 nm.
Obs: En minskad absorbansen i förhållande till kontroll celler kommer att korrelera med mindre livskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En av de viktigaste frågorna av primära astrocytic kultur är närvaron av andra celler som nervceller, oligodendrocyter, fibroblaster och mikroglia. I figur 1, isolerade celler från råtta cortices hade media ändringar varje 3 dagar och var antingen obehandlade eller behandlade med till LME för 1 h. 24 h senare, celler var immunostained för Fredsgenomförande och counterstained med DAPI. Obehandlade celler visade i genomsnitt 39% icke-Fredsgenomförande positiva celler, medan LME-behandlade celler visade 8%. Dessa resultat visar hur LME behandling och media ändra effektivt minskad icke-Fredsgenomförande positiva celler med 4,75 gånger, producerar en berikad-Astrocyten kultur. För att avgöra om 1 h eller 6 h OGD påverkar Astrocyten lönsamhet efter denna metod, visar figur 2 en MTT haltbestämning av Astrocyten kulturer, 24 h efter förolämpning. Ingen signifikant skillnad i lönsamhet hittades i ett tillstånd, visar att båda gångerna kan användas för att undersöka astrocyt reaktivitet. Cellproliferation är en av de effekter som utlöses av OGD i astrocyterna. Prolifererande celler nukleär antigen (PCNA) i figur 3 ökat från 10% i normoxic celler, till 30% efter 1 h OGD, visar den beräknade i vivo astrocytic svar15. Slutligen, astrocyter exponerades för 6 h av OGD följt av 24 h normoxic villkor. Efter denna tid utfördes immunofluorescens mot Fredsgenomförande. OGD-exponerade cellerna jämfördes astrocyter under normoxic förhållanden. Astrocyter utan OGD Visa traditionella stjärnformade morfologi (figur 4A) medan celler som genomgick OGD tydligt presentera den karakteristiska hypertrofin av reaktiva astrocyter (figur 4B). Denna hypertrofi kan visualiseras i motsvarande differentiell störningar kontrast (DIC) bilden av kortikala råtta astrocyter under normoxic och OGD förhållanden (figur 5).
Figur 1 . Immunofluorescens att validera primära kortikala råtta astrocyter kultur renhet med Fredsgenomförande och DAPI. (A), den vänstra panel representerar Fredsgenomförande positivt celler (röd), den mellersta panelen visar atomkärnor (DAPI, blå) och den högra panelen visar sammanslagna bilder av icke-LME-behandlade (övre panelen) och LME-behandlade (nedre panelen) celler. Vita pilar visar icke-Fredsgenomförande-positiva färgade celler. (B) kvantifiering av icke-Fredsgenomförande positiva kärnor i LME och icke-LME behandlade celler. Ett oparat t-test utfördes (p < 0,0001) och felstaplar representera medelvärdet med SEM. skala barer representera 50 µm och bilder togs på 20 x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Livskraft haltbestämning av astrocyter med 24 h exponering för OGD. Astrocyter var odlade i 96 brunnar och exponerad för antingen normoxic, 1 h OGD eller 6 h OGD villkor. Efter behandling, celler har lagts till normoxic media för 24 h och livskraft mättes med MTT-analys. Absorbansen vid 570 nm visar cellen livskraft OGD-exponerade celler i kultur jämfört med celler i normoxic villkor. Data analyserades med envägs ANOVA (p = 0.9669) och presenteras med felstaplar som representerar medelvärdet med SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Spridning i råtta astrocyterna ökar vid exponering för syre och glukos deprivation och kan upptäckas där PCNA som markör. (A), den vänstra panelen representerar PCNA positiva celler (grön), den mellersta panelen visar atomkärnor (DAPI, blå), och den högra panelen visar sammanslagna bilder av normoxic celler (övre panelen) och 1 h OGD behandlade celler (nedre panelen). (B) procent av PCNA positiva celler i normoxic kontra OGD behandlade celler. En oparade-testet utfördes (p < 0,0001) och felstaplar representera medelvärdet med SEM. skala barer representera 50 µm och bilder togs på 20 x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Uttryck av Glial Fibrillary sura Protein (Fredsgenomförande) konjugerat med Cy3 i primära råtta kortikala Astrocyten kultur. (A) astrocyter i en normoxic miljö show karakteristiska stjärnformade morfologi. Proteinet mellanliggande glödtråden, Fredsgenomförande, fyller de cell organ och sträcker sig in i de tunna cytoplasmiska processerna. (B) efter 6 h i OGD exponering astrocyter antog en hypertrofisk morfologi. Skalorna representerar 20 mikrometer och bilder togs på 40 x förstoring i en confocal Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Kortikala råtta astrocyter under normoxic och syre-glukos deprivation. Immunofluorescens av astrocyter under normoxic förhållanden (övre vänstra panelen) eller 6 h OGD (nedre vänstra panelen), målat med en Cy3-konjugerad antikropp mot förpliktelserna. Den motsvarande differentiella störningar kontrast (DIC) bilden visas på den högra panelen. Skalstapeln representerar 20 mikrometer och bilder togs på 20 x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Syfte | Antikropp/markör | Beskrivning |
| Astrocyten kultur validering | IBA-1 | Upptäcker mikrogliaceller |
| NeuN | Identifierar mogna nervceller | |
| Olig1 | Upptäcker mogen oligodendrocyter | |
| Olig2, NG2 | Upptäcker oligodendrocyte föregångare celler | |
| GalC | Identifierar omogen eller mogen oligodendrocyter | |
| Spridning | PCNA | Binder p36 protein, uttrycks på höga nivåer i prolifererande celler |
| Cellernas viabilitet | Propidium jodid (PI) | Binder till DNA, denna markör indikerar avsaknaden av cellernas viabilitet |
Tabell 1. Lista av reagenser som används för att färga olika typer av celler och cellulära processer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver isolering av astrocyter från råtta cortices. Den här metoden är det viktigt att minska kontaminering med andra cellulära typer såsom mikroglia, oligodendrocyter och fibroblaster. För att minska antalet mikroglia, flera åtgärder kan vidtas: ändra media, orbital skakar och kemiska behandlingar. När kulturen renhet har bekräftats genom immunofluorescens med selektiv cellulära märkpennor eller för de mest framstående cell föroreningarna kan experiment utföras. Antikropp mot Joniserat kalcium bindande adapter molekylen 1 (Iba-1) kan exempelvis användas för att upptäcka mikroglia. Neuronala dödsfall börjar tidigt i kulturen och dessa celler elimineras tillsammans med oligodendrocyte föregångare celler (OPCs) efter kolven avlyssning och media ändra dag 331. Oligodendrocytic föregångare celler kan identifieras med hjälp av antikroppar såsom olig2 eller NG2. GalC kan användas för att identifiera omogna eller mogen oligodendrocyter, men i nuläget kultur dessa sannolikt inte kan hittas. Alternativt, icke-Fredsgenomförande positiva celler kan kvantifieras och föroreningar kan uppskattas. Denna sista metod urskiljs inte mellan de specifika cellerna, men är en snabbare och mer ekonomiska metoden för att bestämma andelen icke-astrocytic celler i kulturen.
När en Astrocyten berikad kultur produceras, kan OGD experiment utföras för att undersöka astrocyt reaktivitet. Rensa en lösning med kväve av bubblande för att ersätta syre är en vanligt förekommande protokoll nr32. I vår metodik använder vi metoden bubblande för att rensa syre med kvävgas (95% N2, 5% CO2) till glukos-fri media med en flödeshastighet på 15 L/min, 10 min, för en total volym av 0,025 L. För att bekräfta att syret rensas, mätte vi syrehalten kvar i media med hjälp av en syre-mätare för vätskor och luft. Syrekoncentrationen kvar i media efter purging för 10 min minskade från 7,9 mg/L till 0,3 mg/L. För att avgöra hur länge kammaren måste rensas för att ersätta syre, rensning med N2 utfördes med hjälp av inte mindre än kammare tillverkarens förslag (20 L/min, 2-5 min). Efter 5 min av utrensning på 15 L/min, var syrekoncentrationen kvar i kammaren 0%. Andra metoder som använder liknande kammare har rensats på en 8-20 L/min flöde och tider på 5-10 min att ersätta luft syre med kväve33,34.
Liksom andra cellulära modeller, OGD har begränsningar och resultaten ska tolkas försiktigt. OGD kan vara skadligt för nervceller, dock astrocyter tål dessa villkor för upp till 24 h35. En annan begränsning är att astrocyterna isoleras i detta system, saknar signalering från andra celler. Ett sätt att övervinna denna begränsning är att använda luftkonditionerade medier från andra celler på samma ischemisk-liknande villkor. Alternativt, cytokiner eller andra faktorer kan läggas till media efter OGD36.
En alternativ metod för att studera effekterna av energibrist i cellerna, är att lägga ouabain till media. Denna förening hämmar främst natrium/kalium pumpen, som utarmar intracellulära produktionen av ATP, liknar effekterna av OGD37,38. Denna metod har dock nackdelen att alla dess mekanismer inte är helt klarlagda och det inducerar off-effekter, som introducerar variabler som utgör ett orealistiskt ischemisk stroke scenario.
Sammanfattningsvis är metoden OGD en isolerad cellsystem som tillåter oss att direkt testa effekterna av olika astrocytic drog mål i vitro som ytterligare kunna bidra till neuroprotektion. Det ger också ett verktyg för att studera grundläggande Astrocyten biologi. Denna modell kan skapa en stark bas av bevis för att motivera experimentella betingelser för utveckling av läkemedel med hjälp av en in-vivo -modell av stroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Paola López Pieraldi för tekniskt bistånd. Berits är tacksamma för bidrag 8G12MD007600 och U54-NS083924 som stöds denna publikation. Vi tackar NIH-NIMHD-G12-MD007583 stipendium för anläggningen stödja. D.E.R.A. är tacksam för den gemenskap som tillhandahålls av NIHNIGMS-R25GM110513. Vi är tacksamma för användning av det gemensamma Instrumentation-området och hjälp av Dr Priscila Sanabria för användning av optisk Imaging anläggningen av RCMI program av bevilja G12MD007583. Dessutom vill vi tacka Jose Padilla för hans enastående roll i filma och redigera visual protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments for Surgery - Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation - step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture - step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation - step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence - step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody. |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody. |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining. |
| Confocal microscope | Olympus |
References
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
