Aqui, apresentamos um protocolo para isolamento de tecido gonadal dos peixes-zebra larval, o que irá facilitar as investigações de diferenciação sexual peixe-zebra e manutenção.
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Artigo de método
Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora peixe-zebra selvagem possuem um / ZW sistema de determinação do sexo ZZ, peixe-zebra domesticados perderam do cromossoma sexual. Eles utilizam um sistema de determinação do sexo poligénica, onde vários genes distribuídos ao longo do genoma determinar colectivamente as identidades do sexo de cada peixe. Atualmente, os genes envolvidos na regulação do desenvolvimento das gônadas e como eles funcionam ainda imperceptíveis. Normalmente, o isolamento de tecido gonadal é o primeiro passo para examinar os processos de desenvolvimento sexuais. Aqui, nós apresentamos um processo para isolar tecido gonadal de 17 dpf (dias após a fertilização) e 25 dpf larvas de peixe-zebra. O tecido gonadal isolado pode ser posteriormente examinada por morfologia e a expressão do gene de perfis.
Introdução
O principal determinante do sexo feminino em selvagem cromossoma peixe-zebra 4 for perdido ou modificado no peixe-zebra domesticado (por exemplo estirpes de laboratório comuns) 1. Em vez disso, eles têm um sistema de determinação do sexo poligénica acompanhados por factores ambientais tais como a temperatura, a hipoxia, a disponibilidade de alimentos e densidade populacional. As modalidades específicas do desenvolvimento sexual peixe-zebra não são totalmente compreendidos. As questões fundamentais, tais como quando a determinação do sexo do peixe-zebra ocorre, o que o sinal de determinação do sexo primário (s) é / são, e que os genes ....
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Protocolo
experiências peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Fudan. Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com os procedimentos padrão 20.
1. Preparações
- Cultivar a 17 dpf e 25 dpf peixe-zebra larval
- Transferência 2 do sexo masculino e 2 do peixe-zebra adultos do sexo feminino (saudável, 3 a 6 meses de idade, a estirpe de laboratório AB) para um tanque de passagem no final da tarde do dia antes do cruzamento. Separar os machos e fêmeas com uma barreira. Na manhã seguinte, atualizar a água do tanque e remova a barreira para permitir-lhes para ac....
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Resultados
Dissecções das gónadas foram realizadas na AB strain peixe-zebra larval. A Figura 1 mostra tecido gonadal típico de peixe-zebra de larvas no 17 dpf e 25 dpf. Em primeiro lugar, a pele e os músculos de um lado do abdômen é cortado para expor os órgãos internos. Depois de retirar a massa dos órgãos internos, a bexiga natatória, juntamente com a gônada permanecer no tronco. O gonadal foi ligado ao lado ventral da bexiga natatória (seta na F.......
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Discussão
O peixe-zebra tornou-se um modelo poderoso e é amplamente utilizado no desenvolvimento e investigação relacionada com a doença. Os métodos para o isolamento de órgãos no peixe-zebra adulto, tais como tumores do cérebro, coração, gônadas e rim, foram bem documentados 23, 24, 25. Devido ao pequeno tamanho e remodelação dinâmica dos tecidos gonadais no peixe-zebra larval, o isolamento de tecido gonadal é uma tarefa difícil. Estudo.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos C Zhang para o cuidado de peixe. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (31171074, 31371099 e 31571067 para GP) e pelo Projeto Talentos Pujiang (09PJ1401900 para GP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de células 100 mm | Corning | 430167 | Para incubação de embriões |
| 20x EM | Para 1 L necessário: adicionar 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl e 2,9 g de CaCl· 2H2O; em seguida, adicione 0,41 g de KH2PO4, 0,412 g de Na2HPO4 anidro e 4,9 g de MgSO4· 7H2O. | ||
| 1x EM | Diluir 20x EM em água destilada | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | Para preparar as placas de ágar 2% |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Para isolamento de RNA |
| Vidro do medidor | Shen Bo | 250 ml | Para preparar as placas de ágar 2% |
| Forno de microondas | Midea | M1-211A | Para aquecer o ágar |
| Pinça DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | para dissecação |
| Estereomicroscópio | Motic | SMZ168 | Para dissecação |
| Equipamento de água pura | Millipore | ||
| Ringer' s Para | 1 L necessário: Adicionar 6,78 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 0,26 g de CaCl2 e 1,19 g de Hepes; em seguida, encher até 1 L; Ajuste o pH para 7,2. Esterilizar por filtração e manter em um recipiente de policarbonato transparente autoclavado. | ||
| Pipeta de transferência | Samco | 202, 204 | |
| Banho de metal | Microscópio QiLinbeier | Modelo GL-150 | |
| Leica | M205 FA | Para Centrífuga Fotomicrográfica | |
| Eppendorf | 5417R | ||
| Kit de Isolamento de RNA em Micro Escala | Ambion | AM1931 | Para isolamento de RNA de tecidos gonadares |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | Para digestão de DNA na solução de RNA |
| RevertAid Kit de Síntese de cDNA de primeira fita | Thermo Scientific | #K1631 | Para síntese de cDNA de primeira fita |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | Para digerir o RNA residual na solução de cDNA. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | Este produto é um master mix 2x baseado em Taq DNA polimerase para PCR em tempo real e aplicável para ensaio de intercalação com SYBR Green I. |
| Espectrofotômetro | Ne Drop | OD-2000+ | Medindo a concentração do RNA total |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Perfil | de expressão gênica de Hamburgo |
Referências
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreeniva....
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Reimpressões e permissões
