هنا، نقدم بروتوكول لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات، التي من شأنها تسهيل التحقيقات في التفرقة بين جنس الزرد والصيانة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وعلى الرغم من الزرد البرية امتلاك / ZW نظام تحديد الجنس ZZ، فقد الزرد المستأنسة كروموسوم الجنس. وهي تستخدم نظام تحديد الجنس عديدة الجينات، حيث وزعت عدة جينات في جميع أنحاء الجينوم تحدد بشكل جماعي هويات جنس الأسماك الفردية. حاليا، فإن الجينات المسؤولة عن تنظيم تطوير الغدد التناسلية وكيفية عملها يبقى بعيد المنال. عادة، عزل الأنسجة الغدد التناسلية هي الخطوة الأولى لدراسة العمليات التنموية الجنس. هنا، نقدم إجراء لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من 17 DPF (أيام آخر الإخصاب) و 25 يرقات DPF الزرد. الأنسجة الغدد التناسلية معزولة ويمكن الاطلاع في وقت لاحق من قبل التشكل والتعبير الجيني التنميط.
المقدمة
يتم فقدان المحدد الإناث رئيسيا في كروموسوم الزرد البرية 4 أو تعديلها في الزرد المستأنسة (أي سلالات مختبر المشتركة) 1. بدلا من ذلك، لديهم نظام تحديد الجنس عديدة الجينات يرافقه العوامل البيئية مثل درجة الحرارة ونقص الأكسجين، وتوافر الغذاء والكثافة السكانية. ليست مفهومة تماما آليات تفصيلية للتنمية الجنس الزرد. أسئلة أساسية مثل عندما يحدث تحديد الجنس الزرد، ما إشارة تحديد الجنس الابتدائية (ق) هو / هي، والجينات التي تنظم الخطوة الأولى من التحول الغدد التناسلية لا يزال يتعين الإجابة 2 و 3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على التجارب الزرد من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة فودان. وأثيرت الزرد ولدت وفقا للاجراءات المتبعة 20.
1. الاستعدادات
- زراعة 17 DPF و 25 DPF الزرد اليرقات
- نقل 2 ذكور و 2 إناث الزرد الكبار (صحية، 3-6 أشهر من العمر، والمختبرات أب سترين) إلى خزان المعبر في وقت متأخر بعد الظهر قبل يوم العبور. فصل الذكور والإناث مع الجدار. في صباح اليوم ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إجراء تشريح الغدد التناسلية على أب سترين الزرد اليرقات. ويبين الشكل 1 أنسجة الغدد التناسلية نموذجية من الزرد اليرقات في 17 DPF و 25 DPF. أولا، يتم قطع الجلد والعضلات من جانب واحد من البطن لكشف الأعضاء الداخلية. بعد إزالة كتلة من الأعضاء الداخلية، والمثانة السباحة جنبا إلى جنب مع الغدد التناسلية تبقى في الجذع. كان يعلق على الغدد التناسلية إلى الجانب البطني من المثانة السباحة (السهم في الشكل
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أصبح الزرد نموذج قوي ويستخدم على نطاق واسع في مجال التنمية والبحوث المتعلقة بالمرض. وقد الطرق لعزل الأجهزة في الزرد الكبار مثل المخ والقلب والغدد التناسلية، والكلى، وموثقة جيدا 23 و 24 و 25. نظرا لصغر حجم وإعادة الديناميكية للأنسجة الغدد التناسلية في الزرد اليرقات، والعزلة من أنسجة الغدد التناسلية هي مهمة صعبة. الدراسات السابقة استخدمت كلها تشريح الأنسجة الجذع أو الأوعية المعدلة وراثيا: ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
نشكر C تشانغ لرعاية الأسماك. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31171074، 31371099 و31571067 لGP) ومشروع المواهب بوجيانج (09PJ1401900 لGP).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طبق زراعة الخلايا 100 مم | 430167 كورنينج | لحضانة الأجنة | |
| 20x EM | للحصول على 1 لتر مطلوب: أضف 17.5 جم كلوريد الصوديوم و 0.75 جم كلوريد كلوريد و 2.9 جم كلوريد الكالسيوم & # 183 ؛ 2ح2O; ثم أضف 0.41 جم KH2< / sub>PO4 ، 0.412 جم Na2< / sub>HPO4 اللامائي و 4.9 جم MgSO4< / sub>&# 183 ؛ 7حاء2O. | ||
| 1x EM | مخفف 20x EM في الماء المقطر | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | لتحضير ألواح أجار 2٪ |
| كاشف Trizol | Invitrogen | 15596-026 | لعزل الحمض النووي الريبي |
| عداد الزجاج | شين بو | 250 مل | لتحضير ألواح أجار 2٪ |
| فرن ميكروويف | ميديا | M1-211A | لتسخين AGAR |
| ملاقط DUMONT # 5INOX | أداة الدقة العالمية | 500341 | لتشريح |
| المجهر المجسم | Motic | SMZ168 | لتشريح |
| معدات المياه النقية | Millipore | ||
| Ringer ' محلول | s للحصول على 1 لتر مطلوبة: أضف 6.78 جم كلوريد الصوديوم ، 0.22 جم كلوريد كلوريد ، 0.26 جم كلوريد المكالس < > 2 < / فرعي > و 1.19 جم هيبيس ؛ ثم املأ إلى 1 لتر ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2. تعقيم عن طريق الترشيح واحتفظ بها في حاوية من البولي كربونات شفافة معقمة. | ||
| نقل الماصة | Samco | 202 ، 204 | |
| حمام معدني | QiLinbeier | نموذج GL-150 | |
| مجهر | Leica ؛ | M205 FA | |
| لجهاز الطرد المركزي | Eppendorf | 5417R | |
| طقم عزل الحمض النووي الريبي ذو المقياس | الصغير Ambion | AM1931 | لعزل الحمض النووي الريبي من أنسجة الغدد التناسلية |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | لهضم الحمض النووي في محلول الحمض النووي الريبي |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis | Kit Thermo Scientific | #K1631 | لتخليق الحمض النووي (كدنا) الأول |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | لهضم الحمض النووي الريبي المتبقي في محلول (كدنا |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | هذا المنتج عبارة عن مزيج رئيسي 2x قائم على البوليميراز DNA Taq ل PCR في الوقت الفعلي و قابل للتطبيق على فحص الإقحام باستخدام SYBR Green I. |
| مقياس الطيف | Ne Drop | OD-2000 + | قياس تركيز إجمالي الحمض النووي الريبي |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 | توصيف التعبير الجيني |
المراجع
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreeniva....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
