Nous présentons ici un protocole pour isoler gonades des larves de poisson zèbre, ce qui facilitera les enquêtes de la différenciation sexuelle et l'entretien du poisson zèbre.
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Article de méthode
Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Bien que le poisson zèbre sauvage possède un ZZ / ZW système de détermination du sexe, ont perdu domestiqué zebrafish le chromosome sexuel. Ils utilisent un système de détermination du sexe polygénique, où plusieurs gènes répartis dans le génome déterminent collectivement l'identité sexuelle des individus. À l'heure actuelle, les gènes impliqués dans la régulation du développement des gonades et comment ils fonctionnent demeurent insaisissables. Normalement, l'isolement gonades est la première étape pour examiner les processus de développement sexuels. Nous présentons ici une procédure pour isoler gonades de 17 dpf (jours de la fécondation) et 25 dpf larves de poisson zèbre. Le tissu gonadique isolé peut ensuite être examiné par le profilage de la morphologie et de l'expression génique.
Introduction
Le principal déterminant du sexe féminin dans le chromosome 4 est sauvage zebrafish perdu ou modifié dans le poisson zèbre domestique (c. -à- souches de laboratoire communes) 1. , Ils ont plutôt un système de détermination du sexe polygénique accompagnée par des facteurs environnementaux tels que la température, l'hypoxie, la disponibilité alimentaire et de la densité de la population. ne sont pas pleinement compris les mécanismes détaillés de développement sexuel poisson zèbre. Des questions fondamentales telles que lors de la détermination du sexe se produit, ce poisson zèbre le signal primaire de détermination du sexe (s) est /....
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Protocole
des expériences ont été approuvées par le poisson-zèbre le soin des animaux Université Fudan Comité institutionnel. Zebrafish ont été soulevées et élevés selon des procédures standard 20.
1. Préparation
- Cultiver 17 dpf et 25 dpf zebrafish larvaire
- Transfert 2 hommes et 2 femmes adultes poisson zèbre (santé, 3 à 6 mois, la souche de laboratoire AB) à un réservoir de passage dans l'après-midi avant le jour de passage. Séparer les hommes et les femmes avec une barrière. Le lendemain matin, rafraîchir l'eau du réservoir et enlever la barrière pour leur permettre de s'accoupler. Recueilli....
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Résultats
Dissections des gonades ont été effectuées sur la souche AB zebrafish des larves. La figure 1 représente un tissu gonadique typique des larves de poisson zèbre à 17 dpf et 25 dpf. Tout d'abord, la peau et les muscles d'un côté de l'abdomen est coupé pour exposer les organes internes. Après avoir enlevé la masse des organes internes, la vessie natatoire en même temps que la gonade restent dans le coffre. Le gonades a été attaché à la face ventrale.......
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Discussion
Le poisson zèbre est devenu un modèle puissant et est largement utilisé dans le développement et la recherche liée à la maladie. Les méthodes d'isolement des organes chez le poisson zèbre adulte tels que le cerveau, le cœur, gonades, et les reins, ont été bien documentés 23, 24, 25. En raison de la petite taille et le remodelage dynamique des tissus gonadiques du poisson zèbre larvaire, l'isolement des gonades est une t.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous remercions C Zhang pour les soins de poissons. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31171074, 31371099 et 31571067 GP) et par le projet Talent Pujiang (09PJ1401900 GP).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Boîte de culture cellulaire 100 mm | Corning | 430167 | Pour l’incubation d’embryons |
| 20x EM | Pour 1 L nécessaire : ajouter 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl et 2,9 g de CaCl· ; 2H2O ; ajouter ensuite 0,41 g de KH2PO4, 0,412 g de Na2HPO4 anhydre et 4,9 g de MgSO4· ; 7H2O. | ||
| 1x EM | Diluer 20x EM dans de l’eau distillée | ||
| AGAROSE G-10 | Gène | 121985 | Pour préparer les plaques de gélose à 2 |
| Trizol Réactif | Invitrogen | 15596-026 | Pour l’isolement de l’ARN |
| Mètre en verre | Shen Bo | 250 ml | Pour préparer les plaques de gélose à 2 % |
| Four à micro-ondes | Midea | M1-211A | Pour chauffer l’AGAR |
| Pince à épiler DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | Pour la dissection |
| Stéréomicroscope | Motic | SMZ168 | Pour la dissection |
| Équipement à eau pure | Millipore | ||
| Ringer' | Pour 1 L nécessaire : Ajouter 6,78 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 0,26 g de CaCl2 et 1,19 g de Hepes, puis remplir à 1 L ; Ajustez le pH à 7,2. Stériliser par filtration et conserver dans un récipient en polycarbonate transparent autoclave. | ||
| Pipette de transfert | Samco | 202, 204 | |
| Bain de métal | QiLinbeier | Modèle GL-150 | |
| Microscope | Leica ; | M205 FA | Pour photomicrographie |
| Centrifugeuse Eppendorf | 5417R | ||
| Micro Scale Kit d’isolement d’ARN | Ambion | AM1931 | Pour l’isolement d’ARN à partir de tissus gonades |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | Pour la digestion de l’ADN dans la solution d’ARN |
| RevertAid First Strand cRNA | Synthesis Kit Thermo Scientific | #K1631 | Pour la synthèse d’ADNc premier brin |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | Pour digérer l’ARN résiduel dans la solution d’ADNc. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | Ce produit est un master mix 2x basé sur l’ADN polymérase Taq pour la PCR en temps réel et applicable pour le test d’intercalation avec SYBR Green I. |
| Spectrophotomètre | Ne Drop | OD-2000+ | Mesure de la concentration de l’ARN total |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | Profil d’expression génique |
Références
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreeniva....
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Réimpressions et autorisations
