Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

Summary

Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien, wobei nur Zellen verwendet werden. Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten werden zuerst isoliert, gezählt und bei gewünschten Zellverhältnissen gemischt. Sie werden in einzelnen Brunnen in ultra-niedrigen Befestigung 96-Well-Platten co-kultiviert. Innerhalb von 3 Tagen, schlagen Sphärenoiden bilden. Diese Sphäroide werden dann durch eine Düse mit Vakuumsaugung aufgenommen und auf einer Nadelanordnung unter Verwendung eines 3D-Bioprinter aufgebaut. Die Sphäroide dürfen dann auf dem Nadel-Array verschmelzen. Drei Tage nach dem 3D-Bioprinting werden die Sphäroide als intaktes Patch entfernt, das schon spontan schlägt. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Introduction

Es gibt viele verschiedene Methoden der 3D-Bioprinting ^{1 , 2 , 3} . Das 3D-Bioprinting wird häufig durch die Drucktechnologie ¹ klassifiziert, mit Beispielen wie Inkjet-Bioprinting, Microextrusion Bioprinting, laserunterstütztes Bioprinting, einer Kombination von Methoden oder neueren Ansätzen. 3D-Bioprinting kann auch in Gerüst- oder Gerüst-abhängige Methoden eingeteilt werden ⁴ . Die meisten Methoden des 3D-Bioprintings sind gerüstabhängig, wo Biomaterialien erforderlich sind, zB Bioinks ⁵ oder....

Protocol

1. Vorbereitung der Kardiomyozyten

1. Generieren und kultivieren menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) auf 6-Well-Platten, die mit der Basalmembranmatrix beschichtet sind, wie beschrieben ¹⁰ .
2. Unterscheiden Sie hiPSCs in hiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden ^{11 , 12} .
3. Am Tag 19 nach der Differenzierung, isolieren Sie die Kardiomyozyten mit 2 ml Trypsin / EDTA 0,05% in jeder Vertiefung für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Überwachen Sie die Kardiomyozyten unter einem optischen Mikr....

Results

Am Ende von Schritt 4.4 (Co-Kultur) sollten die Zellen in jeder Vertiefung am Boden der Ultra-Low-Attachment-96-Well-U-Bodenplatten aggregieren, um Sphäroide durch Schwerkraft zu bilden. Diese Sphäroide enthalten hiPSC-CM, HCFs und HUVECs und können unter Lichtmikroskopie visuell untersucht werden, wo sie durch zweidimensionale Projektion kreisförmig erscheinen sollen ( Abbildung 1 ). Am Ende von Schritt 6.3 sollte das 3D-Bioprints-Herz-Patch Gewebe-Hohlräum.......

Discussion

Es ist wichtig, schlagende, funktionelle Sphäroide für das 3D-Bioprinting zu verwenden. Wenn die Sphäroide nicht schlagen, führt ihre weitere Verwendung unweigerlich zu einem nicht funktionierenden 3D-Bioprint-Pflaster.

Ein Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, den Zellinhalt des Pflasters zu manipulieren, indem die Gesamtzahl der Zellen und der Prozentsatz der Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten in den Sphäroiden variiert werden. Auf diese Weise können viele verschiedene Ar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Invitrogen
Trypsin/EDTA 0,05 %	Thermo Fisher	15400054
definierter Trypsin-Inhibitor 0,0125 %	Thermo	Fisher R007100
RPMI Zellmedien	Invitrogen	11875-093	RPMI, ergänzt mit B27, stellt HIPSC-CM-Kulturmedien
dar B-27 Nahrungsergänzungsmittel	Thermo Fisher	17504044	RPMI, ergänzt mit B27, stellt HIPSC-CM dar Nährmedien
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Humane kardiale Fibroblasten (adulter ventrikulärer Typ)	Sciencell	6310
Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen	Lonza	CC-2935
PrimeSurface 96-Well-U-Bodenplatten mit extrem geringer Bindung	Akita Sumitomo Bakelit Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D-Drucker	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypanblau-Lösung, 0,4	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antikörper	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antikörper	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Eindeckmittel mit DAPI	Thermo Fisher	P36935