Wir stellen hier ein Zellkulturverfahren für die auf Basis von kombinierten ektopische Expression von microRNA-200 Familienmitgliedern und grainyhead-like 2 (GRHL2) mesenchymale-epithelialen Transitionen (MET) in Sarkomzellen zu induzieren. Dieses Verfahren ist für eine besseren geeignet, die biologische Wirkung der phänotypischen Plastizität auf Krebs Aggressivität und Behandlungen zu verstehen.
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Methodenartikel
Die Induktion von mesenchymalen-Epithelial Transitions in Sarcomzellen
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Phänotypische Plastizität bezieht sich auf ein Phänomen, bei dem Zellen, die transient Züge eines anderen Abstammungslinie gewinnen. Während Karzinom Progression treibt phänotypische Plastizität Invasion, Verbreitung und Metastasierung. Tatsächlich, während die meisten Studien der phänotypischen Plastizität im Zusammenhang mit der epithelialen abgeleiteten Karzinome waren, stellt sich Sarkome aus, die mesenchymalen Ursprungs sind, auch phänotypische Plastizität aufweisen, mit einer Teilmenge von Sarkomen ein Phänomen unterziehen, die eine mesenchymal- ähnelt epithelial Übergang (MET). Hier entwickeln wir ein Verfahren mit der ich-200-Familie und grainyhead-like 2 (GRHL2) diese MET-Phänomene wie in Sarkom Patienten beobachtet samples.we nachzuahmen sequentiell GRHL2 exprimieren und die ich-200-Familie unter Verwendung von Zell-Transduktion und Transfektion bzw. zu verstehen, um besser auf die molekularen Grundlagen dieser phänotypischen Übergänge in Sarcomzellen. Sarcoma-Zellen, ich-200s und GRHL2 demonstrierten verbesserten epithelialen characteristICs in der Zellmorphologie und den Umbau von epithelialen und mesenchymalen Biomarker. Zukünftige Studien mit Hilfe dieser Methoden können besser genutzt werden, um die phänotypischen Folgen der MET-ähnlicher Prozesse auf Sarkom-Zellen zu verstehen, wie Migration, Invasion, metastasierendem Neigung und Therapieresistenz.
Einleitung
Phänotypische Plastizität bezieht sich auf einen reversible Übergang zwischen zellulären Phänotypen, und wird allgemein in zwei Typen unterteilt, epithelial-to-mesenchymalen (EMT) Transitionen und mesenchymalen-to-epithelialen Transitionen (MET). Diese phänotypische Plastizität spielt eine wichtige Rolle bei der normalen Prozessen mehrzelliger Organismen, wie Entwicklung und Wundheilung 1; jedoch können dieselben Wege und Genexpressionsprogramme auch zu Krankheiten führen, wie Fibrose ( beschrieben in 2, 3, 4) und Karzinom - Metastasen (rezensiert in ....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten DMEM für Zellkultur durch Zugabe von 50 ml fötalen Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin-Streptomycin (5000 U / ml) zu 500 ml DMEM. Dieses Medium kann für bis zu sechs Monate bei 4 ° C gelagert werden.
- Resuspendieren lyophilisierte Primer in Nuklease-freies Wasser bis zu einer Endkonzentration von 10 uM. Store resuspendierten Primer bei -20 ° C.
- Bereiten Radioimmunpräzipitation-Assay (RIPA) -Puffer (150 mM NaCl, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Ergänzung mit Protease-Inhibitor-Cocktail vor dem Gebrauch und halte Puffer auf Eis, wenn im Einsatz. Lagerung bei 4 ° C.
- ....
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Ergebnisse
Schema für MET Induktion in Sarkomzellen
Eine allgemeine Zeitleiste für die Induktion von MET artigen Veränderungen in Sarkomzellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll beginnt mit GRHL2 (Abbildung 1A), gefolgt von Transfektion der miR-200 - Familie (Abbildung 1B) Umwandlungs. GRHL2 oder ich-200 Familienmitglieder waren nicht in der Lage das Auftreten von RD-Zellen zu be.......
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Diskussion
Sarkome sind selten, aber sehr aggressive Krebsarten von einer mesenchymalen Abstammungslinie. Trotz ihrer mesenchymalen Abstammungslinie, wird eine Teilmenge von Sarkomen einen phänotypischen Übergang zu einem epithelial-ähnlichen Zustand zu unterziehen. Der MET-like - Schalter hat prognostische Relevanz, da Patienten mit Epithel-ähnlichen Tumoren sind weniger aggressiv 24. Trotz ihrer klinischen Relevanz, gibt es nur wenige Studien, die molekularen Mechanismen der Bewältigung dieser phänotypisc.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
JA erkennt an Unterstützung von dem Duke Cancer Institute, The Duke University Genitourinary Oncology Laboratory, und die Duke University Abteilung für Orthopädie. HL wurde von der National Science Foundation (NSF) Zentrum für Theoretische Biologische Physik (NSF PHY-1.427.654) und NSF DMS-1361411 und als CPRIT (Cancer Prevention and Research Institute of Texas) Scholar in der Krebsforschung des Staates Texas unterstützt an der Rice University. KEW wurde vom NIH F32 CA192630 MKJ unterstützt und HL profitierte von nützlichen Gesprächen mit Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta und Donald S. Coffey.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Countess automatisierter Zähler | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Countess Zellzählkammer Objektträger | Invitrogen | C10283 | |
| SimpliAmp Thermocycler | Thermo Fisher | A24811 | |
| Odyssey Fc | LI-COR Inc | ||
| ViiA7 Real Time PCR System | Thermo Fisher | 4453536 | |
| PCR Mikroplatte | Corning | 321-29-051 | |
| KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit | KAPA Biosystems | KK4602 | |
| Starting Block (PBS) Blockierungspuffer | Thermo Fisher | 37538 | BSA-basierter Blockierungspuffer |
| Agarose General Purpose LE | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 10x Tris/Glycin/SDS-Puffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0732 | Laufpuffer |
| 10x Tris/Glycin-Puffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0734 | Transferpuffer |
| RIPA-Puffer | Sigma Life Sciences | SLBG8489 | |
| Amersham Protran 0,45 μ m Nitrocellulose | GE Healthcare Lifesciences | 10600012 | |
| Quick-RNA MiniPrep Kit | Genesee Scientific | 11-358 | |
| Laemmli Probenpuffer (4X) | Bio-Rad Laboratories Inc | 1610747 | |
| Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1703930 | |
| Mini-Protean Tetra Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1658005EDU | |
| DPBS | Life technologies | 14190-144 | |
| 0,05 % Trypsin-EDTA | Life technologies | 11995-065 | |
| DMEM | Life technologies | 11995-065 | |
| Lipofectamine RNAi Max | Thermo Fisher | 13778150 | |
| Lipofectamine 2000 Ragents | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Penicillin Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| miRVana miRNA imitiert die Negativkontrolle #1 | Thermo Fisher | 4464058 | neg miRNA |
| has-miR-200 mirVana miRNA imitiert | Thermo Fisher | 4464066 | miR200A |
| has-miR-200 mirVana miRNA imitiert | Thermo Fisher | 4404066 | miR200B |
| has-miR-200 mirVana miRNA imitiert | Thermo Fisher 4404066 | miR200C | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11088-021 | serumfreie Medien |
| Anti-Ecadherin-Antikörper | BD Bioscience | 610182 | |
| Anti-Beta-Aktin | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 | |
| Anti-EpCam | Ab Serotec | MCA18706 | |
| Anti-ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| IRDye 800W | LI-COR Inc | 925-32210 | |
| IRDye 680 | LI-COR Inc | 926-32223 | |
| Anti-Maus AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | A211241 | |
| Anti-Kaninchen AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | ab150075 | |
| Halt Protease und Phosphatesse Inhibitor | Thermo Fisher | 1861281 | |
| Precision Plus Protein Dual Color | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0374 | |
| Partec CellTrics | Sysmex | 04-004-2326 | 30 μ m Filter für Durchfluss |
| GAPDH-F | IDT | AGCCACATCGCTCAGACAC | |
| GAPDH-R | IDT | GCCCAATACGACCAAATCC | |
| Ecadherin-F | IDT | TGGAGGAATTCTTGCTTTGC | |
| Ecadherin-R | IDT | CGCTCTCCTCCGAAGAAAC | |
| ZEB1-F | IDT | GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC | |
| ZEB1-R | IDT | CGATTACACCCAGACTGC | |
| NOTCH-F | IDT | GGCAATCCGAGGACTATGAG | |
| NOTCH-R | IDT | CTCAGAACGCACTCGTTGAT | |
| NITRO BLUE TETRAZOLIUM  | Sigma | N5514 | |
| Hexadimethrinbromid | Sigma | H9268 | Polybren |
| 3 mL Spritze | BD Bioscience | 309657 | |
| Steriler Spritzenvorsatzfilter | VWR | 28145-505 | |
| 5 ml Polypropylen Rundbodenröhrchen | 352063 | Durchflusszytometrieröhrchen | |
| cDNA Reverse Transkriptionskit mit hoher Kapazität | Thermo Fisher | 4368814 | reverse Transkriptionskit |
| 4% Paraformaldyhyd | Santa Cruz Biotechnology | sc-281612 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma | A7906 |
Referenzen
- Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
- Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu
